DE3712531C1 - Apparatus for keeping the temperature of biological samples constant for their cryosubstitution - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zum Konstanthalten der Temperatur von biologischen Proben zu deren Kryosubstitution, bestehend aus einer einen Innenraum bildenden Ummantelung aus wärmeisolierendem Material, wobei der Innenraum zur Aufnahme der Proben und eines Kühlmittels für ca. -80°C bestimmt ist.

Zur elektronenmikroskopischen Präparation biolo­ gischer Proben ist es notwendig, diese zunächst in ihrem nativen Zustand zu fixieren und anschlie­ ßend möglichst schonend zu entwässern. Eine praktizierte Methode ist das Schockgefrieren des Probenmaterials (Kryofixation) und das anschließende Austauschen der wäßrigen Bestandteile gegen ein mit dem späteren Einbettungsmedium mischbares Lösungsmittel (z. B. Aceton). Dieser Austauschprozeß findet am optimalsten bei einer Temperatur von ca. -80°C statt (Kryosubstitution). Ein Erwärmen auf Temperaturen von <-75°C vor dem Austausch des Eises gegen das Substitutions­ medium bewirkt eine Umbildung des amorphen Eises gegen kristallines Eis (Rekristallisation). Die wachsenden Eiskristalle zerstören dann die ursprünglich gut erhaltenen Zellstrukturen. Aus diesem Sachverhalt ergibt sich die Notwendigkeit, das Präparat zusammen mit dem Substitutions­ medium eine bestimmte Zeit, die vom Proben­ volumen abhängig ist (in der Regel mehr als 24 h) auf einer Temperatur von möglichst exakt -80°C zu halten.

Es ist bekannt, zur Durchführung der Kryosubstitution elektronisch gesteuerte Systeme einzusetzen, die jedoch in der Regel aufwendig, relativ teuer und auch störanfällig sind.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zur Durchführung der Kryosubstitution von biologi­ schen Proben zu schaffen, die im Aufbau und in ihrer Handhabung einfach, billig in der Anschaffung sowie störunanfällig ist.

Diese Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß sich im Innenraum ein Metall­ körper befindet, dessen Dimensionen so bemessen sind, daß bei vorgegebener Menge des Kühlmittels die Probe für eine vorbestimmte Zeit auf der gewünschten Temperatur von -80°C verbleibt.

Beim Einsatz dieser Vorrichtung werden Metallkörper und Menge des Kühlmittels (unter Berücksichtigung der Isolationswirkung der Ummantelung) so aufein­ ander abgestimmt, daß die Temperatur von -80°C für die gewünschte Zeit konstant gehalten wird. Dabei wird der Metallkörper zweckmäßigerweise auf -80°C gebracht und eine hinreichende Menge an Kühlmittel in den Innenraum gegeben, bevor die Proben in den aus der Ummantelung bestehenden Behälter gegeben werden.

Durch die Verwendung des Metallkörpers wird nicht nur erreicht, daß die Dauer der Verweilzeit der Proben bei ca. -80°C (durch Verwendung von festem CO₂ bei -79°C) exakt vorherbestimm­ bar ist. Hinzu kommt, daß sich der Metallkörper als nützliches "Kältereservoir" für den Aufwärm­ vorgang der Proben auf Raumtemperatur erweist, so daß das Aufwärmen in der gewünschten Zeit, d. h. nicht zu schnell, erfolgt. Dies ist erforder­ lich, da biologische Proben aufgrund ihrer komplexen Struktur gegen plötzliche Temperatur­ schwankungen äußerst empfindlich ind. Auch kann dadurch ein Nebeneffekt eines Kontrastier­ mittels (z. B. OsO₄), das zur Steigerung des Bildkontrastes im Elektronenmikroskop dem Substitutionsmittel zugeführt wird, weitgehend vermieden werden, der darin besteht, daß eine zusätzliche chemische Fixierung der leicht diffusiblen Ionen eintritt. Dieser Effekt kommt mit zunehmender Aufwärmung des Präparates immer stärker zum Tragen, weshalb es erforderlich ist, daß die Aufwärmekinetik einen bestimmten Verlauf hat, der genau bekannt ist. Diese An­ forderungen werden bei Verwendung des Metall­ körpers als "Kältereservoir" erfüllt.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist absolut störunanfällig, zumal keine äußere Energiequelle (Netz, Kühltruhen), die ausfallen könnten, Verwendung finden. Dennoch sind - wie oben ausgeführt - die Verweilzeiten in dem für die Kryosubstitution optimalen Temperaturbereich exakt und einfach zu bestimmen.

Eine zweckmäßige Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung besteht darin, daß der Metallkörper quaderförmig ist. Auch ist zweckmäßig, daß er Bohrungen zur Aufnahme der Proben aufweist und aus Messing besteht.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme in den Innenraum eine zweite Ummantelung aus Isoliermaterial für den Metallkörper, die Proben und ein weiteres Kühlmittel, z. B. flüssiger Stickstoff, vorgesehen ist, wobei im Innenraum hinreichend Platz für das erste Kühlmittel verbleibt.

Diese Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung erlaubt es, die Proben zusammen mit dem Metallkörper, durch Verwendung von flüssigem Stickstoff, auf -195°C gekühlt in den größeren Behälter zu geben. Ohne die zweite Ummantelung wäre dies nicht möglich, da der gekühlte Metallkörper sonst nicht angefaßt werden könnte. Auch läßt sich der durch die zweite Ummantelung gebildete kleinere Behälter mit den Proben (und dem Metallkörper) leichter transportieren und ggf. bei beengten Verhältnissen beim Experiment leichter unterbringen als der weitaus größere äußere Behälter.

Auch beim Aufwärmvorgang von -194°C auf ca. -80°C wirkt der Metallkörper als "Kältereservoir" und dämpft daher auch diesen Temperaturanstieg.

Eine Ausführungsform der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im folgenden näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine Vorrichtung mit innerem und äußerem Behälter im Querschnitt;

Fig. 2 den Temperaturanstieg der Proben bei Verwendung einer Vorrichtung gemäß Fig. 1.

Fig. 1 zeigt im Querschnitt einen aus der Ummantelung 1 gebildeten äußeren Behälter, einen im äußeren Behälter befindlichen, aus der Ummantelung 2 gebildeten inneren Behälter und in diesem den Metallkörper 3, der mit Bohrungen 4 für die Proben 5 versehen ist. Am Boden des inneren Behälters befindet sich flüssiger Stickstoff, am Boden des äußeren Behälters festes CO₂.

Fig. 2 zeigt den Verlauf der Aufwärmkurve von biologischen Proben bei Verwendung einer Vorrichtung, die der in Fig. 1 im Schnitt dargestellten Vorrichtung entspricht. Die Um­ mantelung 1 bestand aus Polyurethanschaum, die Ummantelung 2 aus Polystyrol, wobei die jeweils äußeren Abmessungen 220 mm × 240 mm × 140 mm bzw. 480 mm × 420 mm × 315 mm (Länge × Breite × Höhe) betrugen. Die Dicken der Ummantelungen betrugen 20 mm bzw. 35 mm. Der Metallkörper war ein Messingkörper mit den Abmessungen 160 mm × 180 mm × 60 mm (Länge × Breite × Höhe) und Bohrungen von 28 mm ⌀. Die Menge des flüssigen Stickstoffs (der Messingkörper und die Proben waren bereits vor ihrem Einbringen in den äußeren Behälter auf -194°C abgekühlt worden) betrug 600 mg, die Menge an festem CO₂ ca. 1000 g.

Claims (5)

1. Vorrichtung zum Konstanthalten der Temperatur von biologischen Proben zu deren Kryosubstitution, bestehend aus einer einen Innenraum bildenden Ummantelung aus wärmeisolierendem Material, wobei der Innenraum zur Aufnahme der Proben und eines Kühlmittels für ca. -80°C bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, daß sich im Innenraum ein Metallkörper (3) befindet, dessen Dimensionen so bemessen sind, daß bei vorgegebener Menge des Kühlmittels die Probe für eine vorbestimmte Zeit auf der gewünschten Temperatur von -80°C verbleibt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkörper (3) quaderförmig ist.

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkörper (3) Bohrungen (4) zur Aufnahme der Proben (5) aufweist.

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallkörper (3) aus Messing besteht.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aufnahme in den Innenraum eine zweite Um­ mantelung (2) aus Isoliermaterial für den Metall­ körper (3), die Proben (5) und ein weiteres Kühlmittel, z. B. flüssiger Stickstoff, vorgesehen ist, wobei im Innenraum hinreichend Platz für das erste Kühlmittel verbleibt.