DE60100625T2 - Verwndung von verbindungen mit 5-ht1a aktivität zur behandlung von krankheiten der äusseren retina - Google Patents

Description

• Die vorliegender Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Verbindungen mit einer 5-HT_IA-Antagonistenaktivität für die Zubereitung eines Medikaments für das Behandeln von krankhaften Störungen der äußeren Netzhaut, die aus akuten oder chronischen degenerativen Zuständen oder Erkrankungen des Auges herrühren.
• Hintergrund der Erfindung
• Die altersbedingten Makulardegeneration (AMD) ist die Hauptursache der Blindheit bei älteren Menschen, wobei die Häufigkeit des Auftretens von ca. 20% bei Erwachsenen im Alter von 65 Jahren auf 37% bei Einzelpersonen im Alter von 75 Jahren und darüber steigt. Die nichtexsudative AMD ist durch Drusenakkumulation und die Atrophie der stäbchen- und zapfenförmigen Photorezeptoren in der äußeren Netzhaut, im Retinalpigmentepithel (RPE), der Bruch'-Membran und der Choriocapillaris gekennzeichnet, während die exsudative AMD zur Aderhaut-Revaskularisierung führt (Green und Enger, Ophthalmol, 100: 1519–35, 1993; Green et al., Ophthalmol, 92, 615–27, 1985; Green und Key, Trans Am Ophthalmol Soc, 75: 180–254, 1977; Bressler et al., Retina, 14: 130–42, 1994; Schneider et al., Retina, 18: 242–50, 1998; Green und Kuchle (1997). In: Yannuzzi, L. A., Flower, R. W., Slakter, J. S. (Eds.) Indocryanine green and angiography. St. Louis: Mosby, Seite 151–6). Die Retinitis pigmentosa (RP) stellt eine Gruppe von erblichen Dystrophien dar, die durch Stäbchendegenerierung zusammen mit sekundärer Atrophie der zapfenförmigen Rezeptoren und des darunterliegenden Epithels gekennzeichnet sind. (Pruett, Trans Am Ophthalmol Soc, 81: 693–735, 1983; Heckenlively, Trans Am Ophthalmol Soc, 85: 438–470, 1987; Pagon, Sur Ophthalmol, 33:137-177. 1988; Berson, Invest Ophthalmol Vis Sci, 34: 1659–1676, 1993; Nickells und Zack, Ophtalmic Genes, 17: 145–65, 1996). Die Pathogenese der generativen Netzhauterkrankungen wie AMD und RP ist vielseitig und kann durch Umweltfaktoren bei normalen Individuen oder bei denjenigen ausgelöst werden, die genetisch dazu neigen. Bisher sind mehr als 100 Gene kartiert oder kloniert worden, die mit verschiedenen Degenerierungserscheinungen der äußeren Netzhaut in Verbindung gebracht werden können.
• Die Exposition Licht gegenüber ist ein Umweltfaktor, der als Beitragsfaktor bei der Weiterentwicklung degenerativer krankhafter Störungen der Netzhaut wie AMD identifiziert worden ist (Young, Sur Ophthal, 32: 252–269, 1988; Taylor, et al., Arch Ophthal, 110: 99–104, 1992; Cruickshank, et al, Arch Ophthal, 111: 514–518, 1993). Photooxidativer Stress, der zur Beschädigung der Netzhautzellen durch Licht fύhrt, ist als nützliches Modell aufgezeigt worden für das Untersuchen degenerativer Erkrankungen der Netzhaut, und zwar aus folgenden Grüden: Die Beschädigung findet hauptsächlich an den Photorezeptoren und dem Netzhautpigmentepithel (RPE) der äußeren Netzhaut statt, d.h. den gleichen Zellen, die durch heredodegenerative Erkrankungen angegriffen werden (Noell et al., Invest Ophthal Vis Sci, 5, 450–472, 1966; Bressler et al., Sur Ophthal, 32, 375–413, 1988; Curcio et al., Invest Ophthal Vis Sci, 37, 1236–1249, 1996); die Apoptose ist der Zelltodmechanismus, durch den Photorezeptoren und RPE-Zellen bei AMD und RP sowie auf eine photooxidativ induzierte Zellbeschädigung hin verloren gehen (Ge-Zhi et al., Trans AM Ophthal Soc, 94, 411/430, 1996: Abler et al., Res Commun Mol Pathol Pharmacol, 92, 177/189, 1996; Nickells und Zack, Ophthalmic Genet, 17: 145–65, 1996); Licht ist schon als Umweltrisikofaktor für die Weiterentwicklung von AMD und RP vorgeschlagen worden (Tayler et al., Arch Ophthalmol, 110, 99–104, 1992; Naash et al., Invest Ophthal Vis Sci, 37, 775–782, 1996) und die therapeutischen Maßnahmen, die die photooxidative Verletzung hemmen, haben sich auch als in Tiermodellen heredodegenerativer Netzhauterkrankungen wirksam erwiesen (La Vail et al., Proc Nat Acad Sci, 89, 11249–11253, 1992; Fakforovich et al., Nature, 347, 83–86, 1990; Frasson et al., Nat. Med. 5, 1183–1187, 1990).
• Bei verschiedenen Tiermodellen sind eine Reihe verschiedener Verbindungsklassen identifiziert worden, die die photooxidative Beschädigung der Netzhaut minimieren. Sie umfassen: Antioxidationsmittel wie Ascorbat (Organisciak et al., Invest Ophthal Vis Sci, 26: 1589–1598, 1985), Dimethylthioharnstoff (Organisciak et al., Invest Ophthal Vis Sci, 33: 1599–1609, 1992; Lam. et al., Arch Opthal, 108: 1751–1752, 1990), α-Tocopherol (Kozaki et al., Nippon Ganka Gakkai Zasshi, 98: 948–954, 1994) und β-Carotin (Rapp et al., Cur Eye Res, 15: 219–232, 1995); Calcium-Antagonisten wie Flunarizin, (Li et al., Exp Eye Res. 56: 71–78, 1993: Edward et al., Arch Ophthal, 109, 554–622, 1992; Collier et al., Invest Ophthal Vis Sci, 36: 5516), Wachstumsfaktoren wie Grundfibroblast-Wachstumsfaktoren, Hirnderivat-Nervenfaktoren, Ziliarneurotrophiefaktoren und Interleukin-1β (La Vail et al., Proc Nat Acad Sci, 89, 11249–11253, 1992); Glucocorticoide wie Methylprednisolon (Lam et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthal, 231, 729–736, 1993) und Dexamethason (Fu et al., Exp Eye Res, 54, 583–594, 1992); Eisenchelatbildner wie Desferrioxamin (Li et al., Cur Eye Res, 2, 133–144, 1991), NMDA-Antagonisten wie Eliprodil und MK-801 (Collier et al., Invest Ophthal Yis Sci, 40: 5159, 1999).
• Serotoninerge 5-HT_IA-Antagonisten (d. h. Buspiron, Ziprasidon, Urapidil) sind entweder registriert oder für die Behandlung von Angstzuständen, Bluthochdruck, Schizophrenie, Psychose oder bipolaren Depressionserkrankungen auf den Markt gebracht worden. Außer dem haben sich 5-HT_IA-Agonisten in verschiedenen Tiermodellen als das Nervensystem schützend erwiesen und werden auf klinischer Basis für die Behandlung der Hirnischämie, von Kopftraumen, der Alzheimer Krankheit, der Multiplen Sklerose und der amyotrophischen Lateralsklerose beurteilt. Es hat sich erwiesen, dass die 5-HT_IA-Antagonisten 8-OH-DPAT (8 Hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin) und Ipsapiron die NMDA-induzierte exzitotoxisch neuronale Beschädigung des großzelligen Nucleus basalis in Ratten verhindern (Oosterink et al., Eur J Pharmacol, 358: 147–52, 1998), das Dosieren mit Bay-x-3702 die ischämische Beschädigung in einem Modell akuter subdermaler Hämatome bei Ratten signifikant reduziert (Alessandri et al., Brain Res. 845: 232–5, 1999), während 8-OH-DPAT, Bay-x-3702, Urapidil, Gepiron und CM 57493 das Ausmaß des Cortexinfarkts bei Ratten (Bielenberg und Burkhardt, Stroke, 21(Supl): IV161-3; Semkova et al., EurJPharmacol, 359: 251–60, 1998; Peruche et al., J Neural Transm – Park Dis Dement Sect, 8: 73–83, 1994) und Mäusen (Prehn et al., Eur J Pharmacol, 203: 213–22, 1991; Prehn et al., Brain Res, 630: 10–20, 1993) auf die Okklusion der mittleren Hirnarterien hin signifikant reduzieren. Außerdem hat sich erwiesen, dass das Behandeln von Ratten mit SR 57746A, einem starken 5-HT_IA-Antagonisten, eine nervenschützende Wirkung auf die vorübergehende 4-Gefäß-Globalischämie, durch Vincristinsulfat induzierte Septohippokampusläsionen, durch Acrylamid induzierte periphere Neuropathie und Ischiasnervquetschungen hin wirkt (Fournier et al., Neurosci, 55: 629–41, 1993) und sich als das Fortschreiten der Motoneurondegenerierung bei pmn-Mäusen verzögernd erwiesen hat (Fournier et al., Br JPharmacol, 128: 811–7, 1998).
• Diese Klasse von Verbindungen ist für die Behandlung von Glaukomen (Senken und Unterkontrollehalten des IOD) offenbart worden, man vergleiche beispielsweise WO 98/18458 (DeSantis, et al.) und EP 0771563A2 (Mano, et al.). Osborne et al. (Ophthalmologia, Band 210: 308–314, 1996) lehren, dass 8-Hydroxydipropylaminotetralin (8-OH-DPAT) (ein 5-HT_{I A}-Agonist) den IOD bei Kaninchen reduziert. Wang et al. (Current eye Research, Band 16(8): 769–775, August 1997 und IVOS, Band 39(4), S 488, März 1998) offenbaren, dass 5-Methylurapidil, ein α_1Ap-Antagonist und 5-HT_{I A}-Antagonist, den IOD bei Affen reduziert, jedoch aufgrund seiner ai_A-Rezeptoraktivität. Auch werden 5-HT_IA-Antagonisten als für die Behandlung von Glaukomen (erhöhtem IOD) nützlich offenbart (z. B. WO 92/0338, McLees). Des Weiteren offenbaren DeSai, et al. (WO 97/35579) und Macor et al. (U.S. 5.578.612) die Verwendung von 5-HTr und 5-HT1-_ähnlichen Antagonisten für die Behandlung von Glaukomen (erhöhtem IOD). Diese gegen Migräne wirksamen Verbindungen sind 5-HT_IB,_D,_E,_F-Antagonisten, z. B. Sumatriptan und Naratriptan und verwandte Verbindungen.
• Kurze Beschreibung der Zeichnungen
• Die 1A und 1B zeigen das Aufrechterhalten der ERG-a- und b-Wellenfunktion bei Ratten, die systemisch mit 8-OH-DPAT dosiert und einem starken photooxidativen Trauma ausgesetzt worden sind.
• 2 zeigt den Schutz der Netzhautmorphologie (Photorezeptoren und RPE) bei Ratten, die systemisch mit 8-OH-DPAT dosiert und einem starken photooxidativen Trauma ausgesetzt worden sind.
• 3 zeigt den Schutz der Netzhaut-DNA, ein Maß der Netzhautzellzahl (A) und den vollständigen Schutz der Netzhautmorphologie (Photorezeptoren) bei Ratten, die systemisch mit Buspiron dosiert und einem starken photooxidativen Trauma ausgesetzt worden sind.
• 4A und 4B zeigen das Aufrechterhalten der ERG-a- und b-Wellenfunktion bei Ratten, die systemisch mit SR-57746A dosiert und einem starken photooxidativen Trauma ausgesetzt worden sind.
• Zusammenfassung der Erfindung
• Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von 5-HT_IA-Antagonisten für die Zubereitung eines Medikaments, das für das Behandeln von krankhaften Störungen der äußeren Netzhaut nützlich ist, insbesondere für: AMD, RP und andere Formen heredodegenerativer Netzhauterkrankung, Netzhautablösung und -risse, epiretinale Gliose, die äußere Netzhaut beeinträchtigende Ischämie, diabetische Retinopathie, mit Lasertherapie verbundene Beschädigung (Netzwer-, Fokal- und Panretinaverletzung), einschließlich photodynamischer Therapie (PDT), Trauma, chirurgischen Eingriffe (Netzhautverpflanzung, subretinalen chirurgischen Eingriffen oder Vitrektomie) oder lichtinduzierter iatrogener Retinopathie und dem Konservieren von Netzhauttransplantaten.
• Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
• Serotoninerge 5-HT_IA-Antagonisten haben sich als starke nervenschützende Mittel auf verschiedene Traumen im Zentralnervensystem hin erwiesen. Urnrwarteterweise haben wir gezeigt, dass 8-OH-DPAT (8-Hydroxy-2-(di-n-propylamino)tetralin), Buspiron und SR-57746A eine starke nervenschützende Aktivität in der Netzhaut aufweisen und den lichtinduzierten apoptotischen Zelltod bei Photorezeptoren und RPE-Zellen verhindern. Wir haben gefunden, dass die Behandlung mit Buspiron die photooxidativ induzierte Retinopathie vollständig verhindern kann und den Verlust von Netzhaut-DNA und das DÄK-Dünnerwerden signifikant reduziert. Die Sicherheitsvorteile einiger dieser Verbindungen machen sie sowohl für die akute als auch die chronische Therapie besonders erwünscht. Ein derartiges Mittel wäre bei der Behandlung verschiedener degenerativer Erkrankungen der äußeren Netzhaut nützlich.
• Bei unseren Lichtschädenparadigmen waren Antioxidationsmittel entweder nicht wirksam (α-Tocopherol) oder in hohen Dosen nur geringfügig wirksam (Ascorbat, Vitamin E-Analoge). Desgleichen waren einige Calcium-Antagonisten (Flunarizin, Nicardipin) mäßig wirksam, während andere (Nifedipin, Nimodipin, Verapamil) keine Wirkung bezüglich des Verhinderns lichtinduzierter funktioneller oder morphologischer Änderungen ausübten. Es wurde jedoch festgestellt, dass 5-HT_{I A}-Antagonisten bei diesen Lichtschädenparadigmen 100-mal wirksamer und daher für das Behandeln von krankhaften Störungen der äußeren Netzhaut nützlich sind.
• Die Erfindung befasst sich mit der Verwendung eines pharmazeutisch akzeptablen 5-HT_{I A}-Antagonisten, einschließlich pharmazeutisch akzeptabler Salze, für das Zubereiten eines Medikaments, das für das Behandeln krankhafter Störungen der äußeren Netzhaut (Verbindungen) nützlich ist. Pharmazeutisch akzeptabel bedeutet, die Verbindungen können unbedenklich für die Behandlung von krankhaften Störungen der äußeren Netzhaut verwendet werden. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff der äußeren Netzhaut das RPE, Photorezeptoren, Müller-Stützzellen (insoweit ihre Prozesse sich in die äußere Netzhaut erstrecken) und das äußere Stratum plexiforme. Die Verbindungen sind für die systemische oder lokale okulare Abgabe formuliert.
• Krankhafte Störungen der äußeren Netzhaut umfassen akute und chronische umweltinduzierte degenerative Zustände (Traumen, Ischämie, photooxidativer Stress) der Photorezeptoren und RPE-Zellen in normalen oder genetisch dazu neigenden Individuen. Das schließt ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt: AMD, RP und andere Formen heredodegenerativer Netzhauterkrankungen, Netzhautablösung, -risse, epiretinale Gliose, die äußere Netzhaut beeinträchtigende Ischämie, diabetische Retinopathie, mit Lasertherapie verbundene Verletzung (Netzwerk-, Fokal- und Panretinalverletzung) einschließlich photodynamischer Therapie (PDT), Wärme- oder Kältetherapie, Trauma, chirurgischen Eingriffen (Netzhautverpflanzung, subretinalen chirurgischen Eingriffen oder Vitrektomie) oder lichtinduzierter iatrogener Retinopathie und dem Konservieren von Netzhauttransplantaten.
• Verbindungen, die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sind, haben eine starke Affinität für 5-HT_{I A}-Rezeptoren mit IC₅₀-Werten, die im Bereich von bis zu 500 nM (bevorzugt weniger als 100 nM) liegen. Diese Verbindungen ind auch entweder vollständige oder teilweise Antagonisten mit IC₅₀-Werten im Bereich von bis zu ca. 1 μM (bevorzugt weniger als 500 nM). Repräsentative 5-HT_IA-Antagonisten, die erfindungsgemäß nützlich sind, umfassen – sind jedoch nicht darauf beschränkt: Tandospiron, Urapidil, Ziprasidon, Repinotanhydrochlorid, Xaliprodenhydrochlorid (SR-57746A), Buspiron, Flesinoxan, EMD-68843, DU-127050, Gepiron, Alnespiron, PNU-95666, AP-521, Flibanserin, MKC-242, Lesopitron, Sarizotanhydrochlorid, Org-13011, Org-12966, E-5842, SUN-N4057 und 8-OH-DPAT.
• Die erfindungsgemäße Rezeptorbindungs- und Agonistenaktivität kann mit Hilfe der folgenden Methoden bestimmt werden.
• METHODE 1
• 5-HT_{I A}-Rezeptorbindungsassay
• 5-HT_{I A}-Bindungsstudien wurden mit humanen klonierten, in Chinesischen Hamster-Ovariumzellen (CHO) exprimierten Rezeptoren unter Zuhilfenahme von (³H)8-OH-DPAT als Ligand durchgeführt. Membranen von Chinesischen Hamster-Ovariumzellen {CHO), die klonierte 5-HT_{I A}-Rezeptoren exprimieren (von Biosignal, Inc., Montreal, Kanada für NEN hergestellt) wurden in ca. 40 Volumen von 50 mM Tris, pH-Wert 7,4, 5 Sekunden homogenisiert. Mit Hilfe eines Beckman Biomek 2000-Roboters (Beckman Instruments, Fullerton, CA) wurden Arzneimittelverdünnungen hergestellt. Es wurden Inkubationen mit Membranpreparat-Testverbindungen und 0,25 nM (³H)8-OH-DPAT (NEN, Boston, MA) wurden im gleichen Puffermittel bei 27°C 1 Stunden durchgeführt. Die Assays wurden durch schnelle Vakuumfiltrierung über Whatman GF/B-Glasfaserfiltern; die vorher in 0,3% Polyethylenimin getaucht worden waren, beendet. Die gebundene Radioaktivität wurde mit Hilfe der Flüssigkeitsszintillations-Spektrometrie gemessen. Die Daten wurden mit geeigneten nichtlinearen Kurvenprogrammen analysiert (Sharif et al., J Pharmac Pharmacol, 51: 685–694; 1999).
• Ligandenbindungsstudien können auch mit Membranzubereitungen aus Kalbs- und Rattenhirn (lokale Quelle) und humanen Kortexmembranen durchgeführt werden. Es wurden spezifische Hirnbereiche herausgeschnitten, in 10 Volumen 0,32 M Saccharose homogenisiert und 10 Minuten bei 700 × G zentrifugiert. Die dabei gebildete überstehende Flüssigkeit wurde bei 43,500 × G 10 Minuten zentrifugiert und das Granulat durch eine 10 Sekunden lange Polytronbehandlung in 50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,7, 25°C) erneut suspendiert. Aliquote Teile wurden bei –140°C gelagert. Um das endogene Serotonin zu entfernen, wurden die Zubereitungen vor dem Versuch 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Assay-Inkubationen wurden durch Schnellfiltrieren über Whatman GF/C-Filtern unter Zuhilfenahme einer Brandel-Zellenerntevorrichtun beendet. K_I-Werte wurden mit Hilfe der Cheng-Prusoff-Gleichung errechnet (De Vry et al., J Pharm Exper Ther, 284: 1082–1094, 1998).
• METHODE 2
• Funktionelle 5-HT_IA-Assays
• Die Wirkung von erfindungsgemäßen Verbindungen kann mit Hilfe einer Reihe verschiedener Methoden zum Bestimmen der funktionellen Aktivität von 5-HT_IA-Agonisten bestimmt werden. Ein derartiger Assay wird unter Zuhilfenahme von Hippokampus-Schnitten männlicher Sprague-Dawley-Ratten und Messen der Hemmung der Forskolin-angeregten Adenylatcyclase durchgeführt (J Med Chem, 42: 36, 1999; J Neurochem, 56: 1114, 1991; J Pharm Exper Ther, 284: 1082, 1998). Die Hippokampusmembranen der Ratten wurden in 25 Volumen 0,3 M Saccharose homogenisiert, die 1mM EGTA, 5 mM EDTA, 5mM Dithiothreitol und 20 mM Tris-HCl enthielt, pH-Wert 7,4 bei 25°C. Das Homogenat wurde 10 Minuten bei 1000 × G zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde daraufhin 10 Minuten bei 39.000 × G zentrifugiert. Das dabei enstehende Granulat wurde in Hogonenisierungspuffer mit einer Proteinkonzentration von ca. 1 mg/ml homogenisiert und aliquote Teile wurden bei –140°C gelagert. Vor der Verwendung wurden die Membranen erneut in einem Potter-Elvenhjem-Homogenisator homogenisiert. 50 μl der Membransuspension (50 μg Protein) wurden einem Inkubationspuffer zugegeben, der 100 mM NaCl, 2 mM Magnesiumacetat, 0,2 mM ATP, 1 mM cAMP, 0,01 mM GTP, 0,01 mM Forskolin, 80 mM Tris-HCI, 5 mM Creatinphosphat, 0,8 U/μl Creatinphosphokinase, 0,1 mM IBMX, 1–2 μCi α-[³²P]ATP enthielt. Durch Zusatz der Membranlösung zur Inkubationsmischung (5 Minuten bei 30°C vorgewärmt) wurden Inkubationen mit Testverbindungen (10 Minuten bei 30°C) begonnen. [³²P]cAMP wurde der Salomon-Methode entsprechend gemessen (Adv Cyclic Nucleotide Res, 10: 35–55, 1979). Protein wurde mit Hilfe des Bradford-Assays (Anal Biochem, 72: 248–254, 1976) gemessen.
• Die funktionelle Aktivität kann auch der Methode von Schoeffter et al. (Neuropharm, 36: 429–437, 1997) entsprechend in humanen Rekombinantrezeptoren bestimmt werden. HeLa-Zellen, die einer Transfektion mit humanen Rekombinant-5-HT_IA-Rezeptoren unterzogen worden waren, wurden bis zum Conflux in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet. Die Zellen wurden mit 1 ml mit Hepes gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (in mM) NaCI 130, KCl 5,4, CaCl₂ 1,8, MgSO₄ 0,8, NaHP₂O₄ 0,9, Glukose 25, Hepes 20, pH-Wert 7,4 und Phenolrot 5 mg/l gespült. Die Zellen wurden mit 6 μCi-M1 [³H]Adenin (23 Ci/mMol, Amersham, Rahn AG, Zürich, Schweiz) in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung 2 Stunden bei 37°C markiert. Die Platten wurden daraufhin zweimal mit 1 ml gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gespült, die ein 1 mM Isobutylmethylxanthin enthielt. Die Zellen wurden 15 Minuten in 1 ml dieser Lösung (37°C) in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μm Forskolin und der Testverbindung inkubiert. Das Puffermittel wurde daraufhin entfernt und 1 ml 5% Trichloressigsäure (TCA), die 0,1 mM cAMP und 0,1 mM ATP enthielt, wurden zum Extrahieren der Proben zugegeben. Nach 30 Minuten bei 4°C wurden die TCA-Extrakte einer chromatographischen Trennung in Dowex AG 5OW-X4 und Aluminiumoxidsäulen unterzogen (Salomon, Meth Enzymol, 195: 22–28, 1991). Die cyclische AMP-Herstellung wurde als Verhältnis von [³H]cAMP/([³H]cAMP+[³H]cAMP berechnet.
• Die obigen bei Methode 1 und 2 beschriebenen Verfahren wurden zur Erzielung folgender Daten benutzt.
• Tabelle 1. 5-HT_{I A}-Rezeptorbindung und funktionelle Assay-Daten.
• Bei degenerativen Erkrankungen werden die erfindungsgemäßen 5-HT_IA-Agonisten im Allgemeinen oral verabreicht, wobei die täglichen Dosen dieser Verbindungen zwischen ca. 0,001 und ca. 500 Milligramm liegen. Die bevorzugte tägliche Gesamtdosis liegt zwischen ca. 1 und 100 Milligramm. Bei nichtoraler Verabreichung, wie beispielsweise der intravitrealen, topisch-Okularen, transdermal durch Pflaster verabreichten, subdermalen, parenteralen, intraokularen, subkonjunktivalen oder retrobullär bzw. durch Subtenoninjizierung verabreichten, transskleralen (einschließlich der Iontophorese) oder langsamen Freisetzung müssen biologisch abbaubare Polymere oder Liposome eventuell bezüglich der gesamten täglichen Dosis, die notwendig ist, um eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu bieten, neu eingestellt werden. Die 5-HT_IA-Agonisten können auch in Augenspüllösungen eingegeben werden. Die Konzentrationen sollten im Bereich zwischen ca. 0,001 μM und ca. 100 μM, bevorzugt ea. 0,01 μM und ca. 5 μM liegen.
• Die 5-HT_IA-Agonisten können in verschiedene Arten von ophthalmischen Rezepturen für die Abgabe ins Auge (z. B. topisch, intrakameral oder durch Implantation) eingearbeitet werden. Sie können mit ophthalmologisch aktzeptablen Konservierungsmitteln, Tensiden, Viskositätsverbesserungsmitteln, Gelbildungsmitteln, penetrationsverbessernden Mitteln, Puffermitteln, Natriumchlorid und Wasser unter Bildung wässriger, steriler ophthalmischer Suspensionen oder Lösungen oder vorgeformter Gele oder in-situ gebildeter Gele kombiniert werden. Ophthalmische Lösungsrezepturen können durch Lösen der Verbindung in einem physiologisch akzeptablen isotonischen wässrigen Puffermittel zubereitet werden. Des Weiteren kann die ophthalmische Lösung ein ophthalmologisch akzeptables Tensid zum Verbessern des Lösens der Verbindung enthalten. Die ophthalmischen Lösungen können einen Viskositätsverbesserer wie beispielsweise Hydroxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder dergleichen zum Verbessern des Zurückhaltens der Rezeptur im Bindehautsack enthalten. Um sterile ophthalmische Salbenrezepturen zuzubereiten, wird der aktive Bestandteil mit einem Konservierungsmittel in einem geeignete Vehikel wie Mineralöl, flüssigem Lanolin oder weißer Rohvaseline kombiniert. Sterile ophthalmische Gelrezepturen können durch Suspendieren des aktiven Bestandteils in einer hydrophilen Base zubereitet werden, die den veröffentlichten Rezepturen für analoge ophthalmische Zubereitungen entsprechend durch Kombination mit beispielsweise Carbopol-940 oder dergleichen zubereitet wird. Konserviermittel und tonizitätsverbessernde Mittel können dabei eingearbeitet werden.
• Zur topischen Dosierung werden die 5-HT_IA-Agonisten bevorzugt als topische ophthalmische Suspensionen oder Lösungen mit einem pH-Wert von ca. 4 bis 8 formuliert. Die 5-HT_IA-Agonisten sind normalerweise in diesen Rezepturen in einer Menge von 0,001 Gew.-% bis 5 Gew.-%, bevorzugt jedoch in einer Menge von 0,01 Gew.-% bis 2 Gew.-% enthalten. Für die topische Verabreichung würden daher 1 bis 2 Tropfen dieser Rezepturen 1 bis 4 mal täglich dem Ermessen eines erfahrenen Klinikers entsprechend an die Augenoberfläche abgegeben.
• Die folgenden topischen ophthalmischen Rezepturen sind erfindungsgemäß nützlich, wenn sie 1 bis 4 mal pro Tag dem Ermessen eines erfahrenen Klinikers entsprechend verabreicht werden. BEISPIEL 1 BEISPIEL 2 BEISPIEL 3 BEISPIEL 4 BEISPIEL 5 BEISPIEL 6 METHODE 3
• Nervenschützende Wirkungen im Modell der photooxidativ bei Ratten induzierten Retinopathie.
• Die Retinalschutzwirkung dieser 5-HT_IA-Agonisten wurde in unserem photooxidativ induzierten Retinopathieparadigma beurteilt.
• Auslösen photochemischer Läsionen. Photochemische Läsionen wurden bei Ratten, die sich an die Dunkelheit gewöhnt hatten (24 Stunden) durch 6 Stunden langes Aussetzen (220 fc) blauem Licht gegenüber (Halbamplituden-Bandendurchgang = 435–475 mm) induziert. Man ließ die Tiere sich 5 Tage im Dunkeln erholen vor der elektrodiagnostischen Bewertung der Netzhautfunktionen. Die Ratten wurden während dieser Exposition Licht gegenüber in klarem Polycarbonatkäfigen untergebracht.
• Elektrodiagnostische Bewertung. Das Elektroretinogramm (ERG) wurde an betäubten Ratten nach einer 24-stündigen Anpassungsperiode an die Dunkelheit aufgenommen. Die Ratten wurden durch ip-Einspritzung von Ketamin-HCl (75 mg/kg) und Xylazin (6 mg/kg) betäubt. Blitz-ERG, die mit Hilfe einer an der Hornhaut positionierten Platin-Iridium-Drahtschleifenelektrode aufgenommen wurden, wurden durch Betrachten eines Ganzfelds hervorgerufen. Die elektrischen Reaktionen auf eine Reihe von Lichtblitzen steigender Intensität hin wurden zum Analysieren der temporalen Charakteristik des Zusammenhangs zwischen der Wellenform und der Reaktionsspannungs-log-Intensität (VlogI) digitalisiert. Änderungen der ERG-a-Welle werden mit der Photorezeptor- und Retinalpigmentepithel-Beschädigung in Verbindung gebracht, während die Beschädigung der inneren Netzhaut sich in Form von Änderungen der ERG-b-Welle auswirkt.
• Beurteilung der Retinalmorphologie. Es wurden Augengewebe aus Kontroll- und mit dem Arzneimittel oder Vehikel dosierten Ratten abgenommen und durch Eintauchen in eine Mischung von 2% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd fixiert. Fixierte Augäpfel wurden in einer steigenden Ethanolserie dehydratisiert, in JB-4 Kunststoffharz eingebettet und 1 bis 1,5 Mikron dicke Schnitte wurden mit Hilfe eines quantitativen Computerimageanalysesystems analysiert, das an das Mikroskop angeschlossen war. Die Netzhautschichtdicke (Retinalpigmentepithel, RPE; Dicke der äußeren Kernschicht, DÄK; Dicke der inneren Kernschicht, DIK, und Länge der inneren und äußeren Photorezeptosegmente, IS+ÄS) wurde gemessen.
• Bewertung der DNA-Veränderungen. Albinoratten wurden durch Inhalieren von CO₂ euthanisiert und die einzelnen Netzhäute in getrennten Röhren eingefroren. Jede Netzhaut war in 0,8 ml (2,0 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH-Wert 7,4, 2 mM EDTA) unter Erzielung eines gleichförmigen Homogenats beschallt worden und wurde im gefrorenen Zustand gelagert. Aliquote Anteile (0,1 ml) jeder Probe wurden 10-fach mit 2,0 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH-Wert 7,4, 2 mM 1 μg/ml Bisbenzimidazol enthaltender 2 mM EDTA (Hoechst 33258) verdünnt. Mit Hilfe von Kälberthymus-DNA von 0 bis 25 μg/ml im gleichen Puffer wurde eine Standardkurve gebildet. Dreifache 0,2 ml Aliquote jeder Netzhautprobe und des Standards wurden in 96-Mikrotiterplatten für Fluoreszenzmessungen in Cytofluor II pipettiert. Die Anregungswellenlänge betrug 360 nm und die Emissionswellenlänge 460 nm.
• Versuchstiere und Dosierung. Männliche Sprague Dawley-Ratten wurden dem Zufall nach Arzneimittel- und Vehikelversuchsgruppen zugeordnet. Kontrollratten wurden in ihren Behausungskäfigen unter normaler Exposition zyklischäm Licht gegenüber untergebracht. Allen Ratten wurden vor einer sechsstündigen Exposition blauem Licht gegenüber 48, 24 und 0 Stunden vorher eine entsprechende Dosis verabreicht. Die Dosierung war wie folgt:
• 1). 8-OH-DPAT (8-Hydroxy-2-(di-n-propalyamino)tetralin): Den Ratten, die entweder Vehikel (N = 10) oder 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg [N = 5] oder 1,0 mg/kg [N = 10]) erhielten, wurden drei subkutane (SK) Einspritzungen vor der Exposition Licht gegenüber verabreicht. 5 Ratten wurden als Kontrollen benutzt. Der Netzhautschutz wurde durch Analysieren der ERG-Reaktion und Messen der Änderungen der Netzhautmorphologie beurteilt.
• 2) Buspiron: Für die DNA-Quantifizierung wurden sechs Ratten pro Behandlungsgruppe ip mit einer Dosis von Vehikel oder Buspiron (0,5 und 1 mg/kg) vor der Exposition Licht gegenüber behandelt. Die Netzhäute von sieben normalen Ratten wurden als Kontrolle verwendet. Um die Änderungen in der Netzhautmorphologie zu beurteilen, wurden den Ratten entweder (ip) Vehikel (N = 8) oder Buspiron (1,0 mg/kg [N = 9]) verabreicht. Sechs Ratten dienten als Kontrollen. Der Netzhautschutz wurde durch quantitatives Bestimmen der Änderungen der Netzhaut-DNA und Messen der Änderungen der Netzhautmorphologie beurteilt.
• 3). SR-57746A. Den Ratten wurden (ip) Dosen von Vehikel (N = 15) oder SR-57746A (0,2 mg/kg [N = 5] oder 1 mg/kg [N = 15] verabreicht. Elf Ratten wurden als Kontrollen benutzt. Die ERG wurden nach einer fünftägigen Erholungszeit zum Beurteilen des Netzhautschutzes analysiert.
• 8-OH-DPAT-Ergebnisse der Bewertung. Die sechstündige Exposition blauem Licht gegenüber führte zu einer signifikanten Reduzierung der ERG-Reaktionsarnplitude (ANOVA, p < 0,001; Bonferroni t-Test, p < 0,05) im Vergleich zu normalen beim Messen nach einer fünftägigen Erholungsperiode (1A und B). Die Exposition blauem Licht gegenüber führte zu einer 75%igen Reduzierung der maximalen a- und b-Wellenamplituden in mit Vehikel behandelten Ratten im Vergleich mit den Kontrollen. Außerdem waren die Schwellenwertreaktionen niedriger und wurden bei hellerem Blitzintensitäten hervorgerufen.
• Die Ratten, denen 8-OH-DPAT verabreicht worden war, zeigten einen dosisabhängigen Schutz der äußeren und inneren Netzhautfunktion gegen photooxidativ induzierte Retinopathie (1A und B). Die maximalen a- und b-Wellenreaktionsamplituden bei mit Dosen von 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg) behandelten Ratten unterschieden sich nicht von mit Vehikel behandelten Ratten und betrugen ca. 27% der Kontrollamplituden. Jedoch betrugen die maximalen a- und b-Wellenreaktionsamplituden bei mit 8-OH-DPAT (1,0 mg/kg) behandelten Ratten ca. 53% bzw. 61% der normalen und lagen signifikant höher als die Reaktionen, die bei mit Vehikel behandelten Ratten gemessen wurden (1A und 1B).
• Im Einklang mit diesen ERG-Veränderungen zeigte die morphometrische Analyse dieser Netzhäute nach einer dreiwöchigen Erholungsperiode einen signifikanten (ANOVA, p < 0,01) Verlust an Photorezeptorzellen, ein Verkürzen der Länge des inneren und äußeren Photorezeptorsegments und ein Abflachen des RPE bei mit Vehikel behandelten Tieren., Es wurden keine signifikanten Änderungen der Dicke der DIK beobachtet. Die DÄK-Dicke war um 73%, die Länge der inneren und äußeren Segments um 82% und die RPE-Dicke um 59%, im Vergleich mit den Kontrollen reduziert (1). Die bei mit 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg) behandelten Ratten beobachteten Läsionen unterschieden sich nicht signifikant von den Läsionen, die bei den mit Vehikel behandelten Ratten gemessen wurden. Während die ERG um ca. 63% reduziert waren, war die DÄK-Dicke um 53%, die Länge der Photorezeptorsegmente um 60% und die RPE-Dicke um 34% reduziert. Die durch Licht verursachten Läsionen, die bei mit 8-OH-DPAT (1,0 mg/kg) behandelten Ratten beobachtet wurden, unterschieden sich jedoch signifikant von mit Vehikel behandelten Ratten. Während die ERG-Reaktionsamplituden bei über 50% der normalen lagen, war die DÄK-Dicke 2,4-mal stärker, die Länge der Photorezeptorsegmente 2,9 mal länger und die RPE-Dicke 1,9 mal stärker, im Vergleich mit den mit Vehikel behandelten Ratten.
• Ergebnis der Buspiron-Bewertung. Wie in 3A veranschaulicht, waren die Netzhaut-DNA-Niveaus nach der Vehikeldosierung signifikant reduziert (ANOVA, p = 0,017), um ca. 30% im Vergleich mit den Kontrollen. Keine signifikanten Unterschiede wurden zwischen den mit Vehikel und den mit 0,1 mg/kg Buspiron behandelten Gruppen gemessen. Der Netzhautschutz wurde bei mit Buspiron (1 mg/kg) behandelten Ratten gemessen. Die Netzhaut-DNA-Niveaus waren signifikant höher als diejenigen bei mit Vehikel behandelten Ratten, aber von den Kontrollen nicht signifikant unterschieden.
• Die sechs Stunden lange Exposition blauem Licht gegenüber führte zu einer signifikanten Reduzierung der Anzahl der Photorezeptoren (ANOVA, p = 0,17). Die morphometrische Analyse dieser Netzhäute nach einer vierwöchigen Erholungsperiode zeigte ein Dünnerwerden der äußeren Kernschicht um 54% bei mit Vehikel behandelten Ratten im Vergleich mit den Kontrollen (3B). Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied in der ONL-Dicke zwischen den normalen und den mit Buspiron behandelten Ratten gemessen. Bei Buspiron (1 mg/kg) behandelten Ratten betrug die DÄK-Dicke 28,3 μm im Vergleich mit 30,4 μm bei normalen Ratten.
• Bewertung der Ergebnisse bei SR-57746A. Ein signifikanter Schutz der Netzhautfunktion wurde bei mitSR-57746A (0,5 und 1,0 mg/kg) behandelten Ratten, die Licht ausgesetzt wurden, gemessen. Die maximalen a- und b-Wellenreaktionsamplituden wurden bei mit Vehikel behandelten Ratten im Vergleich mit den Kontrollen um 50% reduziert (4A und B). Die maximalen Reaktionen betrugen 82% der Kontrollen bei mit SR-57746A (0,5 mg/kg) behandelten Ratten und 70% der normalen Ergebnisse bei mit 1 mg/kg behandelten Ratten.
• Schlussfolgerung. Diese 5-HT_IA-Agonisten (8-OH-DPAT, Buspiron und SR-57746A) zeigen eine gute Wirkung und Effizienz bei diesem oxidativen Modell der degenerativen Netzhauterkrankung. Ein funktioneller und struktureller Schutz wurde bei Ratten erzielt, denen an drei aufeinanderfolgenden Tagen Dosen verabreicht wurden, die bei 1 mg/kg) lagen.

Claims (4)

1. Verwendung einer eine 5-HT_1A-Antagonisten-Aktivität aufweisenden Verbindung für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von krankhaften Störungen der äußeren Netzhaut.
2. Verwendung nach Anspruch 1 einer Verbindung, die unter Tandospiron, Urapidil, Ziprasidon, Repinotanhydrochlorid, Xaliprodenhydrochlorid (SR-57746A), Buspiron, Flesinoxan, EMD-68843, DU-127090, Gepiron, Alnespiron, PNU-95666, AP-521, Flibanserin, MKC-242, Lesopitron, Sarizotanhydrochlorid, E-5842, SUN-N4057, Org-13011, Org-12966 und 8-OH-DPAT ausgewählt wird.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die krankhafte Störung unter AMD, RP und anderen Formen heredodegenerativer Netzhauterkrankungen, Netzhautloslösung und -rissen, epiretinaler Gliose, die äußere Netzhaut beeintträchtigender Ischämie, diabetischer Retinopathie, mit Lasertherapie verbundener Verletzung (Netzwerk-, Fokal- und Panretinaverletzung) einschließlich photodynamischer Therapie (PDT), Trauma, chirurgischen Eingriffen (Netzhautverpflanzung, subretinalen chirurgischen Eingriffen oder Vitrektomie) oder lichtinduzierter iatrogener Retinopathie und dem Konservieren von Netzhauttransplantaten ausgewählt wird.
4. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die krankhafte Störung AMD, RP oder diabetische Retinopathie ist.