HK1062033A1 - Method for labelling and fragmenting dna - Google Patents
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Claims (28)
- Verfahren zur Markierung und Fragmentierung einer einzel- oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA), umfassend:- Fragmentieren der DNA durch Erzeugen mindestens einer abasischen Stelle auf der DNA,- Binden eines Markers an mindestens eines der Fragmente durch ein Markierungsreagens, wobei das Reagens kovalent und größtenteils an mindestens ein Phosphat des Fragments kuppelt, wobei Fragmentierung und Markierung in einem Schritt erfolgen.
- Verfahren zur Bereitstellung von Sonden zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, umfassend die Markierung und Fragmentierung einer einzel- oder doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA), umfassend die folgenden Schritte:- Fragmentieren der DNA durch Erzeugen mindestens einer abasischen Stelle auf der DNA,- Binden eines Markers an mindestens eines der Fragmente durch ein Markierungsreagens, wobei das Reagens kovalent und größtenteils an mindestens ein Phosphat des Fragments kuppelt.
- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung und Markierung in zwei Schritten erfolgen.
- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung und Markierung in einem Schritt erfolgen.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abasische Stelle durch Einwirkung eines wässrigen sauren Mediums erzeugt wird.
- Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der pH des sauren Mediums kleiner als 5, vorzugsweise kleiner als 4 ist.
- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das wässrige saure Medium ein Natriumformiatpuffer mit einem pH von etwa 3 ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA mindestens eine modifizierte Base enthält, die eine abasische Stelle bilden kann.
- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte Base, die eine abasische Stelle bilden kann, aus 8-Brompurinderivaten ausgewählt ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die abasische Stelle durch ein Alkylierungsmittel oder ein Oxidationsmittel erzeugt wird.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens als reaktionsfähige Funktion eine Einheit enthält, die aus den folgenden Verbindungen ausgewählt ist: Diazomethyl; Alkylhalogenid; Nitrosoharnstoff; Spirocyclopropan; Aziridin; Epoxid; Trifluorsulfonaten.
- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens 5-(Brommethyl)fluorescein ist.
- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens aus Verbindungen der Formel (1): worin:• R1 für H oder eine Alkyl-, substituierte Alkyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppe steht und• Z einen nachweisbaren Marker umfasst,ausgewählt ist.
- Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Z Folgendes ist:
- Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens ausgewählt ist aus Verbindungen der Formel (2): worin:• R1 für H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppe steht,• R2 ein nachweisbarer Marker ist,• L ein Bindungsarm ist, der eine gerade Aneinanderreihung von mindestens zwei kovalenten Bindungen enthält, und n gleich 0 oder 1 ist und• Z ausgewählt ist aus: worin:■ R3 und R4 unabhängig voneinander für; H, NO2, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl stehen und■ -Y-X- für -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, CH2S- steht.
- Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungreagens die Formel (3) hat: worin:• R1 für H oder eine Alkyl-, Aryl- oder substituierte Arylgruppe steht,• R2 einen nachweisbaren Marker darstellt,• L ein Bindungsarm ist, der eine gerade Aneinanderreihung von mindestens 2 kovalenten Bindungen enthält, und n eine ganze Zahl gleich 0 oder 1 ist,• R3 und R4 unabhängig voneinander für: H, NO2, Cl, Br, F, I, OR, SR, NR2, R, NHCOR, CONHR, COOR mit R = Alkyl oder Aryl stehen und• -Y-X- für -CONH-, -NHCO-, -CH2O-, CH2S- steht.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass R2 eine fluoreszierende Verbindung oder ein Hapten ist.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsreagens in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel löslich ist.
- Verfahren zum Nachweis einer einzel- oder doppelsträngigen Ziel-Desoxyribonukleinsäure (DNA), umfassend die folgenden Schritte:- Fragmentieren und Markieren der DNAs durch eines der Verfahren der Ansprüche 1 bis 18,- Hybridisieren der markierten Fragmente mit mindestens einer für die Zielnukleinsäure ausreichend spezifischen Nukleinsonde und- Nachweisen des gebildeten Hybrids mithilfe eines Markers.
- Verfahren zum Nachweis einer doppelsträngigen Ziel-Desoxyribonukleinsäure (DNA) nach Anspruch 19, das ferner einen Denaturierungsschritt nach der Fragmentierung und Markierung enthält.
- Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung, Markierung und Denaturierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden.
- Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, umfassend die folgenden Schritte:- enzymatische Amplifizierung der Zielnukleinsäure, um eine Vielzahl an doppelsträngigen DNA-Amplikons zu erzeugen,- Fragmentieren und Markieren der DNA-Amplikons nach einem der Verfahren der Ansprüche 1 bis 18,- Hybridisieren der markierten Fragmente mit mindestens einer für die Zielnukleinsäure ausreichend spezifischen Nukleinsonde und- Nachweisen des gebildeten Hybrids mithilfe eines Markers.
- Verfahren nach Anspruch 22, das ferner einen Denaturierungsschritt nach dem Fragmentierungs- und Markierungsschritt enthält.
- Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung, Markierung und Denaturierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden.
- Verfahren zum Nachweis eines an zuvor bestimmten oder nicht bestimmten Positionen einer Zielnukleinsäure vorliegenden Polymorphismus durch Vorhandensein einer Mehrzahl an Deletionen und/oder Insertionen und/oder Mutationen in der Sequenz der Zielnukleinsäure im Vergleich zu einer so genannten Bezugssequenz, umfassend die folgenden Schritte:• Gewinnen einer Ziel-DNA mit der Gesamtheit des zu untersuchenden Polymorphismus, wobei die DNA gegebenenfalls durch eine enzymatische Amplifikationstechnik erzeugt wird;• Fragmentieren und Markieren der DNA durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18;• Hybridisieren der Fragmente mit einer Mehrzahl als Fangsonden bezeichneter Nukleinsonden, wobei die Mehrzahl Fangsonden an einem festen Träger fixiert ist und die Mehrzahl Fangsonden in ihrer Gesamtheit mindestens den zu untersuchenden Polymorphismus abdeckt;• Nachweisen der zwischen den markierten Fragmenten und mindestens einem Teil der Nukleinsonden gebildeten Hybride mithilfe eines Markers und Rückschließen auf den Polymorphismus der Ziel-DNA.
- Verfahren nach Anspruch 25, das ferner einen Denaturierungsschritt nach dem Fragmentierungs- und Markierungsschritt enthält.
- Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass Fragmentierung, Markierung und Denaturierung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden.
- Verfahren nach einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger mindestens zehn (10), vorteilhafterweise mindestens vierhundert (400), vorzugsweise mindestens tausend (1000), Nukleinsonden mit unterschiedlichen Sequenzen trägt.
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