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HK1004861B - Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle - Google Patents

Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle Download PDF

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Publication number
HK1004861B
HK1004861B HK98102338.0A HK98102338A HK1004861B HK 1004861 B HK1004861 B HK 1004861B HK 98102338 A HK98102338 A HK 98102338A HK 1004861 B HK1004861 B HK 1004861B
Authority
HK
Hong Kong
Prior art keywords
seconds
temperature
nucleic acid
primers
carried out
Prior art date
Application number
HK98102338.0A
Other languages
German (de)
English (en)
Chinese (zh)
Other versions
HK1004861A1 (en
Inventor
B. Findlay John
W. Backus John
H. Donish William
W. Sutherland John
Original Assignee
庄臣临床诊断有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 庄臣临床诊断有限公司 filed Critical 庄臣临床诊断有限公司
Publication of HK1004861A1 publication Critical patent/HK1004861A1/en
Publication of HK1004861B publication Critical patent/HK1004861B/en

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Claims (13)

  1. Procédé pour amplifier un acide nucléique, qui comprend les étapes consistant :
    A. à chauffer un acide nucléique double brin ciblé à une première température de 85 à 100°C pendant 1 à 40 secondes pour dénaturer les brins de l'acide nucléique,
    B. à refroidir les brins dénaturés à une deuxième température pendant un laps de temps de 5 à 20 secondes,
    C. en présence
    1) d'une ADN-polymérase thermostable présente en une quantité d'au moins 5 unités/100 µl de solution,
    2) de désoxyribonucléoside-5'-triphosphates présents en des quantités permettant la polymérisation de l'ADN, et
    3) d'un ensemble d'amorces spécifiques des brins dénaturés, les amorces étant présentes en des quantités permettant la polymérisation de l'ADN,
       à former des produits hybridés d'allongement des amorces et des brins dénaturés, par incubation des brins dénaturés à ladite deuxième température, pendant 1 à 80 secondes,    ladite deuxième température étant comprise dans l'intervalle de (Tm-15)°C à (Tm+5)°C, où Tm est la température de fusion des brins dénaturés et des amorces, la différente (ΔT) entre la première et la deuxième températures étant de 5 à 45°C,
    D. à chauffer les produits hybridés de l'allongement d'amorce à la première température pendant un laps de temps de 5 à 20 secondes, et à conserver les produits à cette température pendant 1 à 40 secondes, et
    E. à répéter en cycle séquentiel les étapes B à D au moins une fois, où chaque cycle des étapes B à D est mis en oeuvre en moins de 120 secondes,    à la condition que, quand la concentration de chacune des amorces est inférieure à environ 0,075 µmolaire, la durée de chaque cycle des étapes B à D soit d'au moins 60 secondes.
  2. Procédé selon la revendication 1, qui comprend en outre l'étape additionnelle consistant :    F. à détecter au moins un brin dénaturé de l'acide nucléique amplifié.
  3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'une des amorces est biotinylée, et la détection de l'étape F est mise en oeuvre par capture du brin biotinylé amplifié obtenu, par utilisation d'avidine, qui est fixée à un substrat solide, et détection du brin capturé, directement ou indirectement à l'aide d'une sonde marquée.
  4. Procédé selon la revendication 2, dans lequel l'une des amorces est biotinylée, et la détection de l'étape F est réalisée par capture du brin biotinylé amplifié obtenu, par utilisation d'un oligonucléotide insolubilisé qui lui est complémentaire, et complexation du brin biotinylé à l'aide d'avidine portant un marquage détectable.
  5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, pour l'amplification d'un ADN viral ou bactérien.
  6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel l'étape de chauffage A est mise en oeuvre à une température de 90 à 98°C pendant 1 à 20 secondes.
  7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel l'étape D est mise en oeuvre à une température de 90 à 98°C, la durée du chauffage à cette température étant de 5 à 10 secondes, et le temps de maintien à la température étant de 1 à 15 secondes.
  8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel ladite deuxième température est de 55 à 70°C, et l'étape C est mise en oeuvre pendant 6 à 55 secondes.
  9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel chaque cycle des étapes B à D est mis en oeuvre en 20 à 90 secondes.
  10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l'ADN-polymérase thermostable est présente à une concentration de 6 à 20 unités/100 µl de solution.
  11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel ΔT est de 15 à 45°C.
  12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel ΔT est de 20 à 35°C.
  13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel la concentration de chaque amorce est de 0,1 à 2 µmolaire.
HK98102338.0A 1991-04-30 1998-03-19 Nucleic acid amplification and detection methods using rapid polymerase chain reaction cycle HK1004861B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69357491A 1991-04-30 1991-04-30
US693574 1991-04-30

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HK1004861A1 HK1004861A1 (en) 1998-12-11
HK1004861B true HK1004861B (en) 2001-10-26

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