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DE20110013U1 - Nukleotidträger zur Diagnose und Therapie oraler Erkrankungen - Google Patents

Nukleotidträger zur Diagnose und Therapie oraler Erkrankungen

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DE20110013U1
DE20110013U1 DE20110013U DE20110013U DE20110013U1 DE 20110013 U1 DE20110013 U1 DE 20110013U1 DE 20110013 U DE20110013 U DE 20110013U DE 20110013 U DE20110013 U DE 20110013U DE 20110013 U1 DE20110013 U1 DE 20110013U1
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bacteria
periodontitis
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probes
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Description

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PATENTANWÄLTE
13. Juni 2001
44 221 K
Frau Dr. Antje Rötger
Finkenstraße 44,48147 Münster
"Nukleotidträger zur Diagnose und Thearoie oraler Erkrankungen"
Die Erfindung betrifft einen Nukleotidträger zur Diagnose und Therapie oraler Erkrankungen, insbesondere der Parodontitis.
Die Parodontitis ist eine entzündliche Erkrankung des Zahnbettes, die unbehandelt zu einem Gewebe- und Knochenabbau des Zahnhalteapparats und damit letztlich zu einem Verlust der Zähne führt. Sie gehört zu einem der häufigsten Krankheitsbilder unserer Gesellschaft, von der ca. 35 bis 40% aller erwachsenen Deutschen betroffen sind. Die Parodontitis ist eine multifaktorielle Erkrankung, die durch eine Vielzahl verschiedener Mikroorganismen ausgelöst wird und deren Verlauf durch individuelle Verhaltensweisen - z.B. die Mundhygiene oder starkes Rauchen - und bestimmte Stoffwechselerkrankungen wie beispielsweise die Diabetes sowie eine genetische Dispositionen beeinflußt wird.
Der primäre Mechanismus der Parodontitis liegt in der Bildung bakterieller Plaque, die sich am Zahnfleischsaum zu Zahnstein verhärtet und zu einer
mechanischen Reizung führt. Die Virulenzfaktoren der Plaquebakterien verursachen im angrenzenden Zahnfleisch Rötungen und Schwellungen, die das klinische Erscheinungsbild der Zahnfleischentzündung (Gingivitis) erzeugen. Die Gingivitis kann sich zu einer Parodontitis fortentwickeln. Dies geschieht entweder direkt, indem bakterielle Toxine, Enzyme oder Stoffwechselprodukte - die zu den Virulenzfaktoren zählen - das umgebende Gewebe schädigen, oder indirekt, indem diese Faktoren Entzündungsmechanismen des Immunsystems aktivieren, die ihrerseits zur Zerstörung des Knochen- und Weichgewebes des Zahnhalteapparats beitragen. Mit Fortschreiten der Erkrankung weicht das Zahnfleisch zurück - Verlust des sog. attachments - so daß sich tiefe Parodontaltaschen (sog. Sulkus) bilden, die ein ideales Ökosystem für anaerobe Bakterien darstellen. Bei der Entstehung einer Parodontitis verschiebt sich daher das Spektrum der Bakterien von aeroben grampositiven Kokken und Stäbchen zu anaeroben gramnegativen Stäbchen.
Die Gesamtheit der parodontalen (oder oralen) Erkrankungen läßt sich in die Gingivitis (Zahnfleischentzündung), die chronische adulte Parodontitis (AP), die refraktäre Parodontitis, die Periimplantitis und die akuten oder rasch progressiven Parodontopathien unterteilen. Zu der letzteren Gruppe gehört die ANUG (akute nekrotisierende-ulzerierende Gingivitis), die EOP („early-onset periodontitis"), die RPP (rasch verlaufende, progressive Parodontitis) und die LJP (Lokalisierte juvenile Parodontitis).
Die unterschiedlichen Krankheitsbilder gehen jeweils mit einem charakteristischen Keimspektrum - d.h. mit einem quantitativ und qualitativ bestimmt zusammengesetzten Spektrum an Bakterien - einher. So zeichnen sich die Gingivitis und die chronische adulte Parodontitis durch ein in Richtung gramnegativer, anaerober Bakterien verschobenes Keimspektrum aus. Die RPP und die refraktäre Parodontitis weisen oft hohe Keimzahlen Parodontitis-assoziierter Bakterien auf. Das Keimspektrum der LJP ist hin-
gegen durch den Leitkeim Actinobacillus actinomycetemcomitans bestimmt. Nach der sog. spezifischen Plaquehypothese ist es in der Fachwelt anerkannt, daß der Schweregrad einer Parodontitis in deutlicher Korrelation zum Vorkommen bestimmter Bakterienspezies steht. Diese parodontalpathogenen Markerkeime sind anaerob oder mikroaerophil, so dass sie in den tiefen Teilen des Sulkus ihr pathogenes Potential entfalten können.
Die Pathogenität dieser Bakterien liegt in ihren Virulenzfaktoren begründet, die beispielsweise als Adhäsine (u.a. Haftpili, Fimbrien) und Oberflächenkohlenhydrate die Anhaftungsfähigkeit, sowie als Leukotoxine, Kapseln oder Chemotaxis-Inhibitoren die Fähigkeit zur Abwehr des Wirtsimmunsystems oder zum Verdrängen der benignen Parodontalflora oder als Proteasen, Epitheliotoxine oder Endotoxine die Gewebsinvasivität der Keime vermitteln. Die Virulenzfaktoren sind außerdem für systemische Wirkungen der Bakterien verantwortlich, wobei die Virulenz, d.h. das Ausmaß der krankheitserzeugenden Eigenschaft eines Stammes einer pathogenen Spezies, bei verschiedenen Stämmen sehr unterschiedlich sein kann.
Die spezifische Plaquehypothese ist jedoch nicht geeignet, die Entstehung der Parodontitis eindeutig zu beschreiben. So konnten dieselben Parodontitis-assoziierten Keime z. B. auch in vielen parodontal gesunden Personen nachgewiesen werden. Zur Krankheitsentstehung muss daher u.a. auch eine individuelle Anfälligkeit des Patienten hinzukommen. Diese kann einerseits ihre Ursache in einer genetischen Disposition haben, andererseits aber auch durch die Immunabwehr schädigende Umweltfaktoren und Allgemeinerkrankungen vermittelt werden (z. B. Rauchen, psychischer Stress, Diabetes mellitus).
Neben diesen plaque-spezifischen Bakterien sind - so wird vermutet - für die Ausbildung oraler Erkrankungen auch Mikroorganismen relevant, die in der subgingivalen Plaque normalerweise nicht vorkommen, bei Patienten aber, die schlecht auf eine Parodontaltherapie ansprechen, häufig nachzuweisen sind. Vor allem Darmbakterien, Staphylococcen und andere untypische Mundbewohner konnten in einer Studie bei 14% der Patienten mit adulter Parodontitis nachgewiesen werden, davon die Arten Enterobacter cloacae, Klebsieila pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Klebsieila oxytoca und Enterobacter agglomerans in über 50% der Fälle. Auch opportunistische Pilze/Hefen (z. B. Candida spec.) konnten bei Parodontitispatienten mit immunsupprimierenden Faktoren, wie z. B. Rauchen, nachgewiesen werden.
Auch Viren können zu den Parodontitis-assoziierten Mikroorganismen gehören. Orale Erkrankungen konnten beispielsweise inzwischen mit einer Reihe von Herpesviren in Zusammenhang gebracht werden, darunter Herpes Simplex Virus 1 und 2 (HSV-1 und HSV-2), Varizella-Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr Virus (EBV), Zytomegalievirus (HCMV) und Humanes Herpes Virus 8 (HHV-8).
Einen entscheidenden Einfluss auf die Progression der Parodontitis hat das Immunsystem des Patienten. Dies kann zwar die Vermehrung eindringender Bakterien verhindern helfen, trägt selber aber auch zu einer verstärkten Zerstörung des Gewebes bei, indem die Botenmoleküle der Immunzellen auch destruktiv auf das eigene Gewebe wirken, da z. B. aktivierte Makrophagen Osteoklasten (Knochensubstanz abbauende Zellen) aktivieren und damit zum Abbau des Alveolarknochens (Kieferknochens) beitragen.
Entzündungsfördernde Botenstoffe (Zytokine) werden in Abhängigkeit von der genetischen Disposition von verschiedenen Patienten in unterschiedlichem Ausmaß gebildet. Relevante genetische Unterschiede konnten inzwi-
sehen für die Produktion der Zytokine Interleukin-1A (IL-1A) und Interleukin-1B (IL-1B), des lnterleukin-1 Rezeptor Antagonisten (IL-1 RA), des Interieukin-4 (IL-4), des Tumor-Nekrose-Faktors &agr; (TNFa), des Fey RII (CD32)-Rezeptors und für die HLA-Antigene HLA-A9 und HLA-B15 nachgewiesen werden [Meyle J, Domann E, Gonzales J (2000). Molekularbiologische PAR-Diagnostik und ihre Bedeutung. Workshop 5 auf der Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie, Frankfurt, 2000.].
Bei vielen Patienten mit Gingivitis oder leichter bis mittelschwerer Parodontitis lässt sich das Fortschreiten der Erkrankung durch konventionelle Behandlungsmethoden (Mundhygieneinstruktion, mechanische Verfahren zur Entfernung von supra- und subgingivaler Plaque, evtl. Lappenoperation) verhindern. Daneben tritt bei einigen Patienten eine unterstützende antibiotische Therapie. Bei Vorhandensein von A. actinomycetemcomitans oder z. B. von P. gingivalis und B. forsythus in hoher Keimzahl kann die Antibiotikatherapie notwendig sein, wobei aber auch die individuelle immunologische Konstitution des Patienten den Verlauf und damit die Notwendigkeit der Antibiotikatherapie bestimmt.
Die aktuellen Antibiotikaempfehlungen für eine Therapie richten sich nach dem Keimspektrum des Patienten. Die gegenwärtig möglichen Empfehlungen beschränken sich allerdings darauf, bei Vorhandensein von A. actinomycetemcomitans eine andere Antibiotikatherapie zu wählen als bei der Abwesenheit dieses Keims.
Die Pathogenese oraler Erkrankungen, insbesondere der Parodontitis, ist ein komplexer Prozeß, der im wesentlichen von dem Spektrum der Parodontitis direkt oder indirekt assoziierten Mikroorganismen, den jeweiligen relevanten Virulenzfaktoren und der genetischen Disposition des Betroffenen bestimmt wird. Die vorhandenen Mikroorganismen - mit ihren
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etwaigen Antibiotikaresi-stenzen - sind ihrerseits maßgeblich für den angestrebten Therapieerfolg. Eine möglichst genaue Diagnose und eine die Diagnoseergebnisse berücksichtigende Therapie macht daher zunächst die individuelle Bestimmung dieser Einflußgrößen bei dem Betroffenen erforderlich.
Dazu ist es bekannt, den Nachweis und die Identifizierung pathogener Bakterien, Pilze bzw. Viren über mikroskopische Methoden oder die Kultivierung dieser Mikroorganismen auf Selektionsmedien zu führen. Diese Verfahren sind jedoch nicht nur wegen der Kultivierungsdauer und ihrer geringen Sensitivität nachteilig, sondern sind insbesondere für anaerobe Mikroorganismen ungeeignet. Auch sind viele Parodontitis assoziierte Mikroorganismen nicht in vitro kultivierbar. Alternativ können Mikroorganismen über Immunoassays nachgewiesen werden. Dieser Ansatz ist aber ebenso durch die geringe Sensitivität und zudem durch die begrenzte Verfügbarkeit und Spezifität der notwendigen Antiseren beschränkt.
Daneben ist u.a. eine Identifizierung der Mikroorganismen über den direkten Nachweis ihrer DNA oder RNA möglich, der auf dem Einsatz bekannter Hybridisierungsverfahren wie Southern- oder Northern-Blot-Analysen basiert. Mit diesen Tests können jedoch meist aus Kosten- und Zeitgründen nur 3 bis 5 Arten gleichzeitig nachgewiesen werden können [Dix K, Watanabe SM, McArdle S, Lee Dl, Randolph C, Moncla B, Schwartz DE (1990). Species-specific oligonucleotide probes for the identification of periodontal bacteria. J Clin Microbiol, 28: 319-323].
Ähnliche Schwierigkeiten herrschen beim Austesten mikrobieller Antibiotika-Resistenzen, die entweder auf beispielsweise durch Plasmidtransfer erworbene Resistenzgene oder auf Mutationen bakterieneigener Gene zurückge-
hen können (beide genetischen Ursachen werden nachfolgend als „Antibiotika-Resistenzgene" bezeichnet). Dazu werden die Mikroorganismen üblicherweise in Gegenwart antibiotisch wirksamer Substanzen kultiviert, so daß die Kultivierungsdauer sowie die Exposition der Kulturen an Sauerstoff die bereits geschilderten Probleme bereiten.
Die genetische Disposition des Menschen zur Ausbildung einer oralen Erkrankung wird gegenwärtig nur über ein Screening von zwei Genpolymorphismen des Interleukin 1 (IL-1A und IL-1B) berücksichtigt.
Die bekannten Verfahren zur Diagnose oraler Erkrankungen haben den Nachteil, daß keines für sich genommen geeignet ist, der Komplexität der Pathogenese - nämlich der Bedeutung der quantitativen und qualitativen Zusammensetzung der oralen Mikroorganismen, ihrer Virulenzfaktoren sowie der genetischen Disposition des Patienten - gerecht zu werden. Ebensowenig ermöglichen diese bekannten Tests eine Aussage über etwaige antibiotische Therapieansätze.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Diagnose und die Therapie oraler und parodontaler Erkrankungen, insbesondere der Parodontitis zu verbessern.
Diese Aufgabe wird gelöst durch einen Nukleotidträger nach einem der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand entsprechender Unteransprüche.
Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, einen Träger mit Sonden für Nukleotid-Referenzsequenzen (nachfolgend Referenzsequenzen) zu versehen, die entweder für die genetische Disposition des Patienten für orale
Erkrankungen, für die Identifizierung eines Parodontitis assoziierten Mikroorganismus, für die Ermittlung der mikrobiellen Virulenzfaktoren oder der Ausbildung mikrobieller Antibiotikaresistenzen spezifisch sind. Diese Sonden, die in definierter Anordnung in vielfachen Serien auf den Träger (nachfolgend auch Genchip) aufgebracht werden können, dienen zum Nachweis der aus Patientenproben amplifizierten Nukleotidsequenzen. Diese können entweder mikrobiellen oder humanen Ursprungs sein. Die Referenzsequenzen können während der Amplifizierung beispielsweise mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, so daß ihre etwaige anschließende Hybridisierung mit den auf dem Chip aufgebrachten Sonden qualitativ oder quantitativ nachweisbar ist. Alternativ können die Sonden auch die zu den Referenzsequenzen komplementäre Nukleotidsequenzen (nachfolgend auch Komplementärsequenzen) erkennen.
Vorteilhafterweise werden auf den Träger Sonden sowohl für die Untersuchung der humanen Parodontitis assoziierten Genpolymorphismen als auch für die Analyse des Erregerspektrums sowie für die mikrobiellen Antibiotikaresistenzen und Virulenzfaktoren aufgebracht. Damit erlaubt der erfindungsgemäße Genchip die simultane Ermittlung dieser Parameter und ermöglicht so die einfache und schnelle Erstellung eines individuellen „Parodontitisprofils" für den jeweiligen Patienten zur besseren Prognose und Therapie dieser multifaktoriell bedingten Erkrankung.
Bei den Referenzsequenzen handelt es sich vorzugsweise um Nukleotidsequenzen, die entweder für das den Untersuchungsparameter codierende Gen bzw. den Genabschnitt oder den Erreger oder aber für Mutationen davon spezifisch sind. Entsprechendes gilt für die Komplementärsequenzen. Soll z.B. der erfindungsgemäße Chip der Untersuchung des Erregerspektrums dienen, können komplementäre Sequenzen der jeweiligen erregerspezifischen variablen Region des Gens für 16SrRNA als Sonde auf den Chip aufgebracht werden. Soll dagegen beispielsweise eine Analyse
bakterieller Resistenzgene erfolgen, können spezifische Oligonukleotidsequenzen aus den Resistenzgenen (oder dazu komplementäre Sequenzen) als Sonden verwendet werden. Ebenso können homologe Nukleotidsequenzen oder allelische Varianten davon als Sonden dienen.
Die als Sonden auf den Chip aufgetragenen Referenzsequenzen bzw. die Komplementärsequenzen können unterschiedlich lang sein. Vorzugsweise werden jedoch 16- bis 25-mere verwendet. Insbesondere eignen sich 15-mere.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform kann der Chip nicht nur der qualitativen Bestimmung sondern ebenso der Quantifizierung einzelner Erreger in der Untersuchungsprobe dienen. Dazu können die Sonden in einem großen Überschuß gegenüber der in der Patientenprobe zu erwartenden und amplifizierten Anzahl der Erreger aufgebracht werden. Nach erfolgter Hybridisierung auf dem Chip kann diese in einem Scanner quantitativ ausgewertet werden.
Vorzugsweise werden mit dem erfindungsgemäßen Chip die in Tabelle 9 aufgeführten Mikroorganismen untersucht. Damit werden einerseits Erreger erfaßt, deren Zusammenhang mit der Parodontitis nachgewiesen ist. Daneben werden jedoch auch orale Bakterien erfaßt, deren Beteiligung nur vermutet oder noch unklar ist. Darüber werden in dieser Ausführungsform auch Mikroorganismen nachgewiesen, die ebenso in der gesunden oralen Flora vorkommen oder an Karies beteiligt sind. Zusammenfassend werden alle diese Mikroorganismen als „Parodontitis assoziiert" bezeichnet. Damit wird ein quantitativer und qualitativer Überblick über das gesamte Erregerspektrum möglich, der eine Voraussetzung für die aussagekräftige Einschätzung des Stadiums der parodontalen Erkrankung sowie der Karies erlaubt. Dabei
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erfolgt auch der simultane Nachweis von allen bekannten humanen Herpesviren sowie von opportunistischen (fakultativ pathogenen) Erregern wie z. B. den Pilzorganismen Candida albicans und Aspergillus fumigatus bzw. Staphylococcen, Streptococcen, Pseudomonaden, etc.
Der erfindungsgemäße Genchip ermöglicht - wie bereits ausgeführt - die Ermittlung des individuellen Parodontitis-Profils eines Patienten. Die Kenntnis des Parodontitis-Profils ist jedoch nicht nur für die Verbesserung der Prognose und Therapie dieser Erkrankung hilfreich, sondern erbringt darüber hinaus auch Hinweise auf die Pathogenese von nach derzeitigem Kenntnisstand mit der Parodontitis assoziierten Erkrankungen. So wird beispielsweise ein Zusammenhang zwischen der Parodontitis und einem erhöhten Risiko für koronare Herzkrankheit vermutet, da die Bakterien nach neueren Untersuchungen offenbar in der Lage sind, einerseits mittels der durch den Bakterienbefall ausgelösten Zytokinproduktion das Gerinnungssystem spezifisch zu beeinflussen und so eine Atherogenese zu initiieren. Andererseits können auch die bakteriellen Oberflächenmoleküle und Proteasen oder auch die Bakterien selbst die Thrombozytenaggregation und -aktivierung induzieren [Offenbacher S, Madianos PN, Champagne CM, Southerland JH, Paquette DW, Williams RC1 Slade G, Beck JD (1999). Periodontitis-atherosclerosis syndrome: an expanded model of pathogenesis. J Periodontal Res, 34: 346-352.].
Auch ist es bekannt, daß eine schwere Parodontitis die Ausprägung der Symptome bei einem Diabetes-Patienten verstärken kann, indem den Kohlenhydratstoffwechsel beeinflussende Zytokine infektionsbedingt hochreguliert werden [Grossi SG, Genco RJ (1998). Periodontal disease and diabetes mellitus: a two-way relationship. Ann Periodontol, 3: 51-61.]. Darüber hinaus können orale Infektionen, insbesondere Parodontitis, ursächlich mit bakteriellen Pneumonien, Frühgeburten und einem niedrigen Geburtsgewicht zusammenhängen [Engebretson SP, LaIIa E, Lamster IB (1999). Periodontitis
and systemic disease. N Y State Dent J, 65: 30-32; Li X, Kolltveit KM, Tronstad L, Olsen I (2000). Systemic diseases caused by oral infections. Clin Microbiol Rev, 13: 547-558.]. Auch hier kann demnach der erfindungsgemäße Chip zur Verbesserung der Diagnose der Erkrankungen und anschließender Therapie beitragen.
Sofern der erfindungsgemäße Chip auch Sonden für Referenzsequenzen für Karieserreger (beispielsweise Actinomyces spec, Lactobacillus spec, Streptococcus spec, und Candida spec.) aufweist, kann er ebenso zur Kariesdiagnose verwendet werden, da das individuelle Kariesrisiko von der Art und Anzahl dieser Erreger abhängig ist [Kayser FH: Erreger bakterieller Infektionskrankheiten. In: Kayser FH, Bienz KA, Eckert J, Lindenmann J (Hrsg.) Medizinische Mikrobiologie: Immunologie, Bakteriologie, Mykologie, Virologie, Parasitologie, 1993, Begr. von E. Wiesmann, Thieme, Stuttgart, New York, p. 164; Raitio M, Pienihakkinen K, Scheinin A (1996). Multifactorial modeling for prediction of caries increment in adolescents. Acta Odontol Scand, 54: 118-121].
Ebenso kann der erfindungsgemäße Chip mit Sonden für Mikroorganismus spezifischen Referenzsequenzen zum qualitativen und ggf. auch quantitativen Nachweis von anderen Infektionskrankheiten dienen. Dies gilt insbesondere für opportunistische Infekte (z. B. Harnwegsinfekte, Wundinfekte, Hautinfektionen), die von fakultativ pathogenen bakteriellen Erregern wie z. B. S. aureus, E. coli, Enterobacter spec und Klebsieila spec, bei abwehrgeschwächten Patienten hervorgerufen werden. Das gleiche gilt auch für die Diagnostik opportunistischer Mykosen (Pilzerkrankungen), wie z. B. Kandidose, Aspergillose sowie humaner Herpesviren, die mit dem Genchip ebenso durchgeführt werden kann.
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Aufgrund des ubiquitären Vorkommens der durch den Genchip nachgewiesenen bakteriellen Resistenzgene, kann der Genchip auch zur Bestimmung von Antibiotikaresistenzen bei den Erregern beliebiger Infektionskrankheiten verwendet werden, z. B. zur Erklärung der häufigen Vielfachresistenzen bei Krankenhausinfektionen.
Vorteilhafterweise kann der erfindungsgemäße Chip zu Zwecken des jeweils ausgewählten Verwendungszweckes ausschließlich mit den dafür relevanten Sonden versehen sein. Soll beispielsweise mittels des Chips nur eine Analyse der Antibiotikaresistenzen erfolgen, kann aus Kostengründen der Chip nur die dafür relevanten Sonden tragen.
Neben den genannten Anwendungsmöglichkeiten in der praxisorientierten zahnmedizinischen und medizinischen Diagnostik kann der Genchip gleichzeitig ein geeignetes Mittel für die weitergehende Erforschung oraler Infektionen darstellen. Bei vielen Erregern wird die Beteiligung an der Entstehung der Parodontitis vermutet, ohne daß ihre Rolle endgültig geklärt wäre. Mit Hilfe des Genchips können kostengünstig groß angelegte Studien durchgeführt werden, bei denen eine große Anzahl von Parametern gleichzeitig an verschiedenen Patientenkollektiven untersucht werden kann.
Für den Zweck dieser Anmeldung werden die nachfolgenden Begriffe definiert als:
Der Begriff „Nukleotidsequenz" bezieht sich auf jede oligomere oder polymere Sequenz von Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden tierischen, menschlichen, mikrobiellen oder synthetischen Ursprungs. Die Nukleotide können neben Guanin, Cytosin, Thymin oder Adenin oder Uridin auch andere natürliche oder synthetische Basenanaloga enthalten. Der Begriff
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„Nukleotidsequenz" wird synonym mit „Nukleinsäure" oder „Oligonukleotid" verwendet.
Der Begriff „Nukleotidträger" bezieht sich auf alle festen oder halbfesten Träger, an die mindestens eine Nukleotidsequenz gebunden ist. Dieser Begriff ist synonym mit „Chip" oder „Genchip".
Der Begriff „Referenzsequenz" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen mit einer mindestens hinreichenden Spezifität für bestimmte Phänotypen oder Organismen, so daß ihr Vorhanden den Nachweis dieser Phänotypen oder Organismen erlaubt.
Der Begriff „Sonde" bezieht sich auf Nukleotidsequenzen, die zum Nachweis oder zur Identifizierung von Nukleotidsequenzen (Referenzsequenzen oder Komplementärsequenzen) verwendet werden. Sie können identisch oder komplementär zu der zu suchenden Nukleotidsequenzen sein oder eine Homologie dazu aufweisen. Ebenso können sie eine allelische Variante zu der zu suchenden Sequenz darstellen.
Der Begriff „Mikroorganismus" bezieht sich sowohl auf Bakterien als auch auf Viren, Pilze oder andere selbstreplizierende Strukturen.
Der Begriff „Hybridisierung" bezieht sich auf die Anlagerung zweier komplementärer oder teilkomplementärer Nukleinsäuren aneinander. Die Hybridisierung stellt einen wesentlichen Schritt in zahlreichen molekularbiologischen Verfahren dar. Mit diesen Techniken werden einzelne Gene oder Teile davon in einer DNA-Präparation oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol.
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2, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory press, 13.96-97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Academic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymology 1987, 152: p582-87; Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995, 270: pp.467-470.]
Der Begriff „Virulenzfaktor" bezieht sich auf alle Eigenschaften eines Mikroorganismus, die an der Entstehung und der Aufrechterhaltung einer Infektion beteiligt sind.
Der Begriff „Keimspektrum" oder „Erregerspektrum" bezieht sich auf die quantitative und/oder qualitative Zusammensetzung einer Population von Mikroorganismen.
Nachfolgend wird der erfindungsgemäße Nukleotidträger anhand von Ausführungsbeispielen des näheren erläutert. Die Nomenklatur der in den Tabellen in Bezug genommenen Gene bezieht sich dabei auf die GenBank des NCBI.
Beispiel 1:
Identifizierung und Quantifizierung Parodontitis-assoziierter bzw. oralpathogener Bakterien mit dem erfindungsgemäßen Genchip
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 1 aufgelisteten bakteriellen Referenzsequenzen werden als Sonden auf einem geeigneten Träger, z. B. mit Gold beschichtetem Glas, aufgebracht. Dazu dienen Standardtechniken, wie sie beispielsweise aus der DE 196 12 356 A1 und US 5
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837 832 A bekannt sind. Diese werden zu Zwecken der Offenbarung vollumfänglich in Bezug genommen. Dabei werden in der Regel 15-mere verwendet, es können jedoch auch 16- bis 25-mere zum Einsatz kommen.
Die Referenzsequenzen entsprechen jeweils den erregerspezifischen, variablen Regionen der Gene für die 16SrRNA (ribosomale RNA für die kleine Ribosomenuntereinheit). Die 16SrRNA-Gene (= 16SrDNA) werden ausgewählt, da durch die Anwendung universeller Primer eine PCR-Reaktion zur Erhöhung der Sensitivität der Hybridisierungsreaktion vorgeschaltet werden kann und da die entsprechenden Sequenzen in allen zu untersuchenden Bakterien bekannt sind. Zu Kontrollzwecken werden die zu den Referenzsequenzen komplementären Sonden in vielfacher Kopie auf je zwei nebeneinander liegende Felder auf den Träger aufgebracht. Für die 60 in der Tabelle 1 aufgeführten Erreger (s. Tabelle 1) werden demnach 60 spezifische Sonden verwendet werden, so dass sich insgesamt 120 Felder auf dem Chip ergeben. Dabei enthalten z.B. Feld 1.1 und Feld 1.2 zur Detektion des Actinobacillus actinomycetemcomitans jeweils eine Vielzahl der Sequenz CAGCGTCAGTACATC (komplementär zur Referenzsequenz GATGTACTGACGCTG; Tabelle 1, Zeile 1). Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 wird die Sequenzinformation der Zeile 2 der Tabelle 1 verwendet usw.
Die Quantifizierung erfolgt durch den Einsatz der DNA bekannter Bakterienmengen auf dem Chip und die Korrelation der Bakterienzahl zu den Signalstärken bei der Chip-Auswertung.
Tabelle 1: Referenzsequenzen der 16SrRNA-Gene ausgewählter Bakterienspezies, deren komplementäre Sequenzen als Sonden auf den Genchip aufgebracht werden
Nr. Bakterienart 16SrDNA-Refer-
• · t ·
Actinobacillusactinomycetemcomitans enzsequenz
1 Porphyromonas gingivalis GATGTACTGACG
CTG
2 Prevotella intermedia TCAGCGGTGAAA
CCT
3 Bacteroides forsythus ATCTACCTTGCA
GCG
4 Treponema denticola GA-
TAAAATTGCCGT
T
5 Campylobacter rectus CTACGAGCTCAA
CTC
6 Eubacterium nodatum GTATACAATAAG
ACG
7 Eikenella corrodens TGTCGTATGCCC
CGC
8 Selenomonas noxia TTATTTAAGCAG
GAT
9 Fusobacterium nucleatum subspecies
nucleatum 		ATGTAAGGATGG
GCA
10 Peptostreptococcus micros GCAAAGCCGTG
AGGT
11 Prevotella nigrescens TCATTAAGCATT
TGA
12 Streptococcus intermedius CCTGCGGGAGT
GTTA
13 GACTTAGTGCCG
- 17 -
Streptococcus mutans CAG
14 Actinomyces viscosus TAGTGTGCTCTG
GAA
15 Treponema socranskii GGTCTCTGGGC
CGCT
16 Treponema pectinovorum CAACTCCGGAG
CTAT
17 Treponema vincentii TAACCCCAGAAC
TGC
18 Treponema lecithinolyticum TTATGTAAGCCT
GGT
19 Campylobacter concisus CACATCTTGAAT
TAC
20 Campylobacter gracilis ATATACAATGAG
AAG
21 Campylobacter sputorum AGACGCAATATC
GTA
22 Eubacterium brachy CAGTTAGGCTGA
GCA
23 Eubacterium timidum ATTGTTCGCCCT
ATG
24 Eubacterium lentum CTCTACATGCCT
TGC
25 Pseudoramibacter alactolyticus GAGGGAATCCC
TCAA
26 TTGCTGGGCAG
ATAC
- 18 -
27 Selenomonas sputigena CAAACCATCCCC
CAG
28 Fusobactenum periodonticum GAAACTGCATAA
CTA
29 Peptostreptococcus anaerobius TCAACCGTAGTT
AGC
30 Prevotella melaninogenica TGACGGGAGCG
CAAC
31 Wolinella succinogenes GTTGAACTGCAT
TTG
32 Veillonella parvula CGGATCAGTCA
GTCT
33 Veillonella dispar ACTGCCAATCTA
GAG
34 Centipeda periodontii GACTGAAGTTAC
TAG
35 Dialister pneumosintes TCGCAATCCATA
GAA
36 Porphyromonas endodontalis TAGGTGGCGTAT
TAA
37 Streptococcus salivarius AAAGTTACTTCG
GTA
38 Streptococcus sobrinus TCAACCAATGTA
TGC
39 Streptococcus sanguis TTAACCATAGTA
TGC
40 Lactobacillus casei GAGGAAGCGCA
Lactobacillus (Olsenella) uli TCGG
41 Lactobacillus (Atopobium) rimae CCCGCCCGCTC
CCGA
42 Actinomyces naeslundii TCCGCCCGCTC
CCGA
43 Actinomyces odontolyticus TGCCGGTCTGCT
CCG
44 Actinomyces israelii CACGGCGGCAC
TGCA
45 Capnocytophaga gingivalis GCCTCCCI I I I I
GGG
46 Capnocytophaga ochracea GGGGACTAACA
GACA
47 Capnocytophaga sputigena TCGTTCAGCTCA
ACT
48 Bacteroides fragilis TATTACTAACAA
TTT
49 Bacteroides ureolyticus CTGGTAAGT-
CAGTTG
50 Chlamydia pneumoniae GATCTGCTGGAA
CCT
51 Chlamydia trachomatis TGTTAAATTTTG
GGG
52 Staphylococcus aureus TGTCAAA-
GATCGGGG
53 AGAGCCTTCCCC
TTC
54 Escherichia coli CTGATACTGGCA
AGC
55 Enterobacter cloacae TCAACCTGGGG
AACT
56 Enterobacter agglomerans GAATTTGGCAGA
GAT
57 Klebsiella pneumoniae GATTGGTGCCTT
CGGGAACTG
58 Klebsieila oxytoca CTTTGGTGCCTT
CGGGAACTC
59 Pseudomonas aeruginosa TGGTTCAGCAAG
TTG
60 Propionibacterium acnes GGAAGTGTAATC
TTG
Beispiel 2:
Identifizierung und Quantifizierung Parodontitis-assoziierter bzw. oralpathogener Pilze/Hefen mit dem erfindungsgemäßen Genchip
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 2 aufgelisteten Referenzsequenzen werden nach der unter Beispiel 1 beschriebenen Methode auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet. Die Referenzsequenzen werden aus den bereits geschilderten Gründen so gewählt, dass sie den spezifischen, variablen Regionen der Gene für die 28SrRNA (ribosomale RNA für die große Ribosomenuntereinheit) entsprechen. Die 28SrRNA-Gene (= 28SrDNA) werden als Target gewählt, da auch hier durch die Anwendung universeller Primer eine PCR-
«&iacgr; »■■
- 21 -
Reaktion zur Erhöhung der Sensitivität der Hybridisierungsreaktion vorgeschaltet werden kann und da die entsprechenden Sequenzen in den zu untersuchenden Pilzorganismen bekannt sind. Für die in Tabelle 2 aufgeführten 9 Pilzarten müssen 9 spezifische Sonden in je zwei Feldern verwendet werden, so dass sich insgesamt 18 Felder auf dem Chip ergeben. Die Feld 1.1 und Feld 1.2 enthalten zur Detektion des Pilzorganismus Candida albicans z.B. die Sequenz CGTCAGAGGCTATAA (komplementär zur normalen Referenzsequenz TTATAGCCTCTGACG; Tabelle 2, Zeile 1). Die Quantifizierung erfolgt durch den Einsatz der DNA bekannter Pilzmengen auf dem DNA-Chip und Korrelation der Organismenzahl zu den Signalstärken bei der Chip-Auswertung.
Tabelle 2: Liste der Nukleinsäuresequenzen der 28SrRNA-Gene der Pilzorganismen, deren komplementäre Sequenzen als Sonden auf den Genchip aufgebracht werden
Nr. Pilzspezies 28SrDNA-Refe-
renzsequenz
1 Candida albicans TTATAGCCTCTGA
CG
2 Candida glabrata CTTGGGACTCTC
GCA
3 Candida krusei TACACGGCCGCA
GTC
4 Candida parapsilosis GCGGTAGGATAA
GTG
5 Candida tropicalis TAGGA-
GAATTGCGTT
6 Cryptococcus neoformans GTATTCCCTTTAG
Aspergillus fumigatus AC
7 Aspergillus flavus CCTCGGAATGTAT
CA
8 Saccharomyces cerevisiae CCCGGAATGTAG
TGC
9 CATAGGAATGTA
GCT
Beispiel 3:
Identifizierung humaner Herpesviren mit dem erfindungsgemäßen Genchip
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 3 aufgelisteten Referenzsequenzen werden mittels der bereits beschriebenen Methodik auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet. Die Sequenzen für den Nachweis der 8 bekannten humanen Herpesviren werden so gewählt, dass sie zu den spezifischen, variablen Regionen des Gens für die virale DNA-Polymerase komplementär sind. Die DNA-Polymerase wird als Target gewählt, da auch hier durch die Anwendung universeller Primer eine PCR-Reaktion zur Erhöhung der Sensitivität der Hybridisierungsreaktion vorgeschaltet werden kann.
Für die in Tabelle 3 aufgeführten 9 Herpesvirustypen (HHV-6 wird in Typ A und Typ B unterteilt) werden 9 spezifische Sonden auf je zwei Felder gebracht, so dass sich insgesamt 18 Felder auf dem Chip ergeben. Die Feld 1.1 und Feld 1.2 enthalten z.B. zur Detektion des Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) die Sequenz AGGTGCGCCACTGCG (komplementär zur normalen Referenzsequenz CGCAGTGGCGCACCT; Tabelle 3, Zeile 1). Die Quantifizierung erfolgt durch den Einsatz der DNA bekannter Virusmengen auf dem
DNA-Chip und die Korrelation der Virusanzahl zu den Signalstärken bei der Chip-Auswertung.
Tabelle 3: Liste der Nukleinsäuresequenzen der humanen Herpesviren, deren komplementäre Sequenzen als Sonden auf den Genchip aufgebracht werden
Nr. Humanes Herpesvirus Referenzsequenz
1 Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) CGCAGTGGCGCA
CCT
2 Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) CCTGGAGGCGGA
CCG
3 Varizella-Zoster Virus (VZV) TCTGAAGAACTTC
CG
4 Zytomegalievirus (CMV) TGGCGAGTACCC
TGT
5 Epstein-Barr Virus (EBV) CGTGAGCCTGAA
GGA
6 Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6) Typ A ACAGACTCACGG
ATA
7 Humanes Herpesvirus 6 (HHV-6) Typ B ACAGACTCGCGA
ACA
8 Humanes Herpesvirus 7 (HHV-7) CGGGGTTGTTAC
ACA
9 Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8) TTTGTCCTCAGCG
GA
Beispiel 4: Identifizierung bakterieller Resistenzgene mit dem erfindungsgemäßen Genchip
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 4 aufgelisteten Referenzsequenzen werden wie bereits beschrieben auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet.
Die Referenzsequenzen werden so gewählt, dass sie den spezifischen Resistenzgen-Regionen entsprechen. Bei hoher Sequenzhomologie (z. B. fem-Gene) ist die Auswahl eines spezifischen Oligonukleotids für jedes Resistenzgen nicht notwendig, sondern eine Sonde kann dazu verwendet werden, mehrere (im Beispiel 2 bis 16, s. Tabelle 4) verwandte Referenzsequenzen gleichzeitig zu identifizieren. Für die ausgewählten Resistenzgene (s.o.) werden 68 spezifische Oligonukleotide auf je zwei Feldern verwendet, so dass sich insgesamt 136 Felder auf dem Chip ergeben. So enthalten z.B. die Felder 1.1 und Feld 1.2 zur Detektion des feiA-Gens die Sequenz CCCACACCGTTGCGG (komplementär zur normalen Referenzsequenz CCGCAACGGTGTGGG; Tabelle 3, Zeile 1).
Tabelle 4: Liste der Nukleinsäuresequenzen der bakteriellen Resistenzgene, deren komplementäre Sequenzen auf den Genchip aufgebracht werden.
Nr. Resistenzgen Referenzsequenz
1 tetA CCGCAACGGTGT
GGG
2 tetB CGCGCGGGCGAA
CGG
3 tetC TTTCTAAGGCAGA
CC
4 tetD GCGGCTGTTCAA
- 25 -
fefE AAA
5 tetF GCAGAGGCGCAA
CTA
6 tetG GGGGGAACATTC
AAT
7 tetH AGGAGACTAATC
GCA
8 tetK AAGCCTCTACTTT
TG
9 tetL CTGGAACCATGA
GTG
10 tetM TTTAGCGTATTAA
AT
11 tetO GGCAATTCTACTG
AT
12 tetQ CCGTATACTGTTT
CA
13 tetS ATCTGGAATGGA
GTG
14 tetT TCAGAGTACAAGT
TA
15 tetV GACCTTTTATCAG
CG
16 tetX CGACGATGTATAT
cc
17 AAAATGTAAAGCC
CG
♦·
It ·
tii * * *
- 26 -
18 tefZ GAGCCCAATGGC
GTC
19 tem-1, tem-6, tem-17 TGAGCGTGGGTC
TCG
20 tem-2 TGAGCGTGGTTC
TCG
21 tem-3, tem-10, tem-21, tem-52, tem-53,
tem-54, tem-59, tem-70, tem-76, tem-77,
tem-78, tem-79 		TAGAGTAAG-
TAGTTC
22 tem-12, tem-20, tem-22, tem26B, tem-60 TGAGCGTGGATC
TCG
23 tem-28, tem-29, tem-43 AACACTGCTGCC
AAC
24 tem-47, tem-48, tem-49, tem-68, tem-72 GGAGCCAGTAAG
CGT
25 tem-91 TCGCCTTGATTGT
TG
26 oxa-1 AAGATCGCATTAT
CA
27 oxa-2, oxa-15 AAGATACCTCATA
CA
28 oxa-3 CGGCCTCGACAT
TCA
29 oxa-5 CAGCTTCCACGTT
CA
30 oxa-7, oxa-10, oxa-14, oxa-16, oxa-19,
oxa-28, oxa-31 		AAGATCCCCAAC
GCA
■*■* *
• ·
- 27 -
31 oxa-11, oxa-17 TACCAATGACTTA
GC
32 oxa-13, oxa-19 TACCAATAACTTA
GC
33 oxa-15, oxa-32 AGTTGTGGCAGA
CGA
34 oxa-18 CACGCTTGTTATC
GA
35 oxa-20 AATCCCGGGCTC
AGC
36 oxa-22 AGGCAAGTGCGA
CGA
37 oxa-23, oxa-25, oxa-26 TGCACGAGCAAA
TAA
38 oxa-27 AAGCCGCGCAAA
TAC
39 oxa-30, oxa-33 AAGTGTGCAACG
CAA
40 carb-2, carb-3, carb-6, pse-1, pse-5 CAATAGCTTGCG
CTA
41 carb-4 CAATAGCTTGTGC
TA
42 carb-5 CACTTGCCTGTG
CAA
43 shv-1, shv-2, shv-5, shv-6, shv-7, shv-8,
shv-11, shv-12, shv-13, shv-14, shv-18,
shv-24, shv-25, shv-26, shv-27, shv-28 		GGCCGCACGCTG
ACC
■· ♦·
■·■* «
- 28 -
44 nimA CAGGCAGCATCC
CGA
45 nimB GGTAGAACAGGA
TGA
46 nimC GATGCGGAACGA
CAA
47 nimD CCTGCGGAATGA
CAA
48 nimE TGTGGAACAAGA
CAA
49 ermA GATCGATACTTTT
TG
50 ermB, ermAM AGACAGTCATCTA
TT
51 ermC, ermM GATAAGTGAGCT
ATT
52 ermD, ermK GGAAAACGATTCT
AA
53 ermE CGACCCCCGGCT
GGC
54 ermF TGAAAACGACAC
AGC
55 erm G GGTAAAGAGATG
TAA
56 ermJ AAGTCAAAAAGC
CGG
57 ermQ TACAGCTATAGAA
- 29 -
ermT, ermGT CT
58 ermTR TAACCGCCATTGA
AA
59 mefA, mefE ACATTTTACCAAG
GA
60 mphA, mphK TGGTCTTGTCTAT
GG
61 mphB CGCCACCGTCGA
CGA
62 mphBM TTTGCACAAGATA
AT
63 msrA GAGTAGAATGGG
TTT
64 ereA GTACTTTAATTAT
AG
65 ereB CTCACTTGTTGGC
GT
66 HnA GGTTCATACTTAC
CA
67 HnB GTTAGATGGTGG
CTG
68 ACGTAGCTCCGT
ACT
Beispiel 5:
Identifizierung von Resistenz auslösenden Mutationen in bakteriellen Antibiotika-Zielmolekülen (DNA-Gyrase, Topoisomerase IV) mit dem erfindungsgemäßen Chip
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 5 aufgelisteten Referenzsequenzen werden in der beschriebenen Methodik als Sonden auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet, es können jedoch auch 16- bis 25-mere zum Einsatz kommen. Die Sequenzen werden dabei so gewählt, dass die in der mutierten Referenzsequenz vorhandene Sequenzabweichung etwa in der Mitte liegt.
Die Sonden werden jeweils nur auf ein Feld aufgebracht. Bezüglich der bisher bekannten Mutationen in den gyrA- und pa/C-Genen oraler Streptokokken bzw. im gyrß-Gen von T. denticola ergeben sich 22 Felder, wobei z. B. das Feld 1.1 die Sequenz CCGTCCTTGTAGACC (komplementär zu der normalen Referenzsequenz GGTCTACAAGGACGG, Tabelle 5, Nr. 1 (Zeile 1), Spalte 3), das Feld 1.2 die entsprechende komplementäre, mutierte Referenzsequenz CCGTCCTCGTAGACC (komplementär zu der mutierten Referenzsequenz GGTCTACGAGGACGG, Tabelle 5, Nr. 1 (Zeile 1), Spalte 4; Mutation unterstrichen) trägt. Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 wird die Sequenzinformation der Nr. 1 (Zeile 2) der Tabelle 5 (gyrß/Lys136Thr) verwendet usw.
Tabelle 5: Liste der Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequenzen auf den Genchip aufgebracht werden (es wird nur der zentrale Bereich der 15- bis 25-mere gezeigt, die Position mit Bezug auf die Wildtyp-Referenzsequenz wird durch Angabe der Codon-Nr. spezifiziert). Zu jeder mutierten Referenzsequenz wird an definierter Stelle auf dem Träger die entsprechende komplementäre Sequenz (siehe 3. Spalte) aufgebracht.
Nr.
Gen/Kodon-Nr.
normale Refe-
mutierte Refe-
Aminosäure-
■■« ·
<»·■·&diams;
· t ·■ ·
- 31 -
gyrB/136
(Treponema denticola) 		renzsequenz renzsequenz aus
tausch
1
2 		gyrA/83
(Streptococcus sanguis) 		AAG
AAG		 GAG
AQG		 Lys-Glu
Lys-Thr
3
4 		gyrA/83
(Streptococcus anginosus) 		TCT
TCT		 &Tgr;&Dgr;&Tgr;
TTJ		 Ser-Tyr
Ser-Phe
5 gyrA/87
(Streptococcus sanguis ) 		TCC TTC Ser-Phe
6 gyrA/87
(Streptococcus anginosus) 		GAA AAA Glu-Lys
7 parC/79
(Streptococcus sanguis) 		GAA CAA GIu-GIn
8
9 		parC/79
(Streptococcus anginosus) 		AGT
AGT		 TJT
ATT		 Ser-Phe
Ser-Ile
10
11 		AGC
AGC		 TJA
ATC		 Ser-Leu
Ser-Ile
Beispiel 6: Identifizierung bakterieller Gene für Virulenzfaktoren
Um Aussagen über die Aggressivität der an der individuellen Erkrankung beteiligten Bakterienstämme treffen zu können, enthält der erfindungsgemäße Genchip in dieser Ausführungsform Oligonukleotidsonden, die Gene für bestimmte Virulenzfaktoren detektieren können. Es werden die Gene für die Virulenzfaktoren Leukotoxin, Kollagenase und Fimbrillin von den Parodontitis-assoziierten Erregern A. actinomycetemcomitans und P. gingivalis
'it ■ ··
&bull; &diams;··
»■■« ·
- 32 -
für den Chip ausgewählt, da hier schon (z. T. eindeutige) Zusammenhänge mit der Virulenz der Bakterienstämme erkannt werden konnten.
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 6 aufgelisteten Referenzsequenzen werden mittels der bereits beschriebenen Methodik auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet, es können jedoch auch 16- bis 25-mere zum Einsatz kommen.
Die Referenzsequenzen werden so gewählt, dass sie den die Virulenzfaktoren codierenden spezifischen Genregionen entsprechen. Die dazu komplementäre Sonden werden auf je zwei Felder auf den Träger aufgebracht. Für 8 Virulenzfaktoren (s. Tabelle 6) müssen 8 spezifische Sonden verwendet werden, so dass sich insgesamt 16 Felder auf dem Chip ergeben. So enthalten die Felder 1.1 und Feld 1.2 zur Detektion des fimA (Typ I)-Gens von Porphyromonas gingivalis die Sequenz GATGGTGGCATTACC (komplementär zur normalen Referenzsequenz GGTAATGCCACCATC; Tabelle 6, Zeile 1).
Tabelle 6: Liste der Nukleinsäuresequenzen der bakteriellen Gene für Virulenzfaktoren, deren komplementäre Sequenzen auf den Genchip aufgebracht werden
Nr. Virulenzfaktor-Gen Referenzsequenz
1 fimA (Typ I) v. P. gingivalis GGTAATGCCACCATC
2 fimA (Typ II) v. P. gingivalis GGTAATGCTACCATC
3 fimA (Typ III) v. P. gingivalis AGTAATGCTACCATC
4 fimA (Typ IV) v. P. gingivalis AGCGGAGAGGGGCGT
5 fimA (Typ V) v. P. gingivalis GCTGGCTCGCCACAA
6 prtC (Kollagenase) v. P. gingivalis CGCTCTGTGTATGGC
7 //ei Promotor v. A. actinomycetemcomitans
(geringe Leukotoxizität) 		CTTGTCGCAAGTGCCA
8 Ikt Promotor (Deletion) &ngr;. &Agr;. actinomycetem
comitans (hohe Leukotoxizität) 		GCTGGA-
TATTGTGGTTTGGT
Beispiel 7:
Identifizierung von Polymorphismen (Mutationen) in Parodontitis-Risiko-assoziierten Genen
Auf dem Genchip werden die bekannten Genpolymorphismen bzw. AIIeIe nachgewiesen, die mit dem Parodontitis-Risiko assoziiert sind. Darüber hinaus werden Sonden eingesetzt, die Genpolymorphismen detektieren, die bisher noch nicht mit der Parodontitiserkrankung, wohl aber mit anderen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht werden konnten. Diese werden ebenso unter den Begriff der &ldquor;Parodontitis assoziierten Polymorphismen" gefaßt.
Die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 7 aufgelisteten Referenzsequenzen werden - wie bereits beschrieben - auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet, es können jedoch auch 16- bis 25-mere zum Einsatz kommen. Die Sequenzen werden dabei so gewählt, dass die in der komplementären, mutierten Referenzsequenz (hier als AIIeI 2 bezeichnet) vorhandene Sequenzabweichung etwa in der Mitte liegt.
Die Sonden werden jeweils nur auf ein Feld auf den Träger aufgebracht. Bezüglich der in diesem Beispiel genannten humanen Polymorphismen (s. Tabelle 7) ergeben sich 18 Felder, wobei z. B. das Feld 1.1 die Sequenz
4 A
- 34 -
AAAGGTGCTGACCTA (komplementär zu der normalen Referenzsequenz TAGGTCAGCACCTTT; Tabelle 7, Zeile 1, Spalte 3), das Feld 1.2 die entsprechende komplementäre, mutierte Referenzsequenz AAAGGTGATGACCTA (komplementär zu der mutierten Referenzsequenz TAGGTCATCACCTTT, Tabelle 7, Zeile 1, Spalte 4; Mutation unterstrichen) trägt. Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 wird die Sequenzinformation der Zeile 2 der Tabelle 7 (IL-1B (-511)) verwendet usw.
Tabelle 7: Liste der Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequenzen auf den Genchip aufgebracht werden (es wird nur der zentrale Bereich der 15- bis 25-mere gezeigt). Zu jeder zur Referenzsequenz von AIIe11 komplementären Sequenz wird an definierter Stelle auf dem Träger die komplementäre Sequenz von AIIeI 2 (s. Spalte 3) aufgebracht.
Nr. Gen Referenzsequenz Referenzsequenz
(Position) AIIe11 AIIeI 2
1 IL-1A AGC ATC
(+4845)
2 IL-1 B (- CCG CTG
511)
3 IL-1B TCG TTG
(+3954)
4 IL-1 RA CTG CCG
(+2018) (korreliert mit 4 &khgr; (korreliert mit 2 &khgr;
86bp-VNTR (AIIeM) 86bp-VNTR (AIIeI 2)
X «·
«a « ·■·■«■
- 35 -
TNFa C-
308J		 in intron 2) in intron 2)
5 &Ggr;&Lgr;/For C-
238;		 GGG GAG
6 TNFß
(+252) 		CGG CAG
7 FcyRIIA
(+494) 		GGT GAT
8 Fc7RIHA
(+559) 		CGT CAT
9 TGT TJT
Beispiel 8:
Simultaner Nachweis von Parodontitis-assoziierten Mikroorganismen, Antibiotika Resistenzen, Virulenzfaktoren und humanen Parodontitisassoziierten Genpolymorphismen
Wie in den Beispielen 1 bis 7 beschrieben, wird ein Genchip mit 15- bis 25-mere Oligonukleotidsonden hergestellt. Die Sonden sind dabei komplementär zu den Referenzsequenzen der Mikroorganismen (Bakterien, Pilze/Hefen, Herpesviren), der Antibiotikaresistenzgene und der Virulenzfaktoren bzw. komplementär zu den bekannten mutierten/polymorphen Abschnitten bzw. normalen Referenzsequenzen der Antibiotika-Zielmolekül-Gene sowie der Parodontitis-Risiko-assoziierten
&bull; ·
&Igr;&kgr;.&pgr;&kgr;.
- 36 -
Gene. Die Anzahl der benötigten Hybridisierungsstellen für die genannten Parameter ist in Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Parodontitis-Diagnostik mit einem erfindungsgemäßen Genchip. Es werden jeweils zwei Felder mit einer Sonde belegt.
Gentyp Anzahl der
Gene 		Ziel des Hybridi-
sierungs-nach-
weises 		Hybridisie
rungstellen
16SrDNA
(Bakterien)		 75 Identifikation und
Quantifizierung		 150(2x75)
28SrDNA
(Pilze/Hefen)		 9 Identifikation und
Quantifizierung		 18(2x9)
virale DNA-
Polymerase
(Herpesviren)		 9 Identifikation 18(2x9)
Tetracyclin-Resi-
stenz		 18 Identifikation 36(2x18)
ß-Lactamase (ß-
Lactam-
Antibiotika-
Resistenz)		 80 Identifikation 50 (2 &khgr; 25)
5-Nitroimidazol-
Resistenz		 5 Identifikation 10(2x5)
Macrolid-
Antibiotika-
Resistenz		 26 Identifikation 40 (2 &khgr; 20)
&bull; ··■
- 37 -
bakterielle DNA-
Gyrase Unterein
heit A (gyrA) 		2 Mutationsdetektion 10
bakterielle DNA-
Gyrase Unterein
heit B (gyrB) 		1 Mutationsdetektion 4
bakterielle Topoi-
somerase IV
(parC) 		2 Mutationsdetektion 8
Fimbrillin-Gen
fimA (5 Typen v.
P. gingivalis) 		5 Identifikation 10(2x5)
Kollagenase-Gen
prtC v. P. gingi
valis 		1 Identifikation 2
Leukotoxin (/W)-
Promotorregion
v. A. actinomy-
cetemcomitans 		2 Identifikation 4 (2 &khgr; 2)
Interleukin 1 A
(IL-1A)		 1 Mutationsdetektion 2
Interleukin 1 B
(IL-1B)		 1 Mutationsdetektion 4
Interleukin 1 Re
zeptor		 1 Mutationsdetektion 2
Interleukin 4 (IL-
4)		 1 Mutationsdetektion 4
Interleukin 4 Re- 1 Mutationsdetektion 2
zeptor 1 Mutationsdetektion 2
lnterleukin 6 (11-6) 1 Mutationsdetektion 2
Interleukin 1
Rezeptor An
tagonist (IL-1 RA)		 1 Mutationsdetektion 4
Tumornekrose-
faktor &agr; (TNFa)		 1 Mutationsdetektion 2
Tumornekrose-
faktor &bgr; (TNFß)		 1 Mutationsdetektion 2
FcyRIIA 1 Mutationsdetektion 2
FcyRIIIA 1 Allelidentifikation 4 (2 &khgr; 2)
FcyRIIIB 1 Allelidentifikation 6 (2 &khgr; 3)
HLA-A9 (3 häu
figste AIIeIe)		 1 Allelidentifikation 12(2x6)
HLA-B15 (6 häu
figste AIIeIe)
Beispiel 9:
Simultaner Nachweis von Parodontitis-assoziierten Mikroorganismen, Resistenzgenen, Virulenzfaktoren und humanen Parodontitis-assoziierten Genpolymorphismen mit einem nicht-komplementären DNA-Chip
In diesem Beispiel werden nicht die komplementären Nukleinsäuresequenzen der in Tabelle 1-7 aufgelisteten Referenzsequenzen, sondern die Referenzsequenzen direkt als Sonden mit Hilfe von Standardtechniken auf einen geeigneten Träger aufgebracht. Analog zu den Beispielen 1 bis 8 werden in der Regel 15-mere verwendet, es können jedoch auch 16- 25-mere zum Einsatz kommen. Zu Kontrollzwecken werden die spezifischen Sonden jeweils auf zwei Felder nebeneinander auf den Träger aufgebracht; z. B. enthalten Feld 1.1 und Feld 1.2 zur Detektion des Keims Actinobacillus
- 39 -
-&ugr;&ogr;·
acfmomycetemcomitans die Sequenz GATGTACTGACGCTG (entsprechend der normalen Referenzsequenz s. Tabelle 1, Zeile 1).
Im Falle der Mutationsdetektion werden die Sequenzen wiederum so gewählt, dass die Sequenzabweichung etwa in der Mitte der Oligonukleotidsonden liegt. Die Sonden zur Mutationsdetektion werden auch hier so auf den Träger aufgebracht, dass sich auf den einzelnen Feldern jeweils nur eine Variante der Oligonukleotide befindet, z. B. enthält Feld 2.1 die normale Referenzsequenz TAGGTCAGCACCTTT (Tabelle 7, Zeile 1, Spalte 3), das Feld 2.2 die entsprechende mutierte Referenzsequenz TAGGTCAT-CACCTTT (Tabelle 7, Zeile 1, Spalte 4; Mutation unterstrichen).
Durch die Wahl geeigneter Primer für die zum Nachweis der Hybridisierung notwendige Markierungsreaktion wird sichergestellt, dass die markierten Genabschnitte komplementär zu den auf dem DNA-Chip aufgebrachten ON-gonukleotidsequenzen sind.
Beispiel 10
Quantifizierung bakterieller Erreger mittels des erfindungsgemäßen Genchips
Die komplementären Nukleinsäuren der in Tabelle 1 aufgeführten bakteriellen Referenzsequenzen werden in der bereits beschriebenen Methodik als Sonden auf einen Träger aufgebracht. Dabei werden vorzugsweise 15-mere verwendet. Es sind aber auch 16 - 25-mere möglich. Die Sonden belegen jeweils zwei Felder.
- 40 -
Die Sonden werden jeweils in großem Überschuß zu der erwartungsgemäß maximal in der Patientenprobe vorhandenen Bakterienanzahl einer Spezies (ca. 107 bis 108, von der nur ca. 1% (=105 bis 106) für die Analyse eingesetzt wird) aufgebracht, d.h. pro Feld werden ca. 1010 bis 1011 identische Sondenmoleküle verwendet. Diese Mengen werden durch den Einsatz definierter Volumina von konzentrierten Oligonukleotidlösungen in einem Chip-Spotter Gerät eingestellt.
Die Quantifizierung der Keime ist unter der Annahme möglich, daß die Effizienz der PCR-Amplifikation, die mit einem fluoreszenzmarkierten Primerpaar, das die 16SrRNA aller Bakterien erkennt, durchgeführt wird, für alle Erreger entsprechend ist. Dies ist aufgrund der Ähnlichkeit der bakteriellen 16SrRNA-Gene anzunehmen und kann durch den Einsatz der DNA bekannter Bakterienmengen auf dem Chip überprüft werden. Durch die Standardisierung der Chip-Produktion und der Hybridisierungsbedingungen ist es auf diese Weise möglich, anhand der Fluoreszenzstärken die Bakterienzahl zu ermitteln.
Anhang
Tabelle 9: Orale Mikroorganismen, die mit dem Parodontitis-Genchip erkannt werden.
Oralpathogener Organis Klassi Grad der As Erkrankungstyp/Merkm
mus fikation soziation mit ale*
Parodontaler-
krankungen*
Actinobacillus actinomyce- Bacteria sehr hoch bisher am besten unter
temcomitans sucht, Leitkeim der LJP,
zu ca. 40% an AP betei
ligt, zahlreiche Virulenz-
Bacteria sehr hoch faktoren, antibiotische
Therapie immer not
wendig
Porphyromonas gingivalis Bacteria sehr hoch häufig in großer Zahl bei
fortgeschrittener AP,
zahlreiche Virulenzfak
toren, kaum in gesun
dem Zahnfleisch nach
weisbar
Bacteroides forsythus Bacteria sehr hoch oft in sehr hoher Zahl bei
refraktärer Parodontitis,
häufigster Keim bei par-
odontalen Erkrankungen
Treponema spec. (T.
pectinovorum, T. socranskii,
T. vincentii, T. lecithino-
lyticum) 		Bacteria hoch T. spec, können bis zu
50% der mikrobiol. Flora
bei ANUG und AP re
präsentieren, <1% an
gesunden Stellen, zahl
reiche Virulenzfaktoren,
z. T. nicht kultivierbar
Treponema denticola Bacteria hoch am besten charakteri
sierter oraler Spirochaet,
Auftreten korreliert stark
mit parodontalem Kno
chenabbau
Prevotella intermedia Bacteria hoch erhöht bei ANUG und
AP, wahrscheinlich mit
verantwortlich für re-
fraktäre Formen der PA
Campylobacter rectus höhere Anzahl an er-
- 42 -
Bacteria hoch krankten Stellen mit akti
ver parodontaler Zerstö
rung, Leukotoxinproduk-
tion
Eubacterium nodatum Bacteria mittel deutlich häufiger an PA-
erkrankten Stellen
Eikenella corrodens Bacteria mutmaßlich höhere Anzahl an er
krankten Stellen mit akti
ver parodontaler Zerstö
rung, sowie bei therapie-
resistenter Parodontitis,
manchmal an LJP betei
ligt
Selenomonas noxia Bacteria mittel signifikant häufiger an
&Rgr;&Agr;-erkrankten Stellen
Fusobacterium nucleatum Bacteria mittel häufig bei RPP
Peptostreptococcus micros Bacteria mittel höhere Anzahl an er
krankten Stellen mit akti
ver parodontaler Zerstö
rung, häufig bei schwe
rer generalisierter Par
odontitis
Prevotella nigrescens Bacteria mittel assoziiert mit Gingivitis
Streptococcus intermedius Bacteria noch unklar häufig bei RPP, signifi
kant höhere Keimzahl in
Nichtrauchern mit early-
onset (EO) PA als in
Rauchern
Streptococcus mutans wichtiger Karieserreger
Actinomyces viscosus Bacteria noch unklar wichtiger Karieserreger
Campylobacter concisus Bacteria mutmaßlich signifikant höhere Keim
zahl in Rauchern mit
early-onset (EO) PA als
in Nichtrauchern
Campylobacter gracilis Bacteria mutmaßlich signifikant höhere Keim
zahl in Rauchern mit
early-onset (EO) PA als
in Nichtrauchern
Campylobacter showae Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Campylobacter sputorum Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Eubacterium brachy Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Eubacterium timidum Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Eubacterium lentum Bacteria mutmaßlich signifikant höhere Keim
zahl in Nichtrauchern mit
early-onset (EO) PA als
in Rauchern
Eubacterium sabureum Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Pseudoramibacter alactoly-
ticus 		Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Selenomonas sputigena Bacteria mutmaßlich signifikant höhere Keim-
- 44 -
Bacteria mutmaßlich zahl in Rauchern mit
early-onset (EO) PA als
in Nichtrauchern
Fusobacterium periodon-
ticum 		Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Peptostreptococcus
anaerobius 		häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Prevotella melaninogenica Bacteria noch unklar häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Wolinella succinogenes Bacteria noch unklar häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Veillonella parvula Bacteria noch unklar häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen, beteiligt an
Karies
Veillonella dispar Bacteria noch unklar häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen, beteiligt an
Karies
Centipeda periodontii Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Dialister pneumosintes mutmaßlich nachgewiesen in tiefen
Parodontaltaschen bei
AP
Porphyromonas endodon-
talis 		Bacteria mutmaßlich häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Streptococcus salivarius Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
Streptococcus sobrinus Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
&bull; ■ &phgr; · ·
Streptococcus sanguis Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
Streptococcus gordonii Bacteria noch unklar Karieserreger
Streptococcus mitis Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
Streptococcus oralis Bacteria noch unklar evtl. beteiligt an Karies
Streptococcus constellatus Bacteria noch unklar evtl. beteiligt an Karies
Streptococcus anginosus Bacteria noch unklar häufiger an PA-erkrank-
ten Stellen
Lactobacillus casei Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
Lactobacillus (Olsenella) uli Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
Lactobacillus (Atopobium)
rimae 		Bacteria noch unklar beteiligt an Karies
Lactobacillus acidophilus Bacteria unklar wichtiger Karieserreger
Actinomyces naeslundii Bacteria mutmaßlich Karieserreger, signifikant
höhere Keimzahl in
Nichtrauchern mit early-
onset (EO) PA als in
Rauchern, häufiger in
supragingivaler als in
subgingivaler Plaque bei
Bacteria noch unklar adulter PA
Actinomyces odontolyticus Bacteria mutmaßlich beteiligt an Karies, hö
here Keimzahl bei ge
sundem Parodontium,
häufiger in supragingi-
valer als in subgingivaler
Plaque bei adulter PA
Actinomyces israelii Bacteria noch unklar Karieserreger, signifikant
höhere Keimzahl in
Nichtrauchern mit early-
onset (EO) PA als in
Rauchern, häufiger in
supragingivaler als in
subgingivaler Plaque bei
adulter PA
Actinomyces gerencseriae Bacteria mutmaßlich evtl. beteiligt an Karies
Capnocytophaga gingivalis Bacteria noch unklar häufig in subgingivaler
Plaque von PA-Patien
ten und von Diabetes-
Patienten
Capnocytophaga ochracea Bacteria noch unklar häufiger in supragingi
valer als in subgingivaler
Plaque bei adulter PA
Capnocytophaga sputigena Bacteria noch unklar häufiger in supragingi
valer als in subgingivaler
Plaque bei adulter PA
Bacteroides fragilis bisher keine Korrelatio
nen bekannt
Bacteroides ureolyticus Bacteria noch unklar bisher keine Korrelatio
nen bekannt
Chlamydia pneumoniae Bacteria mutmaßlich Nachweis von Chlamy-
dia-Antigen im Tasche
nepithel von LJP- und
AP-Patienten mit rheu
matischen Erkrankun
gen, interessant auch
wegen Beteiligung an
Arthritis, Atherosklerose
und Endokarditis
Chlamydia trachomatis Bacteria mutmaßlich s.o.
Staphylococcus aureus Bacteria mutmaßlich signifikant höhere Keim
zahl in Rauchern mit
early-onset (EO) PA als
in Nichtrauchern
Staphylococcus epidermidis Bacteria noch unklar häufig in tiefen Par-
odontaltaschen
Escherichia coli Bacteria mutmaßlich Vorkommen bei AP, si
gnifikant höhere Keim
zahl in Rauchern mit
early-onset (EO) PA als
in Nichtrauchern
Enterobacter cloacae Bacteria mutmaßlich Vorkommen bei AP
Enterobacter agglomerans Bacteria mutmaßlich Vorkommen bei AP
&bull; ·■ *
- 49 -
Klebsiella pneumoniae Bacteria mutmaßlich Vorkommen bei AP
Klebsieila oxytoca Bacteria mutmaßlich Vorkommen bei AP
Pseudomonas aeruginosa Bacteria mutmaßlich Vorkommen bei AP
Propionibacterium acnes Bacteria mutmaßlich isoliert aus tiefen Par-
odontaltaschen
Gemella morbillorum Bacteria noch unklar Vorkommen bei AP1 bis
her nur wenige Untersu
chungen
Leptotrichia buccalis Bacteria noch unklar Vorkommen bei AP, bis
her nur wenige Untersu
chungen
Neisseria mucosa Bacteria noch unklar Vorkommen bei AP, bis
her nur wenige Untersu
chungen
Candida albicans Fungi mutmaßlich Karieserreger, Opportu
nist, signifikant höhere
Keimzahl in Rauchern
mit early-onset (EO) PA
als in Nichtrauchern
Candida glabrata Fungi noch unklar Vorkommen auch in Par-
odontaltaschen
Candida krusei Fungi noch unklar Vorkommen auch in Par-
odontaltaschen
Candida parapsilosis Fungi noch unklar noch keine Korrelationen
&bull; ·
Fungi noch unklar bekannt
Candida tropicalis noch keine Korrelationen
Fungi noch unklar bekannt
Cryptococcus neoformans noch keine Korrelationen
Fungi noch unklar bekannt
Aspergillus fumigatus signifikant höhere Keim
zahl in Rauchern mit
EOP als in Nichtrau
Fungi noch unklar chern
Aspergillus flavus in einem Fall aus einer
Fungi noch unklar Parodontaltasche isoliert
Saccharomyces cerevisiae Vorkommen in Par-
Herpes- hoch odontaltaschen
Herpes Simplex Virus 1 viren positiver Nachweis in
(HSV-1) Parodontaltaschen,
assoziiert mit LJP, asso
ziiert mit Zahnflei
Herpesvi noch unklar schentzündungen
Herpes Simplex Virus 2 ren gelegentlich mit Zahnflei
(HSV-2) schentzündungen asso
Herpes- noch unklar ziiert
Varizella-Zoster Virus (VZV) viren Infektion kann Zahn
fleischläsionen hervor
Herpes- hoch rufen
Zytomegalievirus (CMV) viren signifikant höhere Keim
zahl an ANUG- und PA-
erkrankten Stellen als an
gesunden Stellen,
HCMV-Aktivierung kor-
- 51 -
Herpes-
viren		 hoch reliert mit erhöhten
Keimzahlen von A.
actinomycetemcomitams
bei LJP
Epstein-Barr Virus (EBV) Herpes-
viren		 noch unklar signifikant höhere Keim
zahl an ANUG- und PA-
erkrankten Stellen als an
gesunden Stellen,
assoziiert mit LJP
Humanes Herpesvirus 6
(HHV-6) Typ A und B 		Herpes-
viren		 noch unklar gelegentl. Vorkommen in
parodontalen Läsionen,
evtl. Beteiligung an Oral
karzinomen
Humanes Herpesvirus 7
(HHV-7) 		Herpes-
viren		 noch unklar Vorkommen bei Zahn
fleischentzündungen
Humanes Herpesvirus 8
(HHV-8) 		Vorkommen in par
odontalen Läsionen von
HIV-Patienten
'aktueller Wissensstand
Tabelle 10: Antibiotika-Resistenzen, die mit dem Parodontitis-Genchip erkannt werden.
Antibiotikaresistenz ge
gen 		Resistenzmechanis
mus 		Gene fef-Gene
Tetracycline Resistenz vorwiegend
durch aktiven Efflux
- 52 -
des Tetracyclin-Mole-
küls		 fem-Gene, oxa-Gene,
carö-Gene, pse-Gene,
shv-Gene
ß-Lactam-Antibiotika (&zgr;. B.
Penicillin, Amoxicillin...)		 Spaltung des ß-Lac-
tamrings		 nim-Gene
5-Nitroimidazol (&zgr;. &Bgr;.
Metronidazol)		 noch unklar erm-Gene, mef-Gene,
mph-Gene, msrA-Gen,
ere-Gene, Hn-Gene
Macrolide (z. B. Erythromy
cin) und Clindamycin		 Modifikation des Ziel
moleküls (rRNA-Meth-
ylase, z. B. erm-Gene);
aktiver Efflux, &zgr;. &Bgr;.
mef-Gene; Phospho
rylierung des Macrolid-
Moleküls, z. B. mph-
Gene		 gyrk, gyrQ, parC
Fluoroquinolone Mutation der Zielmole
küle DNA Gyrase und
Topoisomerase IV
Tabelle 11: Virulenzfaktoren oraler Mikroorganismen, die mit dem Parodontitis-Genchip erkannt werden.
Virulenzfaktor Organismus Gene Charakteristika/Bes
onderheiten
Leukotoxin A. actinomyce-
temcomitans 		Ikt hoch virulenter
Stamm v. A.
actinomycetemcomit-
- 53 -
P. gingivalis prtC ans: 530bp-Deletion
im Leukotoxin-Pro-
motor bewirkt stark
erhöhte Leukotoxin-
Produktion; Präsenz
dieses Stammes
häufig bei LJP und
EOP
Kollagenase P. gingivalis fimA Typ I-V Korrelation der Viru
lenz mit dem Vorhan
densein des prtC-
Gens wird vermutet
Fimbrillin Typ des ffmA-Gens
beeinflusst die Eigen
schaften der
Fimbrien; Einfluss auf
die Virulenz wird
vermutet
Tabelle 12: Humane Gene, die mit dem Parodontitis-Risiko assoziiert sind bzw. assoziiert sein könnten.
Gen(e) Funktion des Gen
produkts 		Korrelationen von Genpoly-
morphismen/spez. Allelen mit
parodontalen Erkrankungen*
Interleukin 1A entzündungsför-
derndes Zytokin		 +4845 Genpolymorphismus:
AIIeI 2 korreliert mit schwerem
Verlauf der adulten Parodontitis
Interleukin 1B entzündungsför- + 3954 Genpolymorphismus:
derndes Zytokin AIIeI 2 korreliert mit schwerem
Verlauf der adulten Parodontitis
lnterleukin 1 Rezeptor Membranrezeptor noch nicht bekannt
für IL-1
Interleukin 4 Zytokin, das die 2 Genpolymorphismen korre
humorale Im lieren mit dem Auftreten der
munantwort über EOP
mittelt
Interleukin 4 Rezeptor Membranrezeptor noch nicht bekannt
für IL-4
Interleukin 6 entzündungsför- noch nicht bekannt
derndes Zytokin
Interleukin 1 Rezeptor anti- Pos. 8006 (Genebank Acc. No.
Antagonist inflammatorisches X64532) Genpolymorphismus:
Molekül AIIeI 2 (korreliert mit AIIeI 2 ei
nes 86-bp-VNTRs in Intron 2)
ist mit vielen inflammatorischen
Erkrankungen assoziiert, u. a.
mit früh beginnender Parodon
titis
Tumomekrosefaktor &agr; entzündungsför- -308 Genpolymorphismus: AIIeI
derndes Zytokin, 1 ist häufiger bei Patienten mit
übermittelt das Si fortgeschrittener Parodontitis
gnal zum Knochen
abbau als Reaktion
auf bakterielle En-
dotoxine
Tumomekrosefaktor &bgr; entzündungsför- noch nicht bekannt
derndes Zytokin FcyRlla-R/R131 Genotyp spielt
vermutlich eine Rolle bei der
Pathogenese der LJP und EOP
Fey RII (CD32) Rezep
tor		 Rezeptor für die
konstante Domäne
(FcR) der Immung-
lobuline vom Typ G		 Fcä RIIIa 158F-AIIeI korreliert
mit dem Wiederauftreten der
adulten Parodontitis
Fcä RIIIb NA2-Allel (4-Ami-
nosäuren-Austausch) stellt ei
nen Risikofaktor für die refrak-
täre adulte Parodontitis dar
Fcy RHI (CD16) Re
zeptor		 Rezeptor für die
konstante Domäne
(FcR) der Immung-
lobuline vom Typ G		 AIIeIe HLA-A9 und HLA-B15
korrelieren mit generalisierter,
früh beginnender Parodontitis
HLA-Antigene Zellerkennung, be
teiligt an der indivi
duellen Immunant
wort
'aktueller Wissensstand

Claims (14)

1. Nukleotidträger mit Sonden für mindestens eine humane und mikrobielle Referenzsequenz bzw. für eine zu der Referenzsequenz komplementäre Sequenz.
2. Nukleotidträger mit Sonden für mindestens eine humane und mikrobielle, Parodontitis assoziierte Referenzsequenz bzw. für eine zu der Referenzsequenz komplementäre Sequenz.
3. Nukleotidträger mit Sonden für mindestens eine Referenzsequenz bzw. für zu der Referenzsequenz komplementäre Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenz für eine der folgenden Einflußgrößen spezifisch ist: Parodontitis assoziierte Mikroorganismen; mikrobielle Virulenzfaktoren; mikrobielle Antibiotikaresistenzen und humane genetische Parodontitis-Prädisposition.
4. Nukleotidträger mit Sonden für mindestens eine Referenzsequenz bzw. für zu der Referenzsequenz komplementäre Sequenz, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenz für eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe folgender Nukleotidsequenzen spezifisch ist: Parodontitis-Erreger spezifische Nukleotidsequenzen, mikrobielle Virulenzfaktoren codierende Gene bzw. Genabschnitte, mikrobielle Antibiotika-Resistenzgene bzw. -genabschnitte sowie humane Parodontitis assoziierte Genpolymorphismen.
5. Nukleotidträger nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch 16 bis 25-mere Sonden.
6. Nukleotidträger nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch 15-mere Oligonukleotide.
7. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Referenzsequenzen, die mindestens für einen der in der Tabelle 9 aufgeführten Erreger spezifisch sind.
8. Nukleotidträger nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch Sonden für mindestens eine der in den Tabellen 1, 2 oder 3 aufgeführten Referenzsequenzen bzw. für mindestens eine zu dieser Referenzsequenz komplementären Nukleotidsequenz.
9. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Referenzsequenzen, die mindestens für ein der in der Tabelle 10 aufgeführten Antibiotikaresistenzgene spezifisch sind.
10. Nukleotidträger nach Anspruch 9, gekennzeichnet durch Sonden für mindestens eine der in den Tabellen 4 oder 5 aufgeführten Referenzsequenzen bzw. für mindestens eine zu einer dieser Referenzsequenz komplementären Nukleotidsequenz.
11. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Referenzsequenzen, die mindestens für einen der in der Tabelle 11 aufgeführten Virulenzfaktor spezifisch sind.
12. Nukleotidträger nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch Sonden für mindestens eine der in der Tabelle 6 aufgeführten Referenzsequenzen bzw. für mindestens eine zu einer dieser Referenzsequenz komplementären Nukleotidsequenz
13. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Referenzsequenzen, die mindestens für ein der in Tabelle 12 aufgeführten humanen Gene spezifisch sind.
14. Nukleotidträger nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch Sonden für mindestens eine der in der Tabelle 7 aufgeführten Referenzsequenzen bzw. für mindestens eine zu einer dieser Referenzsequenz komplementären Nukleotidsequenz.
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