DE19813774A1 - Parapox virus-encoded vascular endothelial cell growth factor (PPV-VEGF) - Google Patents
Parapox virus-encoded vascular endothelial cell growth factor (PPV-VEGF)Info
- Publication number
- DE19813774A1 DE19813774A1 DE1998113774 DE19813774A DE19813774A1 DE 19813774 A1 DE19813774 A1 DE 19813774A1 DE 1998113774 DE1998113774 DE 1998113774 DE 19813774 A DE19813774 A DE 19813774A DE 19813774 A1 DE19813774 A1 DE 19813774A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- amino acid
- nucleic acid
- polypeptide
- acid sequence
- vegf
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 title description 4
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 title description 2
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 title description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 50
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 50
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 48
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 30
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 241000700639 Parapoxvirus Species 0.000 claims abstract description 15
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 241000700635 Orf virus Species 0.000 claims description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 7
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 claims description 6
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 5
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims description 4
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 claims description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 abstract description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 43
- 102000009524 Vascular Endothelial Growth Factor A Human genes 0.000 description 42
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 101000852966 Rattus norvegicus Interleukin-1 receptor-like 1 Proteins 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 2
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RSWGJHLUYNHPMX-UHFFFAOYSA-N Abietic-Saeure Natural products C12CCC(C(C)C)=CC2=CCC2C1(C)CCCC2(C)C(O)=O RSWGJHLUYNHPMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001518086 Bartonella henselae Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 101100372758 Danio rerio vegfaa gene Proteins 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101000898034 Homo sapiens Hepatocyte growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000868152 Homo sapiens Son of sevenless homolog 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000000380 Matrix Metalloproteinase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010016113 Matrix Metalloproteinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000010752 Plasminogen Inactivators Human genes 0.000 description 1
- 108010077971 Plasminogen Inactivators Proteins 0.000 description 1
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102100037681 Protein FEV Human genes 0.000 description 1
- 101710198166 Protein FEV Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- KHPCPRHQVVSZAH-HUOMCSJISA-N Rosin Natural products O(C/C=C/c1ccccc1)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 KHPCPRHQVVSZAH-HUOMCSJISA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100031372 Thymidine phosphorylase Human genes 0.000 description 1
- 108700023160 Thymidine phosphorylases Proteins 0.000 description 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 1
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102000009520 Vascular Endothelial Growth Factor C Human genes 0.000 description 1
- 108010073923 Vascular Endothelial Growth Factor C Proteins 0.000 description 1
- 102000009519 Vascular Endothelial Growth Factor D Human genes 0.000 description 1
- 108010073919 Vascular Endothelial Growth Factor D Proteins 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 101150030763 Vegfa gene Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000001656 angiogenetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940092524 bartonella henselae Drugs 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 239000012152 bradford reagent Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 1
- 230000001609 comparable effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 201000005332 contagious pustular dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 230000009646 cyclic growth Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 1
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 201000010582 ecthyma Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000004696 endometrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004925 microvascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- RIEABXYBQSLTFR-UHFFFAOYSA-N monobutyrin Chemical compound CCCC(=O)OCC(O)CO RIEABXYBQSLTFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000010016 myocardial function Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000033667 organ regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 210000003668 pericyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000002797 plasminogen activator inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000026341 positive regulation of angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000030114 positive regulation of endothelial cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000003265 stomatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- KHPCPRHQVVSZAH-UHFFFAOYSA-N trans-cinnamyl beta-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC=CC1=CC=CC=C1 KHPCPRHQVVSZAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000003074 vasoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
- C12N2710/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Die Erfindung betrifft neue aus Parapockenviren (PPV) erhältliche Polypep tide mit Homologien zu humanen VEGF-Proteinen, welche in der Lage sind, die Endothelzellproliferation zu stimulieren. Diese PPV-VEGF-Polypeptide sind für pharmazeutische Anwendungen, insbesondere zur Stimulation der Gefäßbildung, Gefäßreparatur, Gewebereparatur und zur Immuntherapie geeignet. Weiterhin werden für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodierende Nukleinsäuren, diese Nukleinsäuren enthaltende Vektoren und gegen die Polypeptide gerichtete Antikörper offenbart.The invention relates to new polyps available from parapox viruses (PPV) tide with homologies to human VEGF proteins, which are able to stimulate endothelial cell proliferation. These PPV-VEGF polypeptides are for pharmaceutical applications, especially for the stimulation of Vascularization, vascular repair, tissue repair and for immunotherapy suitable. Furthermore, for the polypeptides according to the invention coding nucleic acids, vectors containing these nucleic acids and antibodies directed against the polypeptides.
Angiogenese umfaßt den Prozeß der Neubildung von Blutgefäßen aus bereits existierenden Blutgefäßen. Angiogenetische Prozesse sind für eine normale Entwicklung und Differenzierung des Gefäßsystems essentiell. Im postembryonalen Stadium findet sich Angiogenese nur noch bei wenigen physiologischen Prozessen wie dem zyklischen Wachstum vom Corpus Luteum und Endometrium, der Wundheilung, den Reparaturprozessen bei der Gewebe- und Organregeneration, sowie bei dem pathologischen Prozeß des Tumorwachstums (Beck und D'Amore, "Vascular Development: Cellular and Molecular Regulation", FASEB J. 11: 365-373, 1997; Risau, "Mecha nisms of angiogenesis", Nature 386: 671-674, 1997).Angiogenesis involves the process of new blood vessel formation existing blood vessels. Angiogenetic processes are for one normal development and differentiation of the vascular system is essential. in the In the postembryonic stage, angiogenesis is only found in a few physiological processes such as the cyclic growth of the corpus Luteum and endometrium, wound healing, repair processes tissue and organ regeneration, as well as in the pathological process of Tumor Growth (Beck and D'Amore, "Vascular Development: Cellular and Molecular Regulation ", FASEB J. 11: 365-373, 1997; Risau," Mecha nisms of angiogenesis ", Nature 386: 671-674, 1997).
Blutkapillaren bestehen aus Endothelzellen und Perizyten. Diese beiden Zelltypen besitzen die genetische Information zur Ausbildung neuer Blutkapillaren durch Kapillarsprossung. Dieser Prozeß wird durch spezifische Angiogenesefaktoren initiiert. Aufgrund der großen physiologischen Bedeutung der Angiogenese wurden in den vergangenen Jahren ver schiedene Angiogenesefaktoren isoliert, gereinigt und charakterisiert, u. a. aFGF, bFGF, EGF, TGF-α, TGF-β, PGE2, Monobutyrin, HGF, TNF-α, PD-ECGF, Angiogenin, Interleukin-8 und VEGF (Klagsbrun et al., "Regulators of Angiogenesis", Ann. Rev. Physiol., 53: 217-239, 1991).Blood capillaries consist of endothelial cells and pericytes. These two Cell types have the genetic information for the formation of new ones Blood capillaries due to capillary sprout. This process is characterized by specific Angiogenesis factors initiated. Because of the great physiological The importance of angiogenesis has been verified in recent years different angiogenesis factors isolated, purified and characterized, u. a. aFGF, bFGF, EGF, TGF-α, TGF-β, PGE2, monobutyrin, HGF, TNF-α, PD-ECGF, angiogenin, interleukin-8 and VEGF (Klagsbrun et al., "Regulators of Angiogenesis ", Ann. Rev. Physiol., 53: 217-239, 1991).
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) bezeichnet eine Familie mikroheterogener Wachstumsfaktoren mit großer Spezifität und Selektivität hinsichtlich der Wirkung als Mitogen für vaskuläre Endothelzellen (ED50 2-10 pM) (Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 47: 211-218, 1991). VEGF stimuliert die Angiogenese in verschiedenen in vivo Modellen, wie dem "chick chorioallentoic membrane" (CAM)-Assay (Leung et al., "Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen". Science 246: 1306-1309, 1989) und dem "rabbit cornea" Assay (Philipps et al., "Vascular endothelial growth factor is expressed in rat corpus luteum", Endocrinology, 127: 965-968, 1995), sowie in in vitro Modellen durch Bildung von kapillarartigen Strukturen in dreidimensionalen Kollagengelen (Pepper et al., "Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro", Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 824-831, 1992). VEGF stimuliert in vaskulären Endothelzellen weiterhin die Expression von Tissue-type Plasminogen Activator (tPA), PA Inhibitor-1 (PAI-1) (Pepper et al., "Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor typ 1 in microvascular endothelial cell", Biochim. Biophys. Res. Commun. 181: 902-908, 1991) und Metallproteinasen (Unemori et al., "Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells", J. Cell. Physiol. 153: 557-562, 1992). Eine weitere Funktion von VEGF liegt in der Erhöhung der vaskulären Permeabilität, weshalb das Protein auch als "Vascular Permeability Factor" (VPF) bezeichnet wird (Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 47: 211-218 (1991)). Darüber hinaus wird VEGF eine immunmodulatorische Wirkung zugeschrie ben, da VEGF die funktionale Reifung von dendritischen Zellen aus CD34 + Stammzellen inhibiert (Gabrilovich et al., Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells", Nature Med. 2: 1096-1103, 1996).VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) denotes a family of micro-heterogeneous growth factors with great specificity and selectivity with regard to the effect as mitogen for vascular endothelial cells (ED 50 2-10 pM) (Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 47: 211-218, 1991). VEGF stimulates angiogenesis in various in vivo models, such as the "chick chorioallentoic membrane" (CAM) assay (Leung et al., "Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen". Science 246: 1306-1309, 1989) and the "rabbit cornea" assay (Philipps et al., "Vascular endothelial growth factor is expressed in rat corpus luteum", Endocrinology, 127: 965-968, 1995), and in vitro models by forming capillary structures in three-dimensional collagen gels ( Pepper et al., "Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro", Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 824-831, 1992). VEGF continues to stimulate the expression of tissue-type plasminogen activator (tPA), PA inhibitor-1 (PAI-1) (Pepper et al., "Vascular endothelial growth factor (VEGF) induces plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor type 1 in vascular endothelial cells in microvascular endothelial cell ", Biochim. Biophys. Res. Commun. 181: 902-908, 1991) and metal proteinases (Unemori et al.," Vascular endothelial growth factor induces interstitial collagenase expression in human endothelial cells ", J. Cell. Physiol 153: 557-562, 1992). Another function of VEGF is to increase vascular permeability, which is why the protein is also referred to as "Vascular Permeability Factor" (VPF) (Ferrara et al., "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem. , 47: 211-218 (1991)). In addition, VEGF is said to have an immunomodulatory effect, since VEGF inhibits the functional maturation of dendritic cells from CD34 + stem cells (Gabrilovich et al., Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells ", Nature Med. 2: 1096-1103, 1996).
Von den verschiedenen mikroheterogenen humanen VEGF-Formen liegt in normalen menschlichen Geweben vorwiegend VEGF165 vor. VEGF165 ist ein glycosyliertes, kationisches Dimer von 46-48 kDa, das aus zwei identischen 24 kDa Untereinheiten gebildet wird. VEGF165 wird durch Sulfhydryl reduzierende Agentien inaktiviert, es ist jedoch resistent gegenüber saurem pH und Hitze. VEGF165 bindet auf Endothelzellen an die Transmembranrezep toren KDR und FIt-1, die beide in der intrazellulären Domäne eine Proteinty rosinkinaseaktivität aufweisen. Während FIt-1 mit höherer Affinität als KDR gebunden wird, scheint das mitogene Signal für Endothelzellen durch KDR vermittelt zu werden (Klagsbrun und D'Amore, "Vascular endothelial growth factor and its receptors"l, Cytokine Growth Factor Rev. 7: 259-270, 1996).Of the various micro-heterogeneous human VEGF forms, VEGF 165 is predominantly present in normal human tissues. VEGF 165 is a glycosylated, cationic dimer of 46-48 kDa, which is formed from two identical 24 kDa subunits. VEGF 165 is inactivated by sulfhydryl reducing agents, but it is resistant to acidic pH and heat. VEGF 165 binds to the transmembrane receptors KDR and FIt-1 on endothelial cells, both of which have protein rosin kinase activity in the intracellular domain. While FIt-1 is bound with higher affinity than KDR, the mitogenic signal for endothelial cells appears to be mediated by KDR (Klagsbrun and D'Amore, "Vascular endothelial growth factor and its receptors" 1, Cytokine Growth Factor Rev. 7: 259- 270, 1996).
Durch differentielles Spleißen von Transkripten des humanen vegf Gens können neben VEGF165 auch die VEGF-Polypeptidvarianten VEGF121, VEGF189 und VEGF208 gebildet werden. Während alle humanen VEGF Polypeptide die Eigenschaft zur Stimulation der Endothelzellproliferation haben, unter scheiden sich die verschiedenen mikroheterogenen Formen hinsichtlich der Größe, dem Grad der niedrig-affinen Bindung an Heparin bzw. der hoch affinen Bindung an FIt-1 (Keyt et al., "The Carboxy-Terminal Domain (111-165) of Vascular endothelial Growth Factor 15 Critical for its Mitogenic Potency J. Biol. Chem. 271: 7788-7795, 1996). Beim Menschen wurden inzwischen weitere homologe Gene und deren Genprodukte beschrieben, u. a. VEGF-B, VEGF-C und VEGF-D, die gegenüber den zuvor beschriebenen VEGF-Polypeptiden abweichende biologische Aktivitäten und Expressions muster aufweisen. Homologe der bezeichneten humanen Faktoren wurden auch in verschiedenen Tierarten beschrieben. By differential splicing of transcripts of the human vegf gene, in addition to VEGF 165 , the VEGF polypeptide variants VEGF 121 , VEGF 189 and VEGF 208 can also be formed. While all human VEGF polypeptides have the property of stimulating endothelial cell proliferation, the different micro-heterogeneous forms differ in terms of size, the degree of low-affinity binding to heparin and the high-affinity binding to FIt-1 (Keyt et al., " The Carboxy-Terminal Domain (111-165) of Vascular endothelial Growth Factor 15 Critical for its Mitogenic Potency J. Biol. Chem. 271: 7788-7795, 1996). In humans, other homologous genes and their gene products have meanwhile been described, including VEGF -B, VEGF-C and VEGF-D, which have different biological activities and expression patterns than the previously described VEGF polypeptides, homologs of the designated human factors have also been described in various animal species.
Zu den Parapockenviren zählen unter anderem Orf-Viren, die bei Schaf und Ziege den Lippengrind und beim Menschen das Ecthyma contagiosum verursachen, und Melkerknotenviren, die beim Menschen den Melkerknoten verursachen (als Übersichtsartikel s. Mayr, A. und Büttner, M. "Milers's node, Bovine Papular Stomatitis, Ecthyma (Orf) Virus" In: Virus Infections of the Vertebrates, Vol. 3. Dinter, Z., Morein, B. (eds.) Seiten 23-42, Elsevier, Amsterdam, 1990). Diese Viren infizieren Keratinozyten der Haut und bewirken vasoproliferative Prozesse, die in Folge zu Schleimhaut wucherungen führen. Durch DNA-Sequenzierung vergleichbarer Abschnitte des Genoms der Orf-Virus-Isolate NZ2 bzw. NZ7 wurden zwei Varianten eines hypothetischen Gens (DNA-Sequenzen der offenen Leseraster hier bezeichnet als NZ2vegf, s. Abb. 1a, bzw. NZ7vegf, s. Abb. 1b) mit einem offenen Leseraster beschrieben, das eine gewisse Homologie zu mammali schem VEGF aufweist (Lyttle et al., "Homologs of Vascular Endothelial Growth Factor are encoded by the Poxvirus Orf Virus", J. Virol., 68: 84-92, 1994). Die Genprodukte dieser Gene und deren biologische Aktivität sind jedoch nicht bekannt.The parapox viruses include, among others, Orf viruses, which cause lip lip in sheep and goats and the ecthyma contagiosum in humans, and milking node viruses, which cause milking nodes in humans (for review articles see Mayr, A. and Büttner, M. "Milers's node, Bovine Papular Stomatitis, Ecthyma (Orf) Virus "In: Virus Infections of the Vertebrates, Vol. 3. Dinter, Z., Morein, B. (eds.) Pages 23-42, Elsevier, Amsterdam, 1990). These viruses infect keratinocytes in the skin and cause vasoproliferative processes, which in turn lead to mucosal growth. By DNA sequencing of comparable sections of the genome of the Orf virus isolates NZ2 and NZ7, two variants of a hypothetical gene were identified (DNA sequences of the open reading frames referred to here as NZ2vegf, see Fig. 1a, or NZ7vegf, see Fig. 1b) with an open reading frame which has a certain homology to mammalian VEGF (Lyttle et al., "Homologs of Vascular Endothelial Growth Factor are encoded by the Poxvirus Orf Virus", J. Virol., 68: 84-92, 1994). However, the gene products of these genes and their biological activity are not known.
Die Verfügbarkeit von Faktoren, die das Wachstum von Blutgefäßen stimulieren können, ist von großer Bedeutung für eine Behandlung pathologischer Zustände, die aus einer insuffizienten Durchblutung von Geweben und Qrganen herrühren (Ischämie). Rekombinanter hVEGF165 (US-Patent 5,332,671) wurde bereits erfolgreich im Kaninchen-Tiermodell zur Therapie einer experimentell bewirkten Ischämie einer Extremität (Takeshita et al, "Therapeutic angiogenesis: A single intra-arterial bolus of vascular endothelial growth factor augments collateral vessel formation in a rabbit ischemic hindlimb model", J. Clin. Invest 93: 662-670, 1994) sowie in einem Schweine-Tiermodell zur Therapie einer chronischen myocardialen Ischämie verwendet (Harada et al., "Vascular endothelial growth factor improves coronary flow and myocardial function in chronically ischemic porcine hearts". Am. J. Physiol. 270: 1791-1802). Für ähnliche therapeu tische Anwendungen wurden weitere VEGF Varianten patentiert (US- Patente No. 5,194,596, No. 5,607,918, No. 5,726,152). Die unter schiedlichen physikalischen Eigenschaften (z. B. Bindung an Heparin, Stabilität gegenüber proteolytischer Degradation) und biologischen Aktivitäten (Wirkung auf vaskuläre Endothelzellen als Mitogen bzw. als Permeabilitätsfaktor) der verschiedenen VEGF Varianten lassen erwarten, daß diese Faktoren von unterschiedlichem therapeutischem Nutzen für die Behandlung dieser und anderer Krankheitsbilder sein werden. Da optimierte Therapeutika für den Einsatz beim Menschen bisher nicht entwickelt worden sind, besteht demnach weiterhin Bedarf für eine Bereitstellung von Wachstumsfaktoren mit einer möglichst hohen biologischen Wirksamkeit oder/und selektiven Wirkung auf das Endothel.The availability of factors that can stimulate the growth of blood vessels is of great importance for the treatment of pathological conditions that result from insufficient blood supply to tissues and organs (ischemia). Recombinant hVEGF 165 (US Pat. No. 5,332,671) has already been successfully used in the rabbit animal model for the therapy of experimentally induced ischemia of a limb (Takeshita et al, "Therapeutic angiogenesis: A single intra-arterial bolus of vascular endothelial growth factor augments collateral vessel formation in a rabbit ischemic hindlimb model ", J. Clin. Invest 93: 662-670, 1994) and in a pig-animal model for the therapy of chronic myocardial ischemia (Harada et al.," Vascular endothelial growth factor improves coronary flow and myocardial function in chronically ischemic porcine hearts ". Am. J. Physiol. 270: 1791-1802). Further VEGF variants have been patented for similar therapeutic applications (US Pat. No. 5,194,596, No. 5,607,918, No. 5,726,152). The different physical properties (e.g. binding to heparin, stability to proteolytic degradation) and biological activities (effect on vascular endothelial cells as a mitogen or as a permeability factor) of the different VEGF variants suggest that these factors have different therapeutic benefits for the Treatment of these and other clinical pictures will be. Since optimized therapeutic agents for use in humans have not yet been developed, there is therefore still a need to provide growth factors with the highest possible biological effectiveness and / or selective effect on the endothelium.
Gemäßvorliegender Erfindung wurde ein Gen-Fragment aus dem Genom des Orf-Virus Isolats D1701 isoliert (DNA-Sequenz des offenen Leseraster, hier bezeichnet als D1701vegf, s. Abb. 1(c)), welches homolog zu den zuvor isolierten hypohetischen Genen NZ2vegf (Abb. 1(a)) und NZ7vegf (Abb. 1(b)) aus anderen Orf-Virus Isolaten ist (Lyttle et al., "Homologs of Vascular Endothelial Growth Factor are encoded by the Poxvirus Orf Virus", J. Virol., 68: 84-92, 1994). Abb. 2 zeigt ein Alignment der VEGF-homologen Proteinsequenzen dieser Gene mit den Proteinsequenzen mammalischer Formen von VEGF.According to the present invention, a gene fragment was isolated from the genome of the Orf virus isolate D1701 (DNA sequence of the open reading frame, referred to here as D1701vegf, see FIG. 1 (c)), which is homologous to the previously isolated hypohetic genes NZ2vegf ( Fig. 1 (a)) and NZ7vegf ( Fig. 1 (b)) from other Orf virus isolates (Lyttle et al., "Homologs of Vascular Endothelial Growth Factor are encoded by the Poxvirus Orf Virus", J. Virol. , 68: 84-92, 1994). Fig. 2 shows an alignment of the VEGF-homologous protein sequences of these genes with the protein sequences of mammalian forms of VEGF.
Durch Expression von rekombinantem rPPV-VEGF in E. coli und dessen Reinigung sowie durch die native Expression von PPV-VEGF in eukaryonti schen Zellen konnte ein potenter Wachstumsfaktor für vaskuläre Endothel zellen dargestellt werden, der hinsichtlich seiner mitogenen Wirkung auf Endothelzellen überraschenderweise eine höhere spezifische Aktivität aufweist als vergleichbar hergestellte humane VEGF-homologe Proteine (Birkenjhäger et al. "Synthesis and physiological acitivity of heterodimers comprising different splice forms of vascular endothelial growth factor and placent growth factor", Biochem. J. 31 6: 703-707, 1996). By expression of recombinant rPPV-VEGF in E. coli and its Purification and through the native expression of PPV-VEGF in eukaryonti cells could be a potent growth factor for vascular endothelium cells are shown on its mitogenic effects Endothelial cells surprisingly have a higher specific activity has human VEGF-homologous proteins produced in a comparable manner (Birkenjhäger et al. "Synthesis and physiological activity of heterodimers comprising different splice forms of vascular endothelial growth factor and placent growth factor ", Biochem. J. 31 6: 703-707, 1996).
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid mit der
Eigenschaft der Stimulierung der Endothelproliferation, enthaltend eine
Aminosäuresequenz ausgewählt aus
A first aspect of the invention relates to an isolated polypeptide with the property of stimulating endothelial proliferation, containing an amino acid sequence selected from
- (a) einer Aminosäuresequenz, die von einer der in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequenzen kodiert ist,(a) an amino acid sequence encoded by one of the nucleic acid sequences shown in Fig. 1 (a), (b) and (c),
- (b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder(b) an amino acid sequence that is at least 25 consecutive Contains amino acid residues of one of the amino acid sequences from (a), or
- (c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).(c) an amino acid sequence with an identity of at least 50% one of the amino acid sequences from (a).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes Polypeptid mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothelproliferation, erhältlich aus Parapockenviren, oder eine daraus abgeleitete Variante.Another aspect of the invention relates to an isolated polypeptide with the Property of stimulating endothelial proliferation, available from Parapox viruses, or a variant derived from it.
Durch die Erfindung wird ein neuartiger "Vascular Endothelial Growth Factor" bereitgestellt, der durch ein Gen im Genom von Parapockenviren kodiert wird (PPV-VEGF). Dieser PPV ist für diagnostische und insbesondere therapeutische Anwendungen geeignet, z. B. für die Stimulierung der Gefäßbildung und Gefäßreparatur, des weiteren der Gewebereparatur, der Produktion künstlicher Gefäße sowie für die Immuntherapie. Weiterhin werden die Bereitstellung von DNA-Vektoren zur Expression von PPV-VEGF bereitgestellt, insbesondere zur Gentherapie von Defekten der Gefäßbildung, Gefäßreparatur und Gewebereparatur.The invention provides a novel "vascular endothelial growth Factor "provided by a gene in the genome of parapox viruses is encoded (PPV-VEGF). This PPV is for diagnostic and in particular therapeutic applications suitable, e.g. B. for the stimulation of Vascular formation and repair, further tissue repair, the Production of artificial vessels and for immunotherapy. Farther will provide DNA vectors for the expression of PPV-VEGF provided, in particular for gene therapy of defects in vascularization, Vascular repair and tissue repair.
Der in dieser Erfindung vorgestellte rekombinante PPV-VEGF (rPPV-VEGF) zeichnet sich durch eine ungewöhnlich hohe Aktivität hinsichtlich der Stimulation der Proliferation von humanen Endothelzellen aus. Während 0,4 ng/ml rPPV-VEGF bereits die Endothelzellproliferation stimulieren, werden für einen vergleichbaren Effekt ca. 1-2 ng/ml eines rekombinant hergestellten humanen VEGF Polypeptids benötigt (Birkenjhäger et al. supra). Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt in dem vorgestellten Verfahren zur Expression von rPPV-VEGF in E. coli, mit dem eine für eine therapeutische Anwendung ausreichende Menge an rPPV-VEGF hergestellt werden kann. Der Nachweis einer funktionellen Expression von PPV-VEGF durch eukaryontische Zellen nach Transfektion eines Expressionsplasmids bzw. nach Infektion mit ganzen PPV-Viren zeigt weiterhin auf, daß die für PPV-VEGF kodierende DNA-Sequenz für gentherapeutische Anwendungen Verwendung finden kann.The recombinant PPV-VEGF (rPPV-VEGF) presented in this invention is characterized by an unusually high activity in terms of Stimulation of proliferation from human endothelial cells. While 0.4 ng / ml rPPV-VEGF already stimulate endothelial cell proliferation, are about 1-2 ng / ml of a recombinant for a comparable effect prepared human VEGF polypeptide (Birkenjhäger et al. supra). Another advantage of the invention lies in the presented Method for the expression of rPPV-VEGF in E. coli, with which one for one therapeutic application sufficient amount of rPPV-VEGF produced can be. Evidence of functional expression of PPV-VEGF by eukaryotic cells after transfection of an expression plasmid or after infection with whole PPV viruses also shows that the for PPV-VEGF encoding DNA sequence for gene therapy applications Can be used.
Die in den Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequen zen kodieren für erfindungsgemäße Polypeptide. Daneben erfaßt die Erfindung auch Polypeptide, die eine Aminosäureteilsequenz mit mindestens 25, vorzugsweise mindestens mindestens 50 und besonders bevorzugt mindestens 75 aufeinanderfolgenden Aminosäureresten einer dieser Aminosäuresequenzen aufweisen oder eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90% zu einer dieser Aminosäuresequenzen besitzen.The nucleic acid sequences shown in FIGS. 1 (a), (b) and (c) code for polypeptides according to the invention. The invention also encompasses polypeptides which have a partial amino acid sequence with at least 25, preferably at least 50 and particularly preferably at least 75 consecutive amino acid residues of one of these amino acid sequences or an amino acid sequence with an identity of at least 50%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 75% and most preferably have at least 90% of any of these amino acid sequences.
Besonders bevorzugt ist ein Polypeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz
ausgewählt aus
A polypeptide containing an amino acid sequence is particularly preferably selected from
- (a) einer Aminosäuresequenz, die von der in Abb. 1(c) dargestellten Nukleinsäuresequenz kodiert ist,(a) an amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence shown in Fig. 1 (c),
- (b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinanderfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder(b) an amino acid sequence that is at least 25 consecutive Contains amino acid residues of one of the amino acid sequences from (a), or
- (c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).(c) an amino acid sequence with an identity of at least 50% one of the amino acid sequences from (a).
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Polypeptid durch rekombinante Expression einer exogenen Nukleinsäuresequenz in einer geeigneten Wirtszelle, z. B. einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle, hergestellt. Bei Expression in prokaryontischen Wirtszellen wie etwa E. coli wird das Polypeptid in unglykosilierter Form erhalten.The polypeptide according to the invention is preferably produced by recombinant Expression of an exogenous nucleic acid sequence in a suitable Host cell, e.g. B. a prokaryotic or eukaryotic host cell, manufactured. When expressed in prokaryotic host cells such as E. coli the polypeptide is obtained in unglycosylated form.
Die für das Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz wird vorzugsweise
ausgewählt aus:
The nucleic acid sequence coding for the polypeptide is preferably selected from:
- (a) den in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequenzen,(a) the nucleic acid sequences shown in Fig. 1 (a), (b) and (c),
- (b) Nukleinsäuresequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes einer Nukleinsäure gemäß (a) entsprechen, und(b) Nucleic acid sequences which are involved in the degeneration of the correspond to genetic codes of a nucleic acid according to (a), and
- (c) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nu kleinsäure gemäß (a) oder/und (b) hybridisieren.(c) Nucleic acids that have a nu hybridize small acid according to (a) or / and (b).
Der Begriff "stringente Hybridisierung" gemäß vorliegender Erfindung wird wie bei Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbour Laboratory Press, 1.101-1.104, 1989) verwendet. Vorzugsweise spricht man von einer stringenten Hybridisierung, wenn nach Waschen für eine Stunde mit 1 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugs weise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C, insbesondere für 1 h mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 55°C, vorzugsweise bei 62°C und besonders bevorzugt bei 68°C noch ein positives Hybridisierungssignal beobachtet wird. Weiterhin ist, bevorzugt, wenn die Nukleinsäuresequenz zu einer der in den Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäure sequenzen eine Identität von mindestens 70%, besonders bevorzugt von mindestens 80% und am meisten bevorzugt von mindestens 90% aufweist.The term "stringent hybridization" according to the present invention is used as in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1.101-1.104, 1989). One speaks preferably of a stringent hybridization if, after washing for 1 hour with 1 × SSC and 0.1% SDS at 55 ° C., preferably at 62 ° C. and particularly preferably at 68 ° C., in particular for 1 h with 0, 2 × SSC and 0.1% SDS at 55 ° C., preferably at 62 ° C. and particularly preferably at 68 ° C., a positive hybridization signal is also observed. It is furthermore preferred if the nucleic acid sequence is identical to one of the nucleic acid sequences shown in FIGS. 1 (a), (b) and (c) of at least 70%, particularly preferably of at least 80% and most preferably of at least 90 % having.
Erfindungsgemäße Polypeptide mit der Eigenschaft der Stimulierung der Endothezellproliferation sind aus Parapockenviren, insbesondere Orf-Viren, erhältlich. Daneben werden von der vorliegenden Erfindung auch Varianten solcher Polypeptide umfaßt, die sich durch Substitutionen, Deletionen oder/und Additionen einzelner Aminosäuren oder/und Aminosäuren abschnitte sich von den aus Parapockenviren erhältlichen Polypeptiden unterscheiden. Vorzugsweise enthalten diese Varianten mindestens 25, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 75 aufeinanderfolgende Aminosäurereste der natürlichen viralen Polypepti de. Darüber hinaus ist es bevorzugt, wenn die Aminosäuresequenz der Varianten eine Identität von mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 60%, besonders bevorzugt mindestens 75% und am meisten bevorzugt mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz der natürlichen viralen Polypeptide aufweist.Polypeptides according to the invention with the property of stimulating Endothe cell proliferation are from parapox viruses, especially Orf viruses, available. In addition, variants of the present invention are also available such polypeptides, which are characterized by substitutions, deletions or / and additions of individual amino acids or / and amino acids cut off the polypeptides obtainable from parapox viruses differentiate. These variants preferably contain at least 25, particularly preferably at least 50 and most preferably at least 75 consecutive amino acid residues of the natural viral polypepti de. In addition, it is preferred if the amino acid sequence of the Variants have an identity of at least 50%, preferably at least 60%, particularly preferably at least 75% and most preferred at least 90% with the amino acid sequence of the natural viral Has polypeptides.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine isolierte Nukleinsäure, die für ein Polypeptid wie zuvor angegeben, oder einen Abschnitt einer solchen Nukleinsäure von vorzugsweise mindestens 20, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 100 Nukleotiden kodiert. Die Nukleinsäure kann eine DNA, RNA oder auch ein Nukleinsäureanalogon sein. Erfindungsgemäße Nukleinsäuren umfassen aus Parapockenviren erhältliche Nukleinsäuren, daraus durch rekombinante DNA-Techniken erhältliche Nukleinsäuren und durch chemische Synthese hergestellte Nukleinsäuren. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure eine rekombinante Nukleinsäure, d. h. sie liegt in Verknüpfung mit weiteren Nukleinsäuresequenzen vor, mit denen sie natürlicherweise nicht assoziiert ist. Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure frei von weiteren polypeptidkodierenden Sequenzen aus Parapockenviren.Yet another aspect of the present invention is an isolated one Nucleic acid for a polypeptide as previously indicated, or a Section of such a nucleic acid of preferably at least 20, particularly preferably at least 50 and most preferably at least 100 nucleotides encoded. The nucleic acid can be a DNA, RNA or be a nucleic acid analog. Include nucleic acids according to the invention nucleic acids obtainable from parapox viruses, therefrom by recombinant DNA techniques available nucleic acids and by chemical synthesis prepared nucleic acids. The nucleic acid is preferably one recombinant nucleic acid, d. H. it is linked to others Nucleic acid sequences with which they are not naturally associated is. The nucleic acid according to the invention is preferably free of further polypeptide coding sequences from parapox viruses.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der mindestens eine Kopie einer Nukleinsäure wie zuvor angegeben enthält. Dieser Vektor kann ein beliebiger prokaryontischer oder eukaryonti scher Vektor sein, auf dem sich die erfindungsgemäße Nukleinsäure vorzugsweise unter Kontrolle eines Expressionssignals (Promotor, Operator, Enhancer etc.) befindet. Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäße Vektoren sind Plasmide oder virale Vektoren. Geeignete prokaryontische Vektoren sind beispielsweise bei Sambrook et al., supra, Kapitel 1-4 beschrieben. Beispiele für eukaryontische Vektoren finden sich bei Sambrook et al., supra, Kapitel 16. Yet another aspect of the present invention is a recombinant Vector containing at least one copy of a nucleic acid as previously indicated contains. This vector can be any prokaryotic or eukaryotic be a vector on which the nucleic acid according to the invention is based preferably under the control of an expression signal (promoter, operator, Enhancer etc.). Preferred examples of the invention Vectors are plasmids or viral vectors. Suitable prokaryotic Vectors are described, for example, in Sambrook et al., Supra, chapters 1-4 described. Examples of eukaryotic vectors can be found at Sambrook et al., Supra, chapter 16.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Wirtszelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transfiziert ist. Die Angabe "Transformation" im Sinne der vorliegenden Erfindung ist dabei in ihrer breiten Bedeutung zu verstehen und umfaßt auch Prozesse wie Transfektion oder Infektion.Yet another aspect of the present invention is a recombinant Host cell with a nucleic acid according to the invention or with a vector according to the invention is transfected. The indication "transformation" in The meaning of the present invention is in its broad meaning understand and also includes processes such as transfection or infection.
Die erfindungsgemäße Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle, ins besondere eine gram-negative prokaryontische Zelle, z. B. eine E.coli Zelle sein. Andererseits kann die Zelle jedoch auch eine eukaryontische Zelle sein, wie etwa eine Pilzzelle (z. B. Hefe), eine tierische, menschliche oder eine pflanzliche Zelle. Verfahren zur Transformation prokaryontischer oder eukaryontischer Zellen mit exogenen Nukleinsäuren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie geläufig.The host cell according to the invention can be a prokaryotic cell, ins especially a gram-negative prokaryotic cell, e.g. B. an E. coli cell be. On the other hand, the cell can also be a eukaryotic cell such as a fungal cell (e.g. yeast), an animal, human or one plant cell. Process for transforming prokaryotic or Eukaryotic cells with exogenous nucleic acids are known to the person skilled in the art familiar in the field of molecular biology.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch Antikörper, die gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid gerichtet sind. Vorzugsweise besitzen diese Antikörper keine Kreuzreaktivität mit humanen VEGF-Polypeptiden. Die erfindungsgemäßen Antikörper sind erhältlich durch Immunisierung von Versuchstieren, z. B. Mäusen, Ratten oder Kaninchen, mit erfindungs gemäßen Polypeptiden oder Abschnitten davon. Vorzugsweise werden zur Immunisierung Peptidabschnitte verwendet, die keine signifikante Homologie zu humanen VEGF-Polypeptiden aufweisen. Aus den immunisierten Versuchstieren können dann auf bekannte Weise polyklonale Antiseren bzw. Hybridomzellen, die zur Produktion monoklonaler Antikörper in der Lage sind, gewonnen werden. Neben polyklonalen und monoklonalen Antikörpern werden von der vorliegenden Erfindung auch Fragmente und Derivate solcher Antikörper erfaßt.In addition, the invention also relates to antibodies against an polypeptide according to the invention are directed. They preferably have Antibodies do not cross-react with human VEGF polypeptides. The Antibodies according to the invention are obtainable by immunization of Laboratory animals, e.g. B. mice, rats or rabbits with fiction appropriate polypeptides or portions thereof. Preferably be used Immunization used peptide sections that have no significant homology to human VEGF polypeptides. From the immunized Experimental animals can then polyclonal antisera or Hybridoma cells capable of producing monoclonal antibodies are won. In addition to polyclonal and monoclonal antibodies are also fragments and derivatives of the present invention such antibodies detected.
Das erfindungsgemäße Polypeptid wird vorzugsweise durch ein Verfahren hergestellt, bei dem man eine Wirtszelle, die mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist, bereitstellt, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, bei denen eine Expression des Polypeptids stattfindet, und das Polypeptid aus der Wirtszelle oder/und dem Kulturmedium gewinnt. Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Polypeptide aus prokaryontischen und eukaryontischen Zellen sind in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung ausführlich dargestellt.The polypeptide of the invention is preferably by a method prepared in which a host cell with an inventive Nucleic acid or is transformed with a vector according to the invention, provides, the host cell is cultivated under conditions where one Expression of the polypeptide takes place, and the polypeptide from the Host cell and / or the culture medium wins. Extraction process Polypeptides according to the invention from prokaryotic and eukaryotic Cells are detailed in the examples of the present application shown.
Ein wichtiger Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die als Wirkstoff ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder einen Abschnitt davon, vorzugsweise einen mindestens 25 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 50 und am meisten bevorzugt mindestens 75 Aminosäure langen Abschnitt davon, eine erfindungsgemäße Nu kleinsäure oder einen Abschnitt davon oder einen erfindungsgemäßen Vektor oder einen erfindungsgemäßen Antikörper gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen enthält. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann für diagnostische Anwendungen und insbesondere für therapeutische Anwendungen eingesetzt werden.An important aspect of the present invention is a pharmaceutical one Composition containing an inventive polypeptide or a portion thereof, preferably at least 25 amino acids, particularly preferably at least 50 and most preferably at least 75 amino acid long section thereof, a Nu according to the invention small acid or a portion thereof or an inventive Vector or an antibody according to the invention optionally together contains with pharmaceutically customary carriers, auxiliaries and additives. The The composition according to the invention can be used for diagnostic applications and are used in particular for therapeutic applications.
Diagnostische Anwendungen umfassen Verfahren zum Nachweis des erfindungsgemäßen Polypeptids, dafür kodierender Nukleinsäuren bzw. gegen das Polypeptid gerichteten Antikörpern in biologischen Proben. Solche Nachweisverfahren werden üblicherweise in Form von Immunoas says oder Nukleinsäurehybridisierungsassays durchgeführt. Derartige Verfahren sind dem Fachmann geläufig.Diagnostic applications include procedures for the detection of polypeptide according to the invention, nucleic acids coding therefor or antibodies directed against the polypeptide in biological samples. Such detection methods are usually in the form of immunoas says or nucleic acid hybridization assays. Such Methods are known to the person skilled in the art.
Therapeutische Anwendungen für die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfassen die Stimulierung der Angiogenese, die Stimulierung der Gewebereparatur oder die Modulation der Immunantwort, z. B. die Stimulierung der Endothelzellproliferation oder die Inhibition der funktionellen Differenzierung dendritischer Zellen. Die Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann nach Protokollen erfolgen, wie sie beispielsweise für humane VEGF Polypeptide bekannt sind, z. B. durch parenterale Verabreichung des Polypeptids. Weiterhin von Bedeutung ist die Anwendung der pharmazeutischen Zusammensetzung für die DNA-Vakzinierung oder für die Gentherapie. Hierzu kann auf bekannte Vektorsysteme zurückgegriffen werden, deren Einsatz für solche Zwecke bekannt ist. Darüber hinaus können auch als Vektorsysteme infektiöse Parapockenviren, insbesondere nichtpathogene Varianten davon eingesetzt werden.Therapeutic applications for the pharmaceutical according to the invention Composition include stimulation of angiogenesis Stimulating tissue repair or modulating the immune response, e.g. B. the stimulation of endothelial cell proliferation or the inhibition of functional differentiation of dendritic cells. The administration of the composition according to the invention can be carried out according to protocols, such as for example, they are known for human VEGF polypeptides, e.g. B. by parenteral administration of the polypeptide. The is also of importance Application of the pharmaceutical composition for the DNA vaccination or for gene therapy. This can be done using known vector systems can be used whose use is known for such purposes. In addition, infectious parapox viruses, in particular non-pathogenic variants thereof are used.
Neben den erfindungsgemäßen Polypeptiden, Nukleinsäuren oder Antikör pern kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung noch einen oder mehrere Wirkstoffe enthalten. Beispiele solcher Wirkstoffe sind bekannte Angiogenesefaktoren wie sie zuvor genannt wurden.In addition to the polypeptides, nucleic acids or antibodies according to the invention The pharmaceutical composition according to the invention can still be used contain one or more active ingredients. Examples of such active ingredients are known angiogenesis factors as previously mentioned.
Die vorliegende Erfindung wird darüber hinaus durch die nachfolgenden Beispiele und die Abb. 1 bis 10 erläutert.The present invention is further illustrated by the following examples and Figs. 1 to 10.
Das Gen D1701vegf wurde aus genomischer DNA des Orf Virus D1701 mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert (Standardtechnik nach Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989). Hierfür wurden die Oligonukleo tidprimer 5'-GGG TGA GAA TTC ATG AAG TTT CTC GTC GGC-3' und 5'- AAA GTT GGA TCC CTA GCG GCG TCT TCT GGG-3', die unmittelbar vor das ATG-Startkodon eine EcoRI-Schnittstelle und unmittelbar nach dem TAG-Stopkodon eine BamHI-Schnittstelle einführen, verwendet. Durch Standardtechniken wurde das ca. 420 bp große Amplifikat über die eingeführten EcoRI- und BamHI-Schnittstellen in den Vektor pSPT18 (Boehringer Mannheim) kloniert, wodurch das Plamid pVEGF gebildet wurde. Das in pVEGF klonierte 1701vegf Gen wurde über die EcoRI- und BamHI- Schnittstellen weiterhin in den Vektor pSK⁻(Stragene, Heidelberg) kloniert, wodurch das Plasmid pCD325 gebildet wurde.The D1701vegf gene was derived from genomic DNA of the Orf virus D1701 Amplified using the polymerase chain reaction (standard technique according to Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). For this, the oligonucleo tidprimer 5'-GGG TGA GAA TTC ATG AAG TTT CTC GTC GGC-3 'and 5'- AAA GTT GGA TCC CTA GCG GCG TCT TCT GGG-3 'immediately before the ATG start codon an EcoRI interface and immediately after TAG stop codon introduce a BamHI interface. By The approximately 420 bp amplificate was used as standard technique introduced EcoRI and BamHI interfaces in the vector pSPT18 (Boehringer Mannheim) cloned, whereby the plasmid pVEGF was formed. The 1701vegf gene cloned in pVEGF was isolated via the EcoRI and BamHI Interfaces still cloned into the vector pSK⁻ (Stragene, Heidelberg), whereby the plasmid pCD325 was formed.
Die rekombinante Expression von rPPV-VEGF erfolgte in Derivaten des Vektors pET-15b (Novagen, Madison, Wisconsin). Dieser auf T7-Polymerase basierende, IPTG-induzierbare Expressionsvektor ermöglicht die Expression von Fusionsproteinen, die N-terminal ein proteolytisch abspaltbares Peptid mit einer Hexa-Histidin-Sequenz für die Affinitätsreinigung des rekom binanten Proteins an Nickel-Chelat-Säulen tragen. Der fusionierte Teil des D1701vegf Gens wurde N-terminal um 20-Aminsäuren verkürzt, da dies etwa der Prozessierung des nativen Proteins bei der Abspaltung des Signalpeptids während der co-translationalen Translokation in eukaryonti schen Zellen entspricht (Abb. 4). Für die Klonierung des Expressions plasmids pCD369 wurde der Vektor pET-1 Sb mit Ndel geöffnet, die überhängenden Enden wurden durch Klenow-Poiymerase aufgefüllt und dann die an einem Ende gelegene BamHI Schnittstelle mit BamHI ge schnitten. Ein ca. 345 bp langes Genfragment von D1701vegf wurde durch Mvnl/BamHI Verdau des Plasmids pCD325 isoliert und direktionell in den im vorigen Schritt vorbereiteten Vektor pET-15b kloniert, wodurch das Plasmid pCD369 rekonstituiert wurde (Abb. 3a).The recombinant expression of rPPV-VEGF was carried out in derivatives of the vector pET-15b (Novagen, Madison, Wisconsin). This T7 polymerase-based, IPTG-inducible expression vector enables the expression of fusion proteins which carry a proteolytically cleavable peptide with a hexa-histidine sequence for the affinity purification of the recombinant protein on nickel chelate columns at the N-terminal. The fused part of the D1701vegf gene was shortened N-terminally by 20-amino acids, since this corresponds to the processing of the native protein when the signal peptide is split off during the co-translational translocation in eukaryotic cells ( Fig. 4). For the cloning of the expression plasmid pCD369, the vector pET-1 Sb was opened with Ndel, the overhanging ends were filled in by Klenow-Polymerase and then the BamHI site at one end was cut with BamHI. An approximately 345 bp gene fragment of D1701vegf was isolated by Mvnl / BamHI digestion of the plasmid pCD325 and cloned directionally into the vector pET-15b prepared in the previous step, whereby the plasmid pCD369 was reconstituted ( Fig. 3a).
Die alleinige Einführung von pCD369 in den E. coli Expressionsstamm BL21 (DE-3) (Novagen, Madison, Wisconsin) ermöglichte jedoch noch keine Expression des rekombinanten Fusionsproteins. Hierfür mußte zusätzlich das Plasmid pSB161 (Schenk et al., "Improved high-level expression system for eukaryotic genes in Escherichia coli using" T7 RNA polymerase and rare ArgtRNAs) eingeführt werden, welches die Überexpression einer seltenen ArgtRNA (argU) bewirkt. Hierdurch können in E. coli Gene überexprimiert werden die, wie viele eukaryontische Gene, eine kritische Anzahl der in E. coli seltener Argininkodons (AGG/AGA) enthalten (Brinkmann et al., "High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availabilitiy of the dnaY gene product", Gene 85: 109-114, 1989). Um die Expression des rekombinanten pPPV-VEGF Protein zu verbessern und die Stabilität des Expressionsplasmids zu verbessern, wurde aus den Plasmiden pCD369 und pSB161 das chimäre Plasmid pCD371 konstruiert, welches die positiven Merkmale der beiden Plasmide vereint und deren Nachteile weitgehend ausschließt: (1) Ein Lacq reprimiertes, IPTG-induzier bares T7-Polymerase abhängiges Expressionssytem für die Überexpression des Fusionsproteins nach Abb. 4, (2) Expression der seltenen ArgtRNA (argU) als Voraussetzung für die Überexpression des letzteren Fusionsproteins und (3) einen Kanamycinresistenz als geeigneteren Resistenzmarker im Vergleich zur Ampicillinresistenz in pCD369.However, the introduction of pCD369 alone into the E. coli expression strain BL21 (DE-3) (Novagen, Madison, Wisconsin) did not yet allow expression of the recombinant fusion protein. For this purpose, the plasmid pSB161 (Schenk et al., "Improved high-level expression system for eukaryotic genes in Escherichia coli using" T7 RNA polymerase and rare Arg tRNAs) had to be introduced, which causes the overexpression of a rare Arg tRNA (argU). As a result, genes can be overexpressed in E. coli which, like many eukaryotic genes, contain a critical number of arginine codons (AGG / AGA) which are rare in E. coli (Brinkmann et al., "High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the DNA gene product ", Gene 85: 109-114, 1989). In order to improve the expression of the recombinant pPPV-VEGF protein and to improve the stability of the expression plasmid, the chimeric plasmid pCD371 was constructed from the plasmids pCD369 and pSB161, which combines the positive features of the two plasmids and largely excludes their disadvantages: (1) Ein Lac q repressed, IPTG-inducible T7 polymerase-dependent expression system for the overexpression of the fusion protein according to FIG. 4, (2) expression of the rare Arg tRNA (argU) as a prerequisite for the overexpression of the latter fusion protein and (3) a kanamycin resistance as more suitable Resistance markers compared to ampicillin resistance in pCD369.
Für die Konstruktion des Expressionplasmids pCD371 (Abb. 3b) wurde pSB161 mit Nhel linearisiert und die überhängenden Enden mit Klenow- Polymerase aufgefüllt. pCD369 wurde mit Nrul/Sspl verdaut und ein 2844 bp großes Fragment mit dem lacq Gen und dem D1701vegf Gen in den im vorigen Schritt linearisierten Vektor pSB161 kloniert. pCD371 wurde dann in den Expressionsstamm BL21 (DE-3) transformiert. Dieser Expressions stamm erwies sich als stabil und geeignet für die Expression großer Mengen des rPPV-VEGF Fusionsproteins in E. coli.For the construction of the expression plasmid pCD371 ( Fig. 3b) pSB161 was linearized with Nhel and the overhanging ends were filled in with Klenow polymerase. pCD369 was digested with Nrul / Sspl and a 2844 bp fragment with the lac q gene and the D1701vegf gene was cloned into the vector pSB161 linearized in the previous step. pCD371 was then transformed into the expression strain BL21 (DE-3). This expression strain was found to be stable and suitable for the expression of large amounts of the rPPV-VEGF fusion protein in E. coli.
Für die Expression des rPPV-VEGF Fusionsproteins in E.coli wurde der Stamm BL21 (DE-3, pCD371) aus einem Glycerolstock in LB-Medium mit 30 µg/ml Kanamycin für 16 h in Schüttelkultur bei 37°C angezüchtet. Dann wurden 2 Liter desselben Mediums 1 : 100 mit der Kultur angeimpft und bis zu einer optischen Dichte (OD 550 nm) von 0,3 unter gleichen Bedingungen inkubiert. Nach Zugabe von IPTG (1 mM Endkonzentration) wurde für weitere 2 h inkubiert. Die Bakterien wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und in Aufschluß-Puffer (5 mM Imidazol, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) resuspendiert und bei 4°C durch Ultraschall aufge schlossen. Nach Zentrifugation für 30 min bei 17 000 rpm, 4°C wurde löslicher rPPV-VEGF aus dem Überstand anhand des Hexa-Histidin-Tags durch Affinitätschromatographie an einer Ni-Chelat Säule entsprechend den Angaben des Herstellers (Novagen, Madison, Wisconsin, Protokoll für native Reinigung) gebunden und durch Waschen mit mindestens 10 Säulenvolu mina von kontaminierenden Substanzen abgetrennt.For the expression of the rPPV-VEGF fusion protein in E. coli the Strain BL21 (DE-3, pCD371) from a glycerol stock in LB medium with 30 µg / ml kanamycin was grown for 16 h in shake culture at 37 ° C. Then 2 liters of the same medium were inoculated 1: 100 with the culture and until to an optical density (OD 550 nm) of 0.3 under the same conditions incubated. After adding IPTG (1 mM final concentration) for incubated for a further 2 h. The bacteria were then centrifuged pelleted and in digestion buffer (5 mM imidazole, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7.9) and resuspended at 4 ° C by ultrasound closed. After centrifugation for 30 min at 17,000 rpm, 4 ° C soluble rPPV-VEGF from the supernatant using the hexa-histidine tag by affinity chromatography on a Ni chelate column according to the Manufacturer information (Novagen, Madison, Wisconsin, protocol for native Cleaning) and by washing with at least 10 column volumes mina separated from contaminating substances.
Nach der Elution wurde die Proteinlösung durch Ultrafiltration mit Centricon- Säulen entsprechend den Angaben des Herstellers (Amicon, Beverly, MA) eingeengt. Ein weiterer Reinigungsschritt von rPPV-VEGF erfolgte durch Gelfiltration über Superose 12 h in PBS-Puffer, wodurch Dimere größtenteils von verbliebenen Monomeren abgetrennt werden konnten. Dann wurde der Histidin-Tag durch Verdau mit 1 U biotinyliertem Thrombin/mg Fusions protein für 6,5 h bei Raumtemperatur entsprechend den Angaben des Herstellers (Novagen, Madison, Wisconsin) abgespalten und das biotinylierte Thrombin an Streptavidin-Sepharose adsorbiert. Der abgespaltene Histidin- Tag wurde an einer Ni-Chelat Säule entsprechend den Angaben des Herstellers (Novagen, Madison, Wisconsin) adsorbiert. Nach erneutem Einengen des Säulendurchflusses durch Ultrafiltration wurde ein letzter Gelfiltrationsschritt über eine Sephacryl S-200 Säule in PBS Puffer durch geführt. Die Homogenität des eluierten rPPV-VEGF wurde durch SDS-PAGE und nachfolgende Silberfärbung nach Standardtechniken nachgewiesen. Proteinbestimmung mit dem Bradford-Reagenz (Biorad) wurden ent sprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Endotoxinbestimmun gen wurden mit dem Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Coattest (Chromoge nix, Mölndal, Schweden) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. After elution, the protein solution was ultrafiltered with Centricon Columns according to the manufacturer's instructions (Amicon, Beverly, MA) constricted. Another cleaning step of rPPV-VEGF was carried out by Gel filtration over Superose 12 h in PBS buffer, resulting in dimers for the most part could be separated from remaining monomers. Then the Histidine day by digestion with 1 U biotinylated thrombin / mg fusion protein for 6.5 h at room temperature according to the instructions of the Manufacturer (Novagen, Madison, Wisconsin) split off and the biotinylated Thrombin adsorbed on streptavidin-Sepharose. The split off histidine Day was carried out on a Ni chelate column according to the information from the Manufacturer (Novagen, Madison, Wisconsin) adsorbed. After again Concentration of column flow through ultrafiltration became a last Gel filtration step through a Sephacryl S-200 column in PBS buffer guided. The homogeneity of the eluted rPPV-VEGF was determined by SDS-PAGE and subsequent silver staining demonstrated using standard techniques. Protein determination with the Bradford reagent (Biorad) were ent carried out according to the manufacturer's instructions. Determine endotoxin genes were tested with the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Coattest (Chromoge nix, Mölndal, Sweden) according to the manufacturer's instructions carried out.
Die Stimulierung der Proliferation von primären Endothelzellen aus der Vene der menschlichen Nabelschnur ("Human umbilical vein endothelial cells" im folgenden als HUVECs bezeichnet) stellt das übliche Verfahren zum Nachweis der mitogenen Wirkung von VEGF Wachstumsfaktoren auf Endothelzellen dar. HUVECs wurden entsprechend Dehio et al., ("Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulfment and internalisation of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome", J. Cell Science 110: 2141-2154, 1997) präpariert und kultiviert und von Passage 4 bis 9 für Proliferationsassays eingesetzt. Hierfür wurden HUVECs mit einer Dichte von 50000 Zellen/ml in Gelatine-beschichteten Beschichtung mit (0,2%iger Lösung bei 37°C für 30 min) 24 Well-Platten im Medium 199 mit 10% dekomplementiertem FCS eingesät und für 16 h bei 37°C/5% CO2 inkubiert. Dann wurde das Medium gegen gleiches Medium mit der Testsubstanz ausgetauscht und nach weiteren 72 h Inkubation der Zellen bei 37°C/5% CO2 wurde die Zellzahl durch Auszählen eines definierten mikroskopischen Feldes bestimmt. Für die Bestimmung des Proliferations faktors wurde als Referenzprobe Medium ohne weitere Zusätze verwendet, der Proliferationsfaktor einer Probe ergibt sich aus dem Quotienten der Zellzahlen bezogen auf diese Referenzprobe.The stimulation of the proliferation of primary endothelial cells from the vein of the human umbilical cord ("Human umbilical vein endothelial cells" hereinafter referred to as HUVECs) is the usual method for demonstrating the mitogenic effect of VEGF growth factors on endothelial cells. HUVECs were developed according to Dehio et al. , ("Interaction of Bartonella henselae with endothelial cells results in bacterial aggregation on the cell surface and the subsequent engulfment and internalization of the bacterial aggregate by a unique structure, the invasome", J. Cell Science 110: 2141-2154, 1997) and cultivated and used from passage 4 to 9 for proliferation assays. For this, HUVECs with a density of 50,000 cells / ml in gelatin-coated coating with (0.2% solution at 37 ° C. for 30 min) 24 well plates were sown in medium 199 with 10% decomplemented FCS and for 16 hours Incubated 37 ° C / 5% CO 2 . Then the medium was exchanged for the same medium with the test substance and after a further 72 h incubation of the cells at 37 ° C./5% CO 2 , the cell number was determined by counting a defined microscopic field. For the determination of the proliferation factor, medium without further additives was used as the reference sample; the proliferation factor of a sample results from the quotient of the cell numbers based on this reference sample.
Für die Expression von PPV-VEGF in eukaryontischen Zellen wurde das Gen D1701vegf in den Expressionsvektor pCB6-Bam (Abb. 8a) kloniert. pCB6-Bam ist ein Plasmid von 6189 bp Länge, welches über folgende funktionell en Sequenzelemente verfügt: Den Replikationsursprung ColE1 und das Ampicillinresistenz-kodierende Gen bla, welches Klonierung und Plasmid präparation in E. coli ermöglicht, eine Expressionskassette für das neo Gen, welches in transfizierten eukaryontischen Zellen Resistenz gegen Geniticin verleiht; einen Cytomegalovirus (CMV)-Promotor, gefolgt von einem Polylinker und einer hGll-Polyadenylierungsstelle für die Expression eines beliebigen Gens in eukaryontischen Zellen durch Insertion der kodierenden Sequenzen in den Polylinker. Das Leseraster des in pVEGF bzw. pCD325 klonierten D1701vegf Gens wird direkt durch die zuvor rekombinant eingeführten EcoRI- bzw. BamHI-Schnittstellen eingerahmt. Für die effiziente Expression von D1701vegf in eukaryontischen Zellen scheinen jedoch wenige Nukleotide der viralen Sequenz stromaufwärts vom Translations startpunkt von Bedeutung zu sein. Deshalb wurden durch geeignete Primer 22 Nukleotide der ursprünglichen viralen Sequenz vor dem ATG-Startkodon wieder eingeführt, gleichzeitig davor eine HindIII Schnittstelle für die direktionale Klonierung des Amplifikats. Für die Polymerasekettenreaktion nach Standardtechniken wurde das Plasmid pCD325 als Template und die Oligonukleotide 5'-GGG GAA GCT TAC TTT TAA GGG TGA GGC GCC ATG AAG TTT CTC GTC GGC ATA CTG-3' und 5'-CGC GGA TCC CTA GCG GCG TCT TCT G-3' als Amplifikationsprimer eingesetzt. Das Amplifikat wurde durch Standardtechniken über die Schnittstellen HindIII und BamHI in den Vektor pCB6-Bam kloniert, was in der Bildung des Plasmids pCD379 (Abb. 8b) resultierte.For the expression of PPV-VEGF in eukaryotic cells, the gene D1701vegf was cloned into the expression vector pCB6-Bam ( Fig. 8a). pCB6-Bam is a plasmid of 6189 bp in length, which has the following functional sequence elements: the origin of replication ColE1 and the ampicillin resistance-coding gene bla, which enables cloning and plasmid preparation in E. coli, an expression cassette for the neo gene which is present in confers resistance to geniticin to transfected eukaryotic cells; a cytomegalovirus (CMV) promoter followed by a polylinker and an hGll polyadenylation site for the expression of any gene in eukaryotic cells by inserting the coding sequences into the polylinker. The reading frame of the D1701vegf gene cloned in pVEGF or pCD325 is framed directly by the previously recombinantly introduced EcoRI or BamHI cleavage sites. For the efficient expression of D1701vegf in eukaryotic cells, however, a few nucleotides of the viral sequence upstream from the translation start point seem to be important. For this reason, 22 nucleotides of the original viral sequence in front of the ATG start codon were reintroduced by means of suitable primers, at the same time a HindIII interface for the directional cloning of the amplificate. The plasmid pCD325 was used as template and the oligonucleotides 5'-GGG GAA GCT TAC TTT TAA GGG TGA GGC GCC ATG AAG TTT CTC GTC GGC ATA CTG-3 'and 5'-CGC GGA TCC CTA GCG GCG TCT TCT for the polymerase chain reaction according to standard techniques G-3 'used as an amplification primer. The amplificate was cloned into the vector pCB6-Bam via standard HindIII and BamHI interfaces, which resulted in the formation of the plasmid pCD379 ( FIG. 8b).
Plasmid-DNA des eukaryontischen Expressionsvektors pCD371 für Transfektionsexperimente wurde mit dem Qiagen Midi Kit (Qiagen, Hilden) entsprechend den Angaben des Herstellers präpariert. COS-7 Zellen wurden entsprechend der Ca-Phosphat-Kopräzipitationstechnik (Standardtechnik nach Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989) mit dem PPV-VEGF Ex pressionsplasmid pCD379 bzw. dem leeren Expressionsvektor pCB6-Bam transfiziert. Von 24 h bis 72 h nach der Transfektion wurde Medium (M199/10% dekomplementiertes FCS) auf den transfizierten Zellen konditioniert. Nach dem Abernten der Kulturüberstände wurden diese für 15 min zentrifugiert und anschließend durch 0,22 µm Filter filtriert. Dann wurden Verdünnungen hiervon in einem HUVEC Proliferationsassay ent sprechend Beispiel 4 getestet.Plasmid DNA of the eukaryotic expression vector pCD371 for Transfection experiments were carried out with the Qiagen Midi Kit (Qiagen, Hilden) prepared according to the manufacturer's instructions. COS-7 cells were according to the Ca-phosphate coprecipitation technique (standard technique according to Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Edition) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) with the PPV-VEGF Ex pressionsplasmid pCD379 or the empty expression vector pCB6-Bam transfected. Medium became from 24 h to 72 h after the transfection (M199 / 10% decomplemented FCS) on the transfected cells conditioned. After harvesting the culture supernatants, they were used for Centrifuged for 15 min and then filtered through a 0.22 µm filter. Then dilutions were made in a HUVEC proliferation assay tested according to example 4.
BKKL3A Zellen, oder andere Zellkulturen aus der Kälberniere oder -lunge, bzw. aus der Haut von Schaf, Rind oder Mensch wurden durch Standard techniken mit Orf-Viren und einer Multiplizität der Infektion von 0,1-10 für 4-48 h infiziert. Zellkulturüberstände werden dann durch 0,1 µm Filter abfiltriert, die selbst die Viruspartikel zurückhalten, und in einem HUVEC Proliferationsassay entsprechend Beispiel 4 getestet.BKKL3A cells, or other cell cultures from the calf kidney or lung, or from the skin of sheep, cattle or human beings by standard techniques with Orf viruses and an infection multiplicity of 0.1-10 for Infected for 4-48 h. Cell culture supernatants are then filtered through 0.1 µm filters filtered off, which itself hold back the virus particles, and in a HUVEC Proliferation assay tested according to Example 4.
Claims (25)
- (a) einer Aminosäuresequenz, die von einer der in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäuresequenzen kodiert ist,
- (b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinand erfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder
- (c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).
- (a) an amino acid sequence encoded by one of the nucleic acid sequences shown in Fig. 1 (a), (b) and (c),
- (b) an amino acid sequence which contains at least 25 consecutive amino acid residues of one of the amino acid sequences from (a), or
- (c) an amino acid sequence with an identity of at least 50% to one of the amino acid sequences from (a).
- (a) einer Aminosäuresequenz, die von der in Abb. 1(c) dargestell ten Nukleinsäuresequenz kodiert ist,
- (b) einer Aminosäuresequenz, die mindestens 25 aufeinand erfolgende Aminosäurereste einer der Aminosäuresequenzen aus (a) enthält, oder
- (c) einer Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 50% zu einer der Aminosäuresequenzen aus (a).
- (a) an amino acid sequence encoded by the nucleic acid sequence shown in Fig. 1 (c),
- (b) an amino acid sequence which contains at least 25 consecutive amino acid residues of one of the amino acid sequences from (a), or
- (c) an amino acid sequence with an identity of at least 50% to one of the amino acid sequences from (a).
- (a) den in Abb. 1(a), (b) und (c) dargestellten Nukleinsäurese quenzen,
- (b) Nukleinsäuresequenzen, die im Rahmen der Degeneration des genetischen Codes einer Nukleinsäure gemäß (a) entsprechen, und
- (c) Nukleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure gemäß (a) oder/und (b) hybridisieren.
- (a) the nucleic acid sequences shown in Fig. 1 (a), (b) and (c),
- (b) nucleic acid sequences which correspond to a nucleic acid according to (a) in the context of the degeneration of the genetic code, and
- (c) Nucleic acids which hybridize under stringent conditions with a nucleic acid according to (a) or / and (b).
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998113774 DE19813774A1 (en) | 1998-03-27 | 1998-03-27 | Parapox virus-encoded vascular endothelial cell growth factor (PPV-VEGF) |
| AU31477/99A AU3147799A (en) | 1998-03-27 | 1999-03-26 | Para-poxvirus-coded vascular endothelial cell growth factor (ppv-vegf) |
| PCT/EP1999/002057 WO1999050290A1 (en) | 1998-03-27 | 1999-03-26 | Para-poxvirus-coded vascular endothelial cell growth factor (ppv-vegf) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1998113774 DE19813774A1 (en) | 1998-03-27 | 1998-03-27 | Parapox virus-encoded vascular endothelial cell growth factor (PPV-VEGF) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE19813774A1 true DE19813774A1 (en) | 1999-09-30 |
Family
ID=7862689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE1998113774 Withdrawn DE19813774A1 (en) | 1998-03-27 | 1998-03-27 | Parapox virus-encoded vascular endothelial cell growth factor (PPV-VEGF) |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU3147799A (en) |
| DE (1) | DE19813774A1 (en) |
| WO (1) | WO1999050290A1 (en) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE324902T1 (en) * | 1998-11-02 | 2006-06-15 | Ludwig Inst Cancer Res | A VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-RELATED PROTEIN FROM ORF VIRUS NZ10 BINDS AND ACTIVATES THE MAMMAL VEGF RECEPTOR-2 |
| US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
| JP2004537260A (en) | 2000-12-07 | 2004-12-16 | サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド | Regulation of angiogenesis by zinc finger proteins |
| CN1903880B (en) * | 2006-08-02 | 2010-05-12 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | Anti-tumor vascular endothelial growth factor VEGF-E antigen and its coding gene and application |
| US9314505B2 (en) * | 2012-05-18 | 2016-04-19 | Otago Innovation Limited | Combination treatments and compositions for wound healing comprising viral VEGF |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5194596A (en) * | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
| US6410322B1 (en) * | 1993-07-27 | 2002-06-25 | Hybridon Inc | Antisense oligonucleotide inhibition of vascular endothelial growth factor expression |
| US5928939A (en) * | 1995-03-01 | 1999-07-27 | Ludwig Institute For Cancer Research | Vascular endothelial growth factor-b and dna coding therefor |
| DE19639601A1 (en) * | 1996-02-28 | 1997-09-04 | Bayer Ag | Parapox viruses that contain foreign DNA, their production and their use in vaccines |
| IL126349A0 (en) * | 1996-03-29 | 1999-05-09 | Univ Otago | Parapoxvirus vectors |
| DE19638745C2 (en) * | 1996-09-11 | 2001-05-10 | Schering Ag | Monoclonal antibodies against the extracellular domain of the human VEGF receptor protein (KDR) |
| EA199900861A1 (en) * | 1997-04-25 | 2000-06-26 | Коллатерал Терапьютикс | TRACKED PROTEINS, RELATED GROWTH ENDOTHELIUM GROWTH FACTOR |
-
1998
- 1998-03-27 DE DE1998113774 patent/DE19813774A1/en not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-03-26 WO PCT/EP1999/002057 patent/WO1999050290A1/en not_active Ceased
- 1999-03-26 AU AU31477/99A patent/AU3147799A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU3147799A (en) | 1999-10-18 |
| WO1999050290A9 (en) | 1999-12-09 |
| WO1999050290A1 (en) | 1999-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DE3689845T2 (en) | RECOMBINANT FIBROBLAST GROWTH FACTOR. | |
| DE69129989T2 (en) | MEDICINAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING MALIGNER TUMORS | |
| DE60131146T2 (en) | MATERIALS AND METHODS CONTAINING HYBRID VASCULAR ENDOTHELIC GROWTH FACTORS DNA AND PROTEINS AND SCREENING METHOD FOR MODULATORS | |
| EP2107109B1 (en) | Recombinant vascular endothelial cell growth factor D (VEGF-D) | |
| DE69521331T2 (en) | NUCLEIC ACID ENTRY SYSTEM | |
| DE69631544T2 (en) | Obesity protein (ob) to increase lean body mass | |
| DE60219611T2 (en) | MODIFIED ANNEXIN PROTEINS AND PREVENTION AND TREATMENT OF THROMBOSE | |
| DE69531387T2 (en) | Recombinant vectors derived from adenovirus, for gene therapy | |
| EP0538300A1 (en) | O-GLYCOSYLATED IFN ALPHA. | |
| WO1999005268A1 (en) | Production of erythropoietin by endogenous gene activation | |
| DE10235248A1 (en) | Novel fusion protein having enhanced in vivo activity useful for treating anemia, comprises carboxy terminal peptide of thrombopoietin fused with carboxy terminal of human erythropoietin | |
| JP2003507006A (en) | Vascular endothelial growth factor variant | |
| DE19535853C2 (en) | Variants of recombinant human interferon gamma, process for their preparation and their use | |
| JPH09503751A (en) | Monogenic formulations of cytotoxic conjugates | |
| DE69333738T2 (en) | THERAPEUTIC DOMAINS OF THE WILLEBRAND FACTOR | |
| DE69432608T2 (en) | EXPRESSION OF INHIBITORS OF THE PLASMINOGEN ACTIVATOR OF THE UROKINASE TYPE | |
| DE69102651T2 (en) | PROTEASER-RESISTANT PDGF AND ITS USES. | |
| DE69636052T2 (en) | MPL-LIGAND ANALOGUE | |
| DE69524415T2 (en) | UNSPLEATED VARIANTS OF THE GP350 / 220 | |
| DE60130100T2 (en) | EXPRESSION AND SECRETION VECTOR FOR HUMAN INTERFERON ALPHA AND PROCESS FOR PREPARING INTERFERON ALPHA THEREOF BY USING THEREOF | |
| AU719526B2 (en) | New form of amphiregulin, methods for producing and using the same and compositions comprising the same | |
| JPH10507452A (en) | Purification of keratinocyte growth factor | |
| JP2000178207A (en) | Use of erythropoietin for treatment of anemia in pets and domestic animals | |
| DE19813774A1 (en) | Parapox virus-encoded vascular endothelial cell growth factor (PPV-VEGF) | |
| DE68907941T2 (en) | Polypeptides with cell expansion activity. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |