DE1173090B - Process for the preparation of 16ª ‡ -hydroxysteroids - Google Patents
Process for the preparation of 16ª ‡ -hydroxysteroidsInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung von 16a-Hydroxysteroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Herstellung von 16_-Hydroxysteroiden mit 19 bis 21 Kohlenstoffatomen, wobei einige neue 16a-Hydroxy-17.x-methyl-androstenole der normalen und 19-nor-Reihe krebshemmende Wirkung besitzen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein mikrobiologisches Verfahren, um eine Hydroxylgruppe in die 16x-Stellung eines entsprechenden Steroidmoleküls durch Verwendung des neuen Mikroorganismus Nocardia italica n. sp. einzuführen, der bei National Collection of Industrial Bacteria unter dem Kennzeichen N.C.I.B. 9386 sowie am Institute of Microbiology of the Rutgers University USA. unter dem Kennzeichen 3856 hinterlegt wurde.Method of Making 16a-Hydroxysteroids The invention relates to on a new process for the production of 16_-hydroxysteroids with 19 bis 21 carbon atoms, some new 16a-hydroxy-17.x-methyl-androstenols being the normal and 19-nor series have cancer-inhibiting effects. In particular, relates the present invention relates to a microbiological method to add a hydroxyl group into the 16x position of a corresponding steroid molecule by using the new one Microorganism Nocardia italica n. Sp. introduce that at National Collection of Industrial Bacteria under the designation N.C.I.B. 9386 and at the Institute of Microbiology of the Rutgers University USA. deposited under the registration number 3856 became.
Die schon in der Literatur bekannten 16a-Hydroxysteroide werden als Zwischenprodukte zur Herstellung therapeutisch wertvoller Substanzen oder als entzündungshemmende Mittel angewandt und werden unter Verwendung gewisser Mikroorganismen hergestellt. Die wichtigsten dieser sind: Streptomyces roseochromogenus (südafrikanische Patentschrift 3300 aus dem Jahre l958), Streptomyces ATCC 13278 und Streptomyces ATCC 13279 (indische Patentschriften 67 019 und 69 056), Streptomyces viridis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces argenteolus (USA-Patentschriften 2 709 705 und 2 855 343). In der Literatur werden andere Stämme erwähnt, die fähig sind, eine Hydroxylgruppe in die 16_@-Stellung eines Steroids einzuführen; es sind dies: Actinomyces lavendulae, Pestallotia funerea, Didimella vodakii, Streptomyces mediocidicus, Streptomyces halstedii u. a., noch weniger wichtige.The 16a-hydroxysteroids already known in the literature are called Intermediate products for the production of therapeutically valuable substances or as anti-inflammatory Agents are applied and are made using certain microorganisms. The most important of these are: Streptomyces roseochromogenus (South African patent specification 3300 from 1958), Streptomyces ATCC 13278 and Streptomyces ATCC 13279 (Indian Patents 67 019 and 69 056), Streptomyces viridis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces argenteolus (U.S. Patents 2,709,705 and 2,855,343). In the literature other strains are mentioned which are capable of placing a hydroxyl group in the 16 _ @ position introduce a steroid; they are: Actinomyces lavendulae, Pestallotia funerea, Didimella vodakii, Streptomyces mediocidicus, Streptomyces halstedii and others, nor less important.
Der erfindungsgemäß neue angewandte Mikroorganismus wurde Nocardia italica n. sp. benannt und gehört zu dem Stamm Nocardia Trevisan. Mittels dieses Stammes kann eine Hydroxylgruppe in die 16_x-Stellung eines Steroids eingeführt werden; dies war bis jetzt noch nicht bekannt. Die Anwendung des besagten Mikroorganismus ermöglicht eine hohe Umwandlungsausbeute (70 bis 80 °/o) und eine hohe Steroidkonzentration in der Kulturbrühe (0,1 °/o). Beschreibung und Identifizierung des Stammes Der neue Mikroorganismus Nocardia italica, isoliert von einer Bodenprobe, weist die folgenden morphologischen, kulturellen und biochemischen Eigenschaften auf: Auf den üblichen Agar enthaltenden Nährböden bildet der Mikroorganismus anfangs ein ausgedehntes Mycel von reich verzweigten, ungeteilten Hyphen; nach 3 bis 4 Tagen bemerkt man das Erscheinen von Querwänden, und danach wird das Mycel in Bruchstücke von verschiedener Form und Länge (4 bis 8 p.) zerlegt. Die Hyphendicke beträgt etwa 0,5 bis 0,7 #t. Auf den flüssigen Böden geschieht die Zerlegung zwischen dem 2. und 3. Tag nach der Entstehung; die !I- und Y -Formen wiederholen sich; die Coccoidformen treten nicht hervor, Auf keinem Nährboden bildet sich Luftmycel.The new microorganism used according to the invention was Nocardia italica n. sp. named and belongs to the tribe Nocardia Trevisan. By means of this A hydroxyl group can be introduced into the 16_x position of a steroid will; this was not yet known. The application of the said microorganism enables a high conversion yield (70 to 80%) and a high steroid concentration in the culture broth (0.1%). Description and identification of the tribe The new one The microorganism Nocardia italica, isolated from a soil sample, has the following morphological, cultural and biochemical properties: on the usual The microorganism initially forms an extensive culture medium containing agar Mycelium of richly branched, undivided hyphae; one notices after 3 to 4 days the appearance of transverse walls, and after that the mycelium becomes in fragments of various Shape and length (4 to 8 p.) Broken down. The hyphae thickness is about 0.5 to 0.7 #t. On the liquid soils, the decomposition takes place between the 2nd and 3rd day after the emergence; the! I and Y forms are repeated; the coccoid forms occur does not emerge, aerial mycelium does not form on any nutrient medium.
Das Mycel ist grampositiv und teilweise säurefest.The mycelium is gram-positive and partially acid-resistant.
Die Kultureigenschaften sind in der folgenden Tabelle angegeben; die
Prüfungen sind nach 10, 15, 20 und 25 Inkubationstagen bei 28° C durchgeführt worden.
Die Kulturen sind für jeden Nährboden in sechsfacher Wiederholung ausgeführt worden.
Produktion der Säuren: Positiv aus Maltose, d-Xylose, d-Mannose, Mannit, Glyzerin, Glukose, Lävulose; negativ aus Laktose, Adonit, d-Sorbit,1-Arabinose, Saccharose, Trehalose, Raffinose, Äsculin.Production of acids: positive from maltose, d-xylose, d-mannose, mannitol, Glycerine, glucose, levulose; negative from lactose, adonitol, d-sorbitol, 1-arabinose, Sucrose, trehalose, raffinose, esculin.
Da die Beschreibung des untersuchten Mikroorganismus derjenigen der Gattung Nocardia Trevisan, gemäß der Bergeyschen Literaturschrift: »Manual of determinative Bacteriology« (7. Auflage 1957, S. 713 bis 715) entspricht, kann man annehmen, daß der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus zur Gattung Nocardia Trevisan gehört.Since the description of the microorganism studied is that of those of the Genus Nocardia Trevisan, according to Bergey's literature: »Manual of determinative Bacteriology '(7th edition 1957, pp. 713 to 715), one can assume that the microorganism used in the present invention belongs to the genus Nocardia Trevisan.
Aus dem analytischen Schlüssel der Nocardia-Arten von Waksman und Henrici (Waksman and L e c h e v a 1 i e r , Guide to the Classif cation and identification of the Actinomycetes and their antibiotics, 1953) ergibt sich für den untersuchten Mikroorganismus eine der Nocar dia flava nahestehende systematische Lage (K r a s s i 1 n i k o w , 1938;WaksmanundHenrici,1948). Dennoch unterscheidet sich die besagte Gattung von Nocardia flava, weil sie teilweise säurefest ist, weil sie Gelatine verflüssigt und Milch peptonisiert und weil das Mycel keine fragmentartige Kokkenformen bildet; sie steht nahe der Nocardia lutea Christopherson und Archibald 1918, von der sie sich jedoch unterscheidet, weil sie Gelatine verflüssigt und weil sie kein rosa- oder rotgefärbtes Mycel auf irgendeinem der geprüften Böden aufweist und weiterhin, weil sie kein Luftmycel auf Kartoffelscheiben bildet.From the analytical key of the Nocardia species by Waksman and Henrici (Waksman and L e c h e v a 1 i e r, Guide to the Classification and Identification of the Actinomycetes and their antibiotics, 1953) results for the investigated Microorganism a systematic situation closely related to Nocar dia flava (K r a s s i 1 n i k o w, 1938; Waksman and Henrici, 1948). Still, it differs Said genus of Nocardia flava, because it is partially acid-proof, because it is gelatin liquefied and milk peptonized and because the mycelium does not have fragment-like cocci forms forms; it is close to the Nocardia lutea Christopherson and Archibald 1918, from However, it differs because it liquefies gelatin and because it does not has pink or red colored mycelium on any of the tested soils and furthermore, because it does not form aerial mycelium on potato slices.
Daraus kann geschlossen werden, daß der untersuchte Mikroorganismus noch nicht isoliert und beschrieben worden ist.From this it can be concluded that the microorganism studied has not yet been isolated and described.
Der Mikroorganismus N.italia kann nach Gefriertrocknung aufbewahrt werden, wobei Milch oder Milchserum als Aufschlämmungsmittel gebraucht werden. Man kann ihn auch durch wiederholte Züchtung auf Kartoffel-Glukose-Agar aufbewahren.The N.italia microorganism can be stored after freeze-drying using milk or milk serum as a slurry agent. Man can also keep it by repeated cultivation on potato glucose agar.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Einführung einer Hydroxylgruppe in die 161-Stellung des Steroidkernes ist auf die Steroidverbindungen anwendbar, die 19 bis 21 Kohlenstoffatome und eine Methylengruppe in der 16-Stellung haben. Die genannten Steroide können in ihrem Kern z. B. eine oder mehrere Doppelbindungen in 1-, 4-. 6- und 9(11)-Stellung, Halogensubstituenten in 6- und 9-Stellung, eine oder mehrere Hydroxyl- oder Alkoxylgruppen in 9-, 11-, 17- und 21-Stellung, eine oder mehrere Ketongruppen in 3-, 11 -. 17- und 20-Stellung und eine oder mehrere Alkylgruppen in 6- und 17-Stellung haben.The method of the present invention for introducing a hydroxyl group in the 161 position of the steroid nucleus is applicable to the steroid compounds, which have 19 to 21 carbon atoms and a methylene group in the 16-position. The steroids mentioned can in their core z. B. one or more double bonds in 1-, 4-. 6- and 9 (11) -position, halogen substituents in 6- and 9-position, a or more hydroxyl or alkoxyl groups in the 9-, 11-, 17- and 21-position, one or more ketone groups in 3-, 11 -. 17 and 20 positions and one or more Have alkyl groups in the 6- and 17-positions.
Besondere Beispiele für Steroide, die dem Fermentationsverfahren mittels N.italica unterworfen werden können, sind: Progesteron, Cortison, Hydrocortison, Testosteron, Reichsteins Verbindung S, Desoxycorticosteron, 9x-Fluor-hydrocortison, 9x-Fluor-prednisolon, 4-Androsten-3 17-dion 9x-Chlor-hydrocortison, 9x-Brom-hydrocortison,11-Epi-hydrocortison, 9x-Fluor-cortison, 9x-Methoxy-cortison, 6x-Fluorhydrocortison, 6x-Methyl-hydrocortison, 4,6-Pregnadien-llß, 17a,21-triol-3,20-dion, 17x-Methyl-19-nor-testosteron, 4-Hydroxy-17,x-methyl-testosteron, 4-Hydroxy-17xmethyl-19-nor-testosteron.Specific examples of steroids that means the fermentation process N.italica to be subjected can are: progesterone, cortisone, Hydrocortisone, testosterone, Reichstein's compound S, deoxycorticosterone, 9x-fluorohydrocortisone, 9x-fluoro-prednisolone, 4-androsten-3 17-dione 9x-chloro-hydrocortisone, 9x-bromo-hydrocortisone, 11-epi-hydrocortisone, 9x-fluorocortisone, 9x-methoxy-cortisone, 6x-fluorohydrocortisone, 6x-methyl-hydrocortisone, 4,6-pregnadiene-llß, 17a, 21-triol-3,20-dione, 17x-methyl-19-nor-testosterone, 4-hydroxy-17, x-methyl-testosterone, 4-Hydroxy-17xmethyl-19-nor-testosterone.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Einführung eines Hydroxyls in die 16x-Stellung des Steroidkernes besteht nun im wesentlichen darin, daß Nocardia italica nach an sich bekannten Methoden auf Nährböden und unter geeigneten Bedingungen gezüchtet wird, worauf das zu hydroxylierende 16-Desoxysteroid der Pilzeinwirkung oder der Einwirkung der Pilzenzyme ausgesetzt wird. Das besagte Steroid kann den Kulturen sowohl bei Impfung des Mediums unter sterilen Bedingungen mit einer Kultur des Mikroorganismus als auch nach beendigtem Wachstum desselben entweder in Kristallform oder als Lösung in geeigneten Lösungsmitteln wie Methylalkohol, Äthylalkohol, Aceton, Dimethylformamid u. a. zugefügt werden.The inventive method for introducing a hydroxyl into the The 16x position of the steroid nucleus essentially consists in the fact that Nocardia italica cultivated according to methods known per se on nutrient media and under suitable conditions whereupon the 16-deoxysteroid to be hydroxylated to the action of the fungus or the Exposure to fungal enzymes. Said steroid can be added to cultures both when the medium is inoculated under sterile conditions with a culture of the microorganism as well as after it has finished growing either in crystal form or as a solution in suitable solvents such as methyl alcohol, ethyl alcohol, acetone, dimethylformamide i.a. be added.
Die Nährböden bestehen aus einer Kohlenstoff-und Stickstoffquelle und anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquelle können Stärke, Dextrin, Saccharose, Glucose, Maltose, Glyzerin, pflanzliche Öle, Getreide-oder Hülsenfruchtmehl, Getreidequellflüssigkeit oder andere Substanzen verwendet werden.The culture media consist of a source of carbon and nitrogen and inorganic salts. Starch, dextrin, sucrose, Glucose, maltose, glycerine, vegetable oils, cereal or legume flour, soaked cereal liquor or other substances are used.
Als Stickstoffquelle kommen außer einigen der oben erwähnten Substanzen, die Stickstoff enthalten, auch Kasein, Ammoniaksalze, Peptone, Fleisch- und Fischmehl oder andere gewöhnlich angewandte Substanzen in Frage. Als anorganische Salze können Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Magnesiumsulfat, Natriumphosphate, Kaliumphosphate, Magnesiumphosphate und Calciumcarbonat zugesetzt werden. Es empfiehlt sich dabei oberflächenaktive Mittel, Dispergiermittel oder Aufschlämmungsmittel, wie sie z. B. unter den Handelsnamen Tween 80 und Span bekannt sind, zuzusetzen.In addition to some of the substances mentioned above, the nitrogen source that contain nitrogen, including casein, ammonia salts, peptones, meat and fish meal or other commonly used substances. As inorganic salts can Sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, sodium sulfate, potassium sulfate, magnesium sulfate, Sodium phosphates, potassium phosphates, magnesium phosphates and calcium carbonate are added will. It is recommended here surface-active agents, dispersants or Slurrying agents such as those used e.g. B. known under the trade names Tween 80 and Span are to be added.
Der Mikroorganismus wird in Tauchkultur und unter aeroben Bedingungen in geschüttelten Kolben oder in Gärbottichen bei einer Temperatur zwischen 24 und 30° C, vorzugsweise bei 28° C gezüchtet.The microorganism is grown in immersion culture and under aerobic conditions in shaken flasks or in fermentation vats at a temperature between 24 and 30 ° C, preferably grown at 28 ° C.
Der pH-Wert muß zwischen 6 und 7,5, vorzugsweise bei 6,8 liegen. Während der Fermentation bleibt der pH-Wert praktisch beständig.The pH must be between 6 and 7.5, preferably 6.8. While The pH value remains practically stable during fermentation.
Die Umwandlung des 16-Desoxysteroids in das entsprechende 16x-Hydroxyderivat wird während der Fermentation mittels Chromatographie auf dünnen Schichten verfolgt. Die Chromatographiemethode auf dünnen Schichten ist in der Literatur von Egon S t a h 1(Pharm. Weekblad, 92, 1957, S. 819; Chemiker-Zeitung, 82, 1958, S. 325) und von N. J. D. V a n D a m und Mitarbeitern (J. Chromatographie, 4, 1960, S. 26) beschrieben worden.The conversion of the 16-deoxy steroid into the corresponding 16x-hydroxy derivative is followed during the fermentation by means of chromatography on thin layers. The chromatography method on thin layers is described in the literature by Egon S tah 1 (Pharm. Weekblad, 92, 1957, p. 819; Chemiker-Zeitung, 82, 1958, p. 325) and by NJD V an D am and co-workers (J. . Chromatographie, 4, 1960, p. 26).
Die Chromatographie auf dünnen Schichten bewährt sich auch bei einer quantitativen Bestimmung, wobei die Intensität der Flecken mit jener von bekannter Konzentration verglichen wird.The chromatography on thin layers has also proven itself with a quantitative determination, the intensity of the spots being compared with that of known Concentration is compared.
Das entstandene Steroid (Umwandlungsprodukt) und eventuell ein Teil des Ausgangsproduktes werden nach bekannten Extraktionsverfahren aus der Brühe isoliert, aber vorzugsweise geht man folgendermaßen vor: Die Fermentationsbrühe wird mit Kieselerde, wie Supercel und Celite (Handelsnamen), vermischt, die resultierende Masse wird einige Minuten auf 50 bis 60° C erwärmt und danach abfiltriert. Der Filtrationskuchen wird nach gründlicher Waschung bei 50° C verworfen.The resulting steroid (conversion product) and possibly a part of the starting product are isolated from the broth using known extraction processes, but it is preferable to proceed as follows: The fermentation broth is mixed with silica, such as Supercel and Celite (trade names), mixed, the resulting mass becomes heated for a few minutes to 50 to 60 ° C and then filtered off. The filtration cake is discarded after thorough washing at 50 ° C.
Das Filtrat wird mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, Chloroform oder Methylenchlorid, extrahiert, die Extrakte werden vereinigt und mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung schließlich mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen. Das Lösungsmittel wird dann verdampft, und das Umwandlungsprodukt wird gemäß den üblichen Methoden abgetrennt; oft kristallisiert das Umwand lungsprodukt während des Eindampfens aus. Gewöhnlich wird es aus Petroläther oder aus anderen Lösungsmitteln umkristallisiert; in anderen Fällen kann die Säulenchromatographie an Silicagel angewendet werden, um das Endprodukt in reiner Form zu gewinnen.The filtrate is washed with an organic solvent, such as ethyl acetate, Chloroform or methylene chloride, extracted, the extracts are combined and washed with a saturated sodium bicarbonate solution finally with water until neutral Reaction washed. The solvent is then evaporated, and so is the conversion product is separated according to the usual methods; the conversion product often crystallizes during evaporation. Usually it is made from petroleum ether or from others Recrystallized solvents; in other cases column chromatography can be used can be applied to silica gel in order to obtain the final product in pure form.
Anstatt daß man die erfindungsgemäß herstellbaren Rohprodukte dem obenerwähnten Reinigungsverfahren unterwirft, können sie im Rahmen der Weiterverarbeitung in 4,16- bzw. in 16-Stellung mit dem Anhydrid und Chlorid einer organischen aliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Säure mit nicht mehr als 9 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls in Anwesenheit tertiärer Amine, wie Pyridin und seinen Analogen, Dimethylanilin oder Trimethylamin, acyliert und danach getrennt und gereinigt werden.Instead of the raw products which can be prepared according to the invention Subject to the above-mentioned cleaning processes, they can be used in the course of further processing in 4,16- or in 16-position with the anhydride and chloride of an organic aliphatic, cycloaliphatic or aromatic acid with no more than 9 carbon atoms and optionally in the presence of tertiary amines, such as pyridine and its analogues, Dimethylaniline or trimethylamine, acylated and then separated and purified.
Besondere Beispiele der Acylderivate sind die Derivate der folgenden Säuren: Essig-, Propion-, Cyclopentylpropion-, Benzoe- und Phenylpropionsäure.Specific examples of the acyl derivatives are the derivatives of the following Acids: acetic, propionic, cyclopentylpropionic, benzoic and phenylpropionic acids.
Außerdem wurde gefunden, daß durch die Einführung einer Hydroxygruppe in die 16x-Stellung einiger 17x-Methyl-androstestenole der normalen und 19-Nor-Reihe mittels des obenerwähnten Gärungsverfahrens mit Nocardia italica n. sp. die androgene Wirkung des 16-Desoxy-Ausgangssteroids derartig verringert wird, daß sie als unbedeutend angesehen werden kann, während das erhaltene 16x-Hydroxysteroid eine bemerkenswerte Hemmungswirkung auf Impftumore auslöst.It has also been found that by introducing a hydroxy group in the 16x position of some 17x-methyl-androstestenols of the normal and 19-nor series by means of the above-mentioned fermentation process with Nocardia italica n. sp. the androgenic Effect of the 16-deoxy parent steroid is reduced to such an extent that it is considered insignificant can be viewed, while the obtained 16x-hydroxysteroid is a remarkable one Inhibitory effect on vaccine tumors triggers.
Das Tumorproblem ist von großer Bedeutung, das immer mehr die Aufmerksamkeit der Chirurgen, Ärzte und Biologen auf sich zieht, und, um es zu lösen, sind viele Forschungen ausgeführt worden, wobei insbesondere verschiedene Substanzen untersucht wurden, die fähig sind die neoplastischen Zellen zu zerstören oder deren Vermehrung zu hemmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind jedoch bis heute nicht befriedigend oder haben nur eine vorübergehende Besserung bewirkt.The tumor problem is of great concern, which is getting more and more attention that attracts surgeons, doctors and biologists, and there are many to solve it Researches have been carried out, particularly examining various substances capable of destroying or multiplying neoplastic cells to inhibit. However, the results obtained are still unsatisfactory or unsatisfactory only caused temporary improvement.
Es ist bereits gut bekannt, daß die androgenen Steroide eine Rückbildung von Mammacarzinomen bewirken; nichtsdestoweniger erzeugt die Androgenwirkung unerwünschte Nebeneffekte.It is already well known that androgenic steroids cause regression cause of breast cancer; nonetheless, the androgen effect creates undesirable effects Side effects.
Bei den folgenden neuen Substanzen konnte eine Tumorhemmwirkung festgestellt werden: 4,16x-Dihydroxy-17x-methyl-testosteron 4,16-Dihydroxy-17xmethyl-19-nor-testosteron und deren 4,16-Diacylderivate, sowie 16x-Hydroxy-17x-methyl-19-nor-testosteron und dessen 16-Acylderivat. Das 16-Desoxy-Ausgangssteroid zur Herstellung des 4,16x-Dihydroxy-17x-methyl-testosterons ist 4-Hydroxy-17x-methyltestosteron (beschrieben in der britischen Patentschrift 848 288) während das 16-Desoxy-Ausgangssteroid zur Herstellung des 4,16x-Dihydroxy-17x-methyl-19-nortestosterons 4-Hydroxy-17-,-methyl-19-nor-testosteron ist (beschrieben in der britischen Patentschrift 888665); das 16-Desoxysteroid zur Herstellungdes 16 z-Hydroxy-17x-methyl-19-nor-testosterons ist 17x-Methyl-19-nortestosteron.The following new substances were found to have anti-tumor effects are: 4,16x-dihydroxy-17x-methyl-testosterone 4,16-dihydroxy-17xmethyl-19-nor-testosterone and their 4,16-diacyl derivatives, as well as 16x-hydroxy-17x-methyl-19-nor-testosterone and its 16-acyl derivative. The 16-deoxy starting steroid for the production of 4,16x-dihydroxy-17x-methyl-testosterone is 4-hydroxy-17x-methyltestosterone (described in British patent specification 848 288) while the 16-deoxy parent steroid for the production of 4,16x-dihydroxy-17x-methyl-19-nortestosterone 4-Hydroxy-17 -, - methyl-19-nor-testosterone is (described in British Patent Specification 888665); the 16-deoxysteroid for Production of 16 z-hydroxy-17x-methyl-19-nor-testosterone is 17x-methyl-19-nortestosterone.
Unter den obenerwähnten Verbindungen ist 16:x-Hydroxy-17x-methyl-19-nor-testosteron das einzige in der Literatur bekannte Produkt ( S e y m o u r und E. W. C a n t r a I 1 , J. Org. Chem., 26, 1961, S. 3560). Die besagten Autoren haben ihm lediglich eine schwache androgene Wirkung zugeschrieben, aber keine krebshemmende Wirkung nachgewiesen.Among the compounds mentioned above is 16: x-hydroxy-17x-methyl-19-nor-testosterone the only product known in the literature (S e y m o u r and E. W. C a n t r a I 1, J. Org. Chem., 26, 1961, p. 3560). Said authors only have him ascribed a weak androgenic effect, but no anti-cancer effect proven.
Die erwähnten Produkte haben eine krebshemmende Wirkung und haben sich besonders wertvoll zur Hemmung des Ehrlich-Adenocarcinoms und des Ehrlich-Ascitestumors erwiesen.The products mentioned have an anti-cancer effect and is particularly valuable for inhibiting Ehrlich's adenocarcinoma and Ehrlich's ascites tumor proven.
Durch Verabreichung der besagten Produkte an mit Ehrlich-Adenocarcinom und Ehrlich-Ascitestumor beimpfte Mäuse wird die Zurückbildung der Impftumore bei den Versuchstieren ohne unerwünschte Nebeneffekte erreicht.By administering said products to those with Ehrlich's adenocarcinoma and Ehrlich's ascites tumor inoculated mice will aid in regression of the inoculated tumors reached the test animals without undesirable side effects.
Sie werden vorzugsweise auf subkutanem Weg als Suspension oder Lösung in einem geeigneten organischen Verdünnungsmittel, wie Polyäthylenglykolen, Mineralölen, hochmolekularen Estern und oberflächenaktiven Mitteln, dargereicht.They are preferably administered subcutaneously as a suspension or solution in a suitable organic diluent such as polyethylene glycols, mineral oils, high molecular weight esters and surfactants.
Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Beispiel 1 Mit einer 5 Tage alten Zucht von N.italica auf Glukose-Kartoffel-Agar werden zwei 300-ml-Erlenmeyerkolben beimpft, die je 60 ml des folgenden Nährmediums enthalten: Kasein........................... 2 g Dextrin .......................... 20 g Getreideweiche. . . . . . . . . . . . . . . . .. . . 3 g CaC03 .......................... 4 g (NH4)2S04 . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 1 g K,HP04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Glukose.......................... log Leitungswasser ................... 1000 ml pH 6,6; Sterilisation: 20 Minuten bei 120°C.The following examples explain the process according to the invention. Example 1 With a 5-day-old cultivation of N.italica on glucose-potato-agar, two 300 ml Erlenmeyer flasks are inoculated, each containing 60 ml of the following nutrient medium: Casein ............. .............. 2 g dextrin .......................... 20 g cereal softener. . . . . . . . . . . . . . . . ... . 3 g CaC03 .......................... 4 g (NH4) 2S04. . . . . . . . . ... . . . . . . . . . . . 1 g K, HP04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.1 g glucose .......................... log tap water ................. .. 1000 ml pH 6.6; Sterilization: 20 minutes at 120 ° C.
Man bebrütet sie 40 Stunden bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit 220 U/min und einer Exzentrizität von 6 cm. Die Kulturbrühen dienen zur Beimpfung von zehn 300-ml-Kolben mit je 60 ml eines Mediums ; folgender Zusammensetzung: Kasein........................... 2 g Dextrin .......................... 20 g Getreideweiche. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g CaCO3 .......................... 4 g (NH,)2S0. ....................... 1 g KZHPO4 ......................... 0,1 g Glukose.......................... log Tween 80 (Handelsname) . . . . . . . . . . . 0,5 ml Sojaöl ........................... 20 ml Leitungswasser ................... 1000 ml p,H 6.6; Sterilisation: 30 Minuten bei 120°C.They are incubated for 40 hours at 28 ° C. on a shaker at 220 rpm and an eccentricity of 6 cm. The culture broths are used to inoculate ten 300 ml flasks with 60 ml of a medium each; the following composition: casein ........................... 2 g dextrin ................ .......... 20 g grain softener. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 g CaCO3 .......................... 4 g (NH,) 2S0. ....................... 1 g KZHPO4 ........................ 0.1 g glucose .......................... log Tween 80 (trade name). . . . . . . . . . . 0.5 ml soybean oil ........................... 20 ml tap water ............... .... 1000 ml p, H 6.6; Sterilization: 30 minutes at 120 ° C.
Jeder Kolben wird mit 6 ml der obengenannten Kultur angeimpft, worauf 60 mg 9x-Fluor-hydrocortison in 0,5 ml Dimethylformamid zugefügt werden. Jeder Kolben wird mit 6 ml der obengenannten Kultur angeimpft, worauf 60 mg 9x-Fluor-hydrocortison in 0,5 ml Dimethvlformamid zugefügt werden.Each flask is inoculated with 6 ml of the above culture, whereupon 60 mg of 9x-fluoro-hydrocortisone in 0.5 ml of dimethylformamide are added. Every piston is inoculated with 6 ml of the above culture, whereupon 60 mg of 9x-fluoro-hydrocortisone in 0.5 ml of dimethylformamide are added.
Durch chromatographische Prüfung, die nach 3 Bebrütungstagen ausgeführt wird, konnte das Verschwinden des Ausgangsproduktes und die Bildung eines Produktes nachgewiesen werden, dessen Rf-Wert gleich demjenigen des 16x-Hydroxy-9%-fluor-hydrocortisons ist.By chromatographic testing carried out after 3 days of incubation could lead to the disappearance of the original product and the formation of a product whose Rf value is equal to that of 16x-hydroxy-9% fluorohydrocortisone is.
Die Kolbeninhalte werden vereinigt, 100 g Celite (Handelsname) hinzugefügt, und unter Rühren wird die Gesamtmasse 10 Minuten auf 60°C erwärmt und daraufhin filtriert. Der Filterkuchen wird mit 100m1 Wasser bei 60°C gewaschen.The flask contents are combined, 100 g of Celite (trade name) are added, and while stirring, the total mass is heated to 60 ° C. for 10 minutes and then filtered. The filter cake is washed with 100 ml of water at 60 ° C.
Das Filtrat wird dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte werden mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung und danach mit Wasser bis zur neutralen Reaktion gewaschen.The filtrate is extracted three times with ethyl acetate. The United Ethyl acetate extracts are mixed with saturated sodium bicarbonate solution and then with Washed water until neutral.
Der Extrakt wird auf etwa 30 ml im Vakuum eingeengt, wonach 0,460 g 16,-Hydroxy-9x-fluor-hydroeortison ausfallen, das bei 240 bis 245°C schmilzt; [x] ö = r100° (c = 1 in Methanol). Bei Umkristallisieren aus Methanol-Äthylecetat erhält man 0,400 g 16n-Hydroxy-9x-fluor-hydrocortison, das bei 248 bis 250°C schmilzt; [,]ö = r105' (c --- 1 in Methanol). Ausbeute 800/,. Beispiel 2 Die Fermentierung wird ebenso durchgeführt wie im Beispiel 1, wobei aber ein Medium folgender Zusammensetzung angewandt wird: Lösliche Destillationsrückstände..... log Fleischextrakt..................... 5 g NaCl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,5 g Glukose.......................... 15 g Tween 80 (Handelsname) . . . . . . . . . . 0,5 ml Leitungswasser ................... 1000 ml pH 6,7; Sterilisation: 20 Minuten bei 120`C. Durch chromatographische Prüfung wird das Verschwinden des Ausgangsproduktes nach 4 Bebrütungstagen nachgewiesen, wobei ein Produkt entsteht, dessen Rf-Wert demjenigen des 16x-Hydroxy-9x-fluorhydrocortisons gleich ist.The extract is concentrated to about 30 ml in vacuo, after which 0.460 g of 16-hydroxy-9x-fluoro-hydroeortisone precipitate, which melts at 240 to 245 ° C; [x] ö = r100 ° (c = 1 in methanol). Recrystallization from methanol-ethyl acetate gives 0.400 g of 16n-hydroxy-9x-fluoro-hydrocortisone, which melts at 248 to 250 ° C .; [,] ö = r105 '(c --- 1 in methanol). Yield 800 / ,. Example 2 The fermentation is carried out in the same way as in Example 1, but using a medium of the following composition: Soluble distillation residues ..... log meat extract .................... 5 g NaCl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 g glucose .......................... 15 g Tween 80 (trade name). . . . . . . . . . 0.5 ml tap water ................... 1000 ml pH 6.7; Sterilization: 20 minutes at 120`C. The disappearance of the starting product after 4 days of incubation is proven by chromatographic testing, whereby a product is formed whose Rf value is the same as that of 16x-hydroxy-9x-fluorohydrocortisone.
Durch Extraktion mit Äthylacetat und darauffolgende Konzentration erhält man 16 x-Hydroxy-9x-fluor-hydrocortison mit 75"/"iger Ausbeute. Beispiel 3 31 des im Beispiel 1 beschriebenen Nährmediums werden 60 Minuten bei 120°C in einem 5-1-Laborfermenter sterilisiert. Danach werden sie mit 30 ml einer Kulturbrühe in Kolben, wie im Beispiel 1 beschrieben wurde, beimpft und 24 Stunden bei 28°C durch Rühren mit einem Vierflügelrührer mit 400 UpM und einer Luftzufuhr von 3 1/min bebrütet.By extraction with ethyl acetate and subsequent concentration 16 x-hydroxy-9x-fluoro-hydrocortisone is obtained with a 75 "/" yield. example 3 31 of the nutrient medium described in Example 1 are 60 minutes at 120 ° C in sterilized in a 5-1 laboratory fermenter. Then they are mixed with 30 ml of a culture broth in flasks as described in Example 1 and inoculated at 28 ° C for 24 hours by stirring with a four-blade stirrer at 400 rpm and an air supply of 3 1 / min incubated.
5,41 des Nährmediums, gleich dem im Beispiel 1, werden in einem 101 fassenden Laborfermenter sterilisiert und mit 600 ml Kulturbrühe beimpft. Dann werden 6 g 9_x-Fluor-hydrocortison in 35 ml Dimethylformamid gelöst, unter sterilen Bedingungen dem Nährmedium zugefügt und bei 28°C durch Rühren mit einem Vierflügelrührer mit 450 UpM und einem Luftdurchfluß von 5 1/min bebrütet.5.41 of the nutrient medium, identical to that in Example 1, are placed in a 101 sterilized laboratory fermenter and inoculated with 600 ml of culture broth. Then will 6 g of 9_x-fluoro-hydrocortisone dissolved in 35 ml of dimethylformamide, under sterile conditions added to the nutrient medium and at 28 ° C by stirring with a four-blade stirrer 450 rpm and an air flow rate of 5 1 / min.
Die Chromatographieanalyse zeigt das Verschwinden der Ausgangsverbindung nach 65stündiger Bebrütung. Durch Extraktion mit Äthylacetat und darauffolgende Konzentration kann 16oc-Hydroxy-9a-fluorhydrocortison mit 80°/oiger Ausbeute abgetrennt werden.The chromatographic analysis shows the disappearance of the starting compound after 65 hours of incubation. By extraction with ethyl acetate and subsequent concentration can be 16oc-hydroxy-9a-fluorohydrocortisone with 80% Yield can be separated.
Beispie14 Die Fermentierung wird, wie im Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt, wobei aber 9a-Fluor-prednisolon als Ausgangssteroid verwendet wird; sobald der chromatographische Text ergibt, daß 9a-Fluor-prednisolon vollständig umgewandelt ist, extrahiert man das Fermentationsprodukt gemäß dem Verfahren des Beispiels 1. Man erhält 16a-Hydroxy-9a-fluor-prednisolon, das bei 248 bis 250°C schmilzt.Example 14 The fermentation is carried out as described in Example 1, but 9a-fluoro-prednisolone is used as the starting steroid; as soon as the chromatographic Text shows that 9a-fluoro-prednisolone is completely converted, one extracts the fermentation product according to the method of Example 1. 16a-Hydroxy-9a-fluoro-prednisolone is obtained, which melts at 248 to 250 ° C.
Durch Umkristallisieren aus Methanol-Äthylacetat erhält man das reine Produkt, das bei 260 bis 262°C schmilzt; [a]ö = -f-68° (c= 1 in Methanol) Beispiel s Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei aber Hydrocortison als Ausgangssteroid verwendet wird. Auf diese Weise erhält man 16a-Hydroxy-hydrocortison, das bei 225 bis 230°C schmilzt; [a] ö = -f-112° (c = 1 in Methanol).The pure is obtained by recrystallization from methanol-ethyl acetate Product that melts at 260-262 ° C; [a] ö = -f-68 ° (c = 1 in methanol) example s The fermentation takes place as in Example 1, but with hydrocortisone as the starting steroid is used. In this way 16a-hydroxy-hydrocortisone is obtained, which at 225 melts up to 230 ° C; [a] δ = -f -112 ° (c = 1 in methanol).
Durch Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man 16a-Hydroxy-hydrocortison, das bei 232 bis 235°C schmilzt. Beispiel 6 Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei aber als Ausgangssteroid Progesteron verwendet wird.Recrystallization from ethyl acetate gives 16a-hydroxy-hydrocortisone, which melts at 232 to 235 ° C. Example 6 The fermentation takes place as in the example 1, although progesterone is used as the starting steroid.
Durch Umkristallisieren aus Äthylacetat erhält man 16a-Hydroxy-progesteron, das bei 212 bis 214'C schmilzt; [a]'£) = -I-48° (c = 1 in Chloroform). Beispiel ? Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei aber als Ausgangssteroid Testosteron verwendet wird.Recrystallization from ethyl acetate gives 16a-hydroxy-progesterone, which melts at 212 to 214 ° C; [a] '£) = -I-48 ° (c = 1 in chloroform). example ? The fermentation takes place as in Example 1, but with testosterone as the starting steroid is used.
Die organischen Auszüge werden an Silicagel chromatographiert und mit Äther-Aceton eluiert; man erhält 16a-Hydroxy-testosteron, Fp. 182 bis 184°C; [a]ö = -I-75° (c = 1 in Methanol). Beispiel 8 Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei als Ausgangssteroid Reichsteins Verbindung S verwendet wird.The organic extracts are chromatographed on silica gel and eluted with ether-acetone; 16α-hydroxy-testosterone is obtained, melting point 182 to 184 ° C .; [a] δ = -I-75 ° (c = 1 in methanol). Example 8 The fermentation takes place as in the example 1, where Reichstein's compound S is used as the starting steroid.
Nach Extraktion mit Äthylacetat, Eindampfen zur Trockene und Kristallisieren aus Aceton-Äther erhält man 4-Pregnen-16a,17x,21-triol-3,20-dion, das bei 235 bis 240'C schmilzt; [x]'£) = +93' (c = 1 in Methanol). Beispiel 9 Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei als Ausgangssteroid Desoxycorticosteron verwendet wird.After extraction with ethyl acetate, evaporation to dryness and crystallization from acetone-ether, 4-pregnene-16a, 17x, 21-triol-3,20-dione, which melts at 235 to 240 ° C., is obtained; [x] '£) = +93' (c = 1 in methanol). Example 9 The fermentation is carried out as in Example 1, with deoxycorticosterone being used as the starting steroid.
Bei Konzentrieren der Äthylacetatauszüge fällt 16a-Hydroxy-desoxycorticosteron aus, das bei 180 bis 190°C schmilzt. Durch Umkristallisieren aus Dichloräthan erhält man reines 16a-Hydroxy-desoxycorticosteron, das bei 202 bis 204°C schmilzt; [x1 '0 = -I-112° (c = 1 in Methanol).When the ethyl acetate extracts are concentrated, 16a-hydroxy-deoxycorticosterone precipitates, which melts at 180 to 190 ° C. Recrystallization from dichloroethane gives pure 16a-hydroxy-deoxycorticosterone which melts at 202 to 204 ° C .; [x1 '0 = -I-112 ° (c = 1 in methanol).
Beispiel 10 Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei als Ausgangssteroid Desoxycorticosteronacetat verwendet wird. Nach Extraktion mit Äthylacetat und Umkristallisieren aus Dichloräthan erhält man 16a-Hydroxydesoxycorticosteron, das bei 202 bis 204°C schmilzt; in diesem Fall bewirkt Nocardia italica die Einführung der Hydroxygruppe in die 16-Stellung und gleichzeitige Verseifung des 21-ständigen Acetylrestes.Example 10 The fermentation is carried out as in Example 1, with deoxycorticosterone acetate being used as the starting steroid. Extraction with ethyl acetate and recrystallization from dichloroethane gives 16a-hydroxydesoxycorticosterone which melts at 202 to 204 ° C .; in this case Nocardia italica brings about the introduction of the hydroxyl group in the 16-position and simultaneous saponification of the 21-position acetyl radical.
Beispiel 11 16x-Hydroxy-17a-methyl-19-nor-testosteron Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 1, wobei als Ausgangssteroid 17a-Methyl-19-nor-testosteron verwendet wird.Example 11 16x-Hydroxy-17a-methyl-19-nor-testosterone The fermentation takes place as in Example 1, 17a-methyl-19-nor-testosterone being used as the starting steroid.
Nach Extrahieren mit Äthylacetat, Eindampfen zur Trockene und Umkristallisieren aus Aceton-Äthyläther erhält man 16a-Hydroxy-17a-methyl-19-nortestosteron, das bei 205 bis 208'C schmilzt; [ca] ö = -7' (c = 1 in Dioxan); AMLella°°' bei 241 mp.; Eil = 524.Extraction with ethyl acetate, evaporation to dryness and recrystallization from acetone-ethyl ether gives 16a-hydroxy-17a-methyl-19-nortestosterone, which melts at 205 to 208 ° C; [ca] δ = -7 ' (c = 1 in dioxane); AMLella °° 'at 241 mp .; Express = 524.
Beispiel 12 16x-Hydroxy-17a-methyl-19-nor-testosteron Die Fermentierung erfolgt wie im Beispiel 11, wobei nur die Extraktionstechnik verschieden ist: Die Extraktion der Fermentierungsbrühe wird ohne vorhergehende Mycelabtrennung mit Methyl-isobutylketon durchgeführt, und daraufhin wird der trockene Rückstand an Florisil (eingetragene Schutzmarke) chromatographiert, wobei 16a-Hydroxy-17a-methyl-19-nor-testosteron mit Aceton-Athyläther-Gemisch (1 : 9) eluiert wird.Example 12 16x-Hydroxy-17a-methyl-19-nor-testosterone The fermentation takes place as in Example 11, only the extraction technique is different: The Extraction of the fermentation broth is carried out without prior separation of the mycelium with methyl isobutyl ketone carried out, and then the dry residue on Florisil (registered Trademark), whereby 16a-hydroxy-17a-methyl-19-nor-testosterone is eluted with acetone-ethyl ether mixture (1: 9).
Das 16oc-Acetylderivat, das in bekannter Weise mit Essigsäureanhydrid
in Pyridin hergestellt wurde,
Durch Umsetzung mit Essigsäureanhydrid in Pyridin in bekannter Weise
erhält man das entsprechende
Die androgene Wirksamkeit ist gemäß H e r s hb e r g e r und Mitarbeiter festgestellt worden (Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 83, 1953, S. l75), und die krebshemmende Wirksamkeit ist an Ehrlich-Adenocarcinom geprüft worden.The androgenic effectiveness is according to H e r s hb e r g e r and employees been established (Proc. Soc. Exp. Biol. And Med., 83, 1953, pp. 175), and its anti-cancer activity has been tested on Ehrlich's adenocarcinoma.
Die Werte der androgenen Wirksamkeit sind im Vergleich zu Testosteronpropionat angegeben, dessen Wert konventionell gleich 100 festgesetzt wurde, während die Werte der krebshemmenden Wirksamkeit als Hemmungsprozentsatz des Wachstums des Ehrlich-Adenocarcinoms angeführt sind.The values of androgenic effectiveness are compared to testosterone propionate , the value of which has conventionally been set equal to 100, while the values the anti-cancer efficacy as a percentage of the growth inhibition of Ehrlich's adenocarcinoma are listed.
Die Produkte wurden auf subkutanem Weg verabreicht. Die Tabelle zeigt,
daß die 16a-Hydroxysteroide eine sehr geringe androgene, aber eine stärkere krebshemmende
Wirksamkeit als die 16-Desoxy-Ausgangssteroide aufweisen.
Claims (2)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT1173090X | 1961-07-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1173090B true DE1173090B (en) | 1964-07-02 |
Family
ID=11432520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DES80368A Pending DE1173090B (en) | 1961-07-17 | 1962-07-12 | Process for the preparation of 16ª ‡ -hydroxysteroids |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE1173090B (en) |
-
1962
- 1962-07-12 DE DES80368A patent/DE1173090B/en active Pending
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