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DE102009006606A1 - Nicht-virales Transfektionsmittel - Google Patents

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DE102009006606A1
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polymer
nucleic acid
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viral transfection
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DE102009006606A
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English (en)
Inventor
Achim Prof. Dr. Aigner
Roland Dr. Dersch
Sabrina HÖBEL
Markus Rudisile
Joachim H. Prof. Dr. Wendorff
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Philipps Universitaet Marburg
Original Assignee
Philipps Universitaet Marburg
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Priority to PCT/EP2010/051081 priority patent/WO2010086406A1/de
Priority to US13/145,756 priority patent/US20120083037A1/en
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Abstract

Nicht-virales Transfektionsmittel, bestehend aus Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern, wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer bestehen. Die Nanofasern trägern die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, wobei das nicht-virale Transfektionsmittel zweckmäßig durch Elektrospinning hergestellt ist. Das kationische Polymer ist günstigerweise ein Polyimin bzw. Polyethylenimin und kann mit einem oder mehreren daran gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert sein. Zweckmäßig kann es auch sein, das kationische Polymer mit einem oder mehreren Kohlenhydraten und/oder mit einem rezeptorspezifischen Liganden zu koppeln. Die Nukleinsäure ist eine DNA oder eine RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat, vorteilhaft eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure. Die Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren, bioverträglichen Polymeren. Sie bzw. das gesamte Transfektionsmittel können mit einem Polymerüberzug versehen sein. Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen Transfektionsmittels umfasst die folgenden Schritte: Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes, Herstellung einer Spinnlösung, enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, Elektrospinnen.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein nicht-virales Transfektionsmittel gemäß Anspruch 1, ein Verfahren zu dessen Herstellung gemäß Anspruch 17, die Verwendung gemäß den Ansprüchen 20 und 21, sowie ein Arzneimittel enthaltend ein nicht-virales Transfektionsmittel und dessen Verwendung gemäß den Ansprüchen 22 und 23.
  • Transfektionsmittel sind allgemein bekannt und insbesondere im Hinblick auf die Anwendung von Nukleinsäuremolekülen im Bereich der Gentherapie von zunehmender Bedeutung. Ihre Aufgabe ist es, Nukleinsäuremoleküle, die auf DNA basieren (bspw. Expressionsplasmide), – immer häufiger aber auch kurzkettige Nukleinsäuremoleküle auf RNA-Basis (bspw. siRNAs) – in die zu therapierenden Zellen einer Kultur oder eines Zielgewebes zu transportieren.
  • Zur stabilen aber auch zur transienten Transfektion von eukaryotischen Zellen mit DNA-Plasmiden werden üblicherweise physikalische bzw. chemische Methoden oder Virus-basierte Systeme eingesetzt, bspw. modifizierte Adeno- oder Retroviren. Während die meisten physikalischen oder chemischen Methoden – insbesondere bei Säugerzellen – häufig wenig effektiv und auf den gesamten Organismus nur schwer anwendbar sind, weisen die Virus-basierten Systeme normalerweise eine recht hohe Effizienz auf. Allerdings haben auch diese entscheidende Nachteile. So sind sie einerseits sehr aufwändig in der Präparation und hoch sensibel in der Handhabung. Andererseits bergen sie nicht unerhebliche Risiken, insbesondere im Hinblick auf drohende Abwehrreaktionen des Immunsystems oder onkogene Erkrankungen.
  • Man hat daher versucht, nicht-virale Transfektionsmittel zu entwickeln. So beschreibt die WO 96/02655 A1 beispielsweise Polykation/DNA-Komplexe für den in-vivo Transfer von DNA. Diese zeigen jedoch im Vergleich zu viralen Transfektionsmitteln eine drastisch reduzierte Transfektionseffizienz. Dies ist meist verbunden mit unspezifischen Interaktionen der Polykation/DNA-Komplexe – beispielsweise mit Blutkomponenten – und Aggregatbildungen.
  • Vor allem um letzteres zu verhindern hat man in der WO 98/59064 A1 die Polykation/DNA-Komplexe weiterentwickelt, indem man die kationischen Polymere – speziell Polyethylenimin (PEI) – modifiziert hat. Ziel dieser Entwicklung war es eine Abschirmung der kationischen Polymeroberfläche zu erreichen und mithin die Aggregatbildung zu erschweren.
  • Es zeigte sich jedoch, dass zur Herstellung dieser Komplexe relativ hohe Molekulargewicht des modifizierten PEI benötigt werden was in der Folge zu sterisch kleinen Polymer/Nukleinsäure-Komplexen führt. Unglücklicherweise scheint allerdings die Transfektionseffizienz umso geringer zu sein, je kleiner die Komplexe sind. Mithin ist also der Einsatz einer höheren Konzentration der Komplexe notwendig, was wiederum die Aggregatbildung begünstigt.
  • Problematisch ist außerdem die Lagerung der Komplexe. Zwar können die Komplexe für einen begrenzten Zeitraum in der Lösung gelagert werden. Dabei besteht jedoch erneut das Risiko der Aggregation und damit verbunden ein enormer Verlust der Transfektionseffizienz. Daneben ist in wenigen Fällen die Lagerung in lyophilisierter oder tiefgefrorener Form möglich. Dies ist jedoch mit weiterem nicht unerheblichem Präparationsaufwand verbunden. Darüber hinaus ist dabei nicht unbedingt sichergestellt, dass das Präparat beim erneuten Auflösen oder Auftauen eine vergleichbare Bio-Aktivität wie das frisch hergestellte Präparat aufweist.
  • Im Zuge der aufkommenden und vielversprechenden Möglichkeiten im Bereich der Gentherapie ist es seit einiger Zeit außerdem von hohem Interesse, nicht nur DNA sondern auch therapeutisch wirksame RNA in Säugerzellen einbringen zu können. Diese sind ungleich kritischer in der Handhabung als DNA, virale Systeme sind hier nur begrenzt einsetzbar. So ist es beispielsweise nicht möglich, sie für den Transport von siRNA's zu verwenden. Die WO 01/43777 A1 sieht daher die Komplexierung von RNA, insbesondere von Ribozymen, mit PEI zu Polykation/RNA-Komplexen vor. Auch bei diesen Komplexen besteht unter anderem das bereits genannte Problem der Aggregatbildung. Ein weiteres wesentliches Problem ist, dass diese Komplexe nur sehr schwer bis gar nicht lagerungsfähig sind.
  • Allen diesen Lösungen wohnt darüber hinaus das Problem inne, dass eine loko-regionale und vor allem zeitliche Steuerung der Freisetzung der Nukleinsäuren nur schwer möglich ist. Mithin ist auch die loko-regionale und vor allem zeitliche Steuerung der zellulären Aufnahme von Polymer/Nukleinsäure-Komplexen nur schwer möglich.
  • Daneben sind alle diese Systeme nur in Form von wässrigen oder organischen Lösungen verwendbar. Dies bedingt wiederum – auch im Hinblick auf die drohende Aggregation –, dass die Dosierung der Nukleinsäuren schwierig und ungenau ist. Insbesondere gestatten diese Systeme keine Kombination aus hinreichend effizienter Aufnahme in die Zielzellen des Zielgewebes und gleichzeitiger hinreichend loko-regional und zeitlich steuerbarer Freisetzung der Nukleinsäuren im Zielgewebe.
  • Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein nicht-virales Transfektionsmittel zur Verfügung zu stellen, welches die zuvor genannten Nachteile überwindet. Insbesondere soll es die Protektion der Nukleinsäuren gegen Degradation sowie deren effiziente Einschleusung in Gewebe und Zellen ermöglichen, sowie eine verbesserte loko-regionale und vor allem zeitliche Steuerung der Freisetzung der Nukleinsäuren. Außerdem soll das Transfektionsmittel auf einfachem Wege lagerbar sowie mit möglichst einfachen Mitteln und kostengünstig herstellbar sein.
  • Hauptmerkmale der Erfindung sind in den Ansprüchen 1, 12 und 13 bis 16 angegeben. Ausgestaltungen sind Gegenstand der Ansprüche 2 bis 11.
  • Die Erfindung sieht ein nicht-virales Transfektionsmittel vor, bestehend aus Polymer/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern, wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer bestehen.
  • Darüber hinaus sieht die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen Transfektionsmittels vor, umfassend die Schritte
    • • Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes
    • • Herstellung einer Spinnlösung enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe sowie mindestens ein Trägerpolymer
    • • Elektrospinnen.
  • Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen nicht-viralen Transfektionsmittels ist, dass es Nanofasern enthält, welche die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe trägern. Dadurch wird insbesondere die Aggregation der Komplexe vermieden und das Transfektionsmittel ist ohne Probleme lagerbar. So können beispielsweise die trockenen Nanofasern mit den Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen bei 4°C problemlos über mehrere Wochen gelagert werden, ohne dass es zu einem Verlust der Bio-Aktivität kommt.
  • Ein weiterer Vorteil der Erfindung ist, dass die Komplexe protrahiert aus den Nanofasern freigesetzt werden. Dadurch wird die loko-regionale und zeitliche Steuerung der Aufnahme der Komplexe in die Zielzellen deutlich verbessert.
  • Daneben zeichnet sich das erfindungsgemäße Transfektionsmittel dank der Trägerung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe durch die Nanofasern durch eine sehr einfache Handhabung aus. Günstig ist es dabei, wenn das nicht-virale Transfektionsmittel durch Elektrospinning hergestellt wird. Dabei können die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe gemeinsam mit einem Trägerpolymer versponnen werden. Die dabei entstehenden Nanofasern werden zum Beispiel auf einem Glasplättchen aufgefangen und können beispielsweise mit einer Pinzette als Geflecht abgenommen und weiterverarbeitet werden. So kann das Geflecht in eine Zellkulturschale oder auch direkt in oder auf ein Gewebe – beispielsweise im Bereich eines erkrankten Organes – eingelegt werden. Denkbar ist auch z. B. die Weiterverarbeitung zu oral, anal, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal oder inhalativ verabreichbaren Formulierungen. Besonders vorteilhaft ist dann unter anderem, dass die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe direkt an Ort und Stelle von den Nanofasern abgegeben werden können, was das Risiko der unerwünschten (und schädlichen) Mitbehandlung von nicht betroffenen Organe und Körperpartien im Vergleich zu einer Applikation mit Hilfe einer einfachen Lösung deutlich reduziert.
  • Ein weiterer Vorteil ist es, dass die Konzentration der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe in den Nanofasern durch entsprechendes Zusammenmischen der Spinnlösung gut einstellbar ist. Auf diese Weise ist auch eine sehr exakte Dosierung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe möglich. Dabei ist es insbesondere günstig, dass die Nanofasern, welche die Komplexe trägern, in fester Form vorliegen und mithin beispielsweise leicht wägbar sind. Vorteilhaft ist es auch, dass die Integrität der Komplexe und die Freisetzung der Nukleinsäure aus den Komplexen überraschenderweise durch vorheriges Elektrospinning nicht beeinflusst werden.
  • Zweckmäßig ist es, wenn das kationische Polymer ein Polyimin, bevorzugt Polyethylenimin (PEI) oder Polypropylenimin (PPI), besonders bevorzugt Polyethylenimin (PEI) ist. Dabei kann das Polyethylenimin (PEI) ein lineares oder verzweigtes Polyethylenimin (PEI) und/oder ein modifiziertes Polyethylenimin (PEI) sein.
  • Das kationische Polymer kann insbesondere auch mit einem oder mehreren daran gekoppelten hydrophilen Poylmeren modifiziert sein. Diese sind beispielsweise – aber nicht erschöpfend – ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG), Polyvinylpyrollidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole oder Copolymere davon. Bevorzugt ist das hydrophile Polymer PEG.
  • Denkbar ist auch, dass das kationische Polymer mit einem oder mehreren Kohlenhydraten gekoppelt ist.
  • Um eine zelltypspezifische Delivery und eine verbesserte Aufnahme der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe in die Zellen zu erreichen, ist es vorteilhaft, wenn das kationische Polymer mit einem rezeptorspezifischen Liganden gekoppelt ist, bevorzugt mit Transferrin oder EGF. Diese Liganden binden an Rezeptoren, die spezifisch von den anzusteuernden Zellen exprimiert werden, beispielsweise den EGF-Rezeptor. Vorstellbar sind jedoch auch andere Liganden, die an andere Rezeptoren binden, oder Antikörper, die Oberflächenstrukturen der Zellen erkennen und an diese binden. Insgesamt können die über das kationische Polymer an die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe gekoppelten Liganden – je nach Art des Liganden – dann unterschiedliche Funktionen erfüllen, beispielsweise die Bindung an Zielzell-Strukturen auf der Außenseite der Zellmembran, die Erhöhung der Aufnahmeeffizienz für nanoskalige Partikel in die Zellen und/oder die gesteigerte Freisetzung der Polymer-/Nukleinsäure-Komlpexe aus intrazellulären Organellen.
  • Das jeweilige Optimum für die Größe und Art des Polymers ist dabei abhängig von der zu transportierenden Nukleinsäure. Es ist jedoch insgesamt vorteilhaft, wenn das Molekulargewicht des kationischen Polymers zwischen 0,6 kD und 2 000 kD, bevorzugt zwischen 0,6 kD und 800 kD, besonders bevorzugt zwischen 4 kD und 25 kD liegt. In diesem Bereich werden Komplexe aus Nukleinsäure und Polymer erhalten, die bezüglich Komplexierung der Nukleinsäure, biologischer Aktivität/Transfektionseffizienz und Toxizität optimal sind. Die optimale Komplexierung der Nukleinsäure ist insbesondere wichtig, wenn die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe durch Elektrospinning verarbeitet werden sollen. Da die Komplexierung auf elektrostatischen Wechselwirkungen beruht, muss sie eine gewisse Stabilität aufweisen, um nicht im elektrischen Feld der Spinnapparatur zerstört zu werden oder vorzeitig im wässrigen Medium außerhalb der Zielzellen zu zerfallen. Gleichzeitig darf sie allerdings auch nicht zu stabil sein, da sie ansonsten in den Zielzellen nur schwer wieder gelöst werden könnte. In der Folge könnten die Nukleinsäuren nicht wirksam werden. Daneben beeinflusst die Stärke der Komplexbindung die Größe des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes. Dabei ist der Komplex umso kleiner, je größer das Polymer ist, da dann die DNA kompaktere Strukturen annimmt. Die Größe des Komplexes ist jedoch unter anderem bedeutsam für die Transfektionseffizienz. Bevorzugt haben die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe eine Größe zwischen 20 nm und ca. 800 nm, besonders bevorzugt zwischen 50 nm und 500 nm.
  • Erfindungsgemäß kann bei dem nicht-viralen Transfektionsmittel die Nukleinsäure eine DNA oder eine RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat sein. Günstig ist es dabei, wenn die Nukleinsäure eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure ist.
  • So ist einerseits vorstellbar, dass die Nukleinsäure ein DNA-Plasmid ist. Dieses kann beispielsweise 4.000 bis 10.000 bp umfassen und eine zu exprimierende Gensequenz beinhalten, welche mit Hilfe des Transfektionssystems in Zellkulturen eingebracht werden soll. Vorstellbar sind auch DNA's welche 500 bis 25.000 bp umfassen, beispielsweise kleinere Helfer- oder Markerexprimierende Plasmide oder besonders große Plasmide zur stabilen Einbringung eines bestimmten Gens inklusive Steuerungs- bzw. Exon-/Intron-Strukturen in die Zielzellen, beispielsweise bei der Erzeugung transgener Organismen oder im Rahmen einer Gentherapie.
  • Daneben ist es denkbar, dass auch antisense-DNA oder Decoy-DNA als Nukleinsäuren im Polymer-/Nukleinsäure-Komplex verwendet werden. Diese haben üblicherweise weniger als 500 bp, bevorzugt weniger als 100 bp.
  • Als therapeutisch wirksame Nukleinsäuren kommen außerdem insbesondere (aber bei weitem nicht erschöpfend) siRNA's, längere doppelsträngige RNA-Moleküle, bevorzugt 27–29mere, siLNAs, sisiLNAs und siRNA-Moleküle mit anderen chemischen Modifikationen zur Erhöhung der Stabilität, der Selektivität und/oder der Effizienz in Frage. Auch Ribozyme sind vorstellbar, bevorzugt Hammerhead-Ribozyme, aber auch Ribozyme mit Hairpin-Motiv oder HDV Ribozyme. Weiterhin können messenger RNA's (mRNA) ebenso wie transfer RNA's (tRNA) als Nukleinsäuren in dem Transfektionsmittel enthalten sein und so in die gewünschten Zellen gebracht werden.
  • Die Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren, bioverträglichen Polymeren, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Polylactide, Polyvinylalkohole, Polyethylenglykole, Polycaprlacton, Polyhydroxybutyrate, Polyesterurethane, Cellulose, Celluloseacetat, Chitosan, Alginate, Collagen oder Co-Polymere und Elends davon. Die Zusammensetzung der Polymere bestimmen dabei die Löslichkeitseigenschaften der Nanofasern. Günstig ist es dabei, wenn die Fasern wasserlöslich sind.
  • Die Löslichkeitseigenschaften der Nanofasern sind insbesondere im Hinblick auf eine protrahierte Freisetzung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe von Bedeutung. Je nachdem wie schnell sich die Nanofasern auflösen, werden die Komplexe auch schnell oder langsam abgegeben und damit dosiert. Mithin ist die Freisetzungskinetik der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe über die Wahl der Nanofaser-Polymere steuerbar.
  • Diese Freisetzungskinetik kann zusätzlich beeinflusst werden, wenn das gesamte Transfektionsmittel, also die Nanofasern inklusive der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe mit einem zusätzlichen Überzug aus einem bioabbaubaren Polymer versehen sind, bevorzugt mit einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG), Polyethylenimine (PEI), Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) (PDDA), Polylactide (PLA), Poly-p-xylylen (PPX), Copolymere und Elends davon oder Lipide. Dieser Überzug kann eine Dicke von bspw. 10 nm bis zu vielen Mikrometern haben.
  • Es versteht sich von selbst, dass für die Menge an insgesamt freigesetzten Polymer/Nukleinsäure-Komplexen auch die Größe der Nanofasern eine Rolle spielt. Diese können beispielsweise einen Durchmesser im Bereich von 1 nm bis 100 μm, bevorzugt zwischen 10 nm und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 50 nm und 3 μm haben. Die Länge der Fasern kann je nach Anwendung im Bereich zwischen etwa 2 μm und 100 μm liegen, andere Dimensionen z. B. bis in den Zentimeterbereich und darüber hinaus sind anwendungsabhängig denkbar.
  • Ein besonderer Vorteil des Verfahrens zur Herstellung des erfindungsgemäßen nicht-viralen Transfektionsmittels ist es, dass die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe gemeinsam mit den Trägerpolymeren zu den Nanofasern elektroversponnen werden. Mithin sind lediglich die Bereitstellung der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe und die Bereitstellung einer Spinnlösung zur Vorbereitung notwendig.
  • Die Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes umfasst die Schritte
    • – Herstellung einer Nukleinsäure-Lösung
    • – Inkubation der Nukleinsäure-Lösung
    • – Herstellung einer Polymer-Lösung
    • – Inkubation der Polymer-Lösung
    • – Zugabe der Polymer-Lösung zur Nukleinsäure-Lösung
    • – Vermischen
    • – Inkubation der Mischung
  • Diese Prozedur dauert in der Regel nicht länger als zwei Stunden und ist damit wesentlich weniger aufwändig und kompliziert als die Präparation eines Virus zur Transfektion. Das unten beschriebene Beispiel 1 zeigt ein beispielhaftes Protokoll für die Herstellung von PEI-F25LMW-Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen.
  • Auch die Bereitstellung der Spinnlösung ist nicht besonders aufwändig. Sie umfasst erfindungsgemäß die Schritte:
    • – Bereitstellung einer Lösung enthaltend Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe in einem geeigneten Medium:
    • – Bereitstellung einer Lösung des Trägerpolymers, bevorzugt einer wässrigen Lösung;
    • – Zugabe der Polymer-/Nukleinsäure-Komplex-Lösung zu der Trägerpolymer-Lösung;
    • – Vermischen.
  • Dabei sei angemerkt, dass der erste Schritt, nämlich das Bereitstellen der Lösung enthaltend Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, in der Praxis normalerweise bereits das Ergebnis der Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes sein wird, da auch die Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes zweckmäßig in einem geeigneten Medium, bspw. in 'HEPES-Puffer' (10 mM bis 1 M HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4), erfolgt.
  • Als weiterer Schritt erfolgt das Elektrospinning.
  • Man erkennt insgesamt, dass das nicht-virale Transfektionsmittel nicht nur gut lagerbar, sondern auch mit einfachen Mitteln und im Verhältnis kostengünstig herstellbar ist. Durch die Komplexierung der Nukleinsäuren mit den kationischen Polymeren sind die Nukleinsäuren des Weiteren gegen Degradation geschützt. Die loko-regionale und zeitliche Steuerung der Freisetzung der Nukleinsäuren wird insbesondere durch die Trägerung durch die Nanofasern ermöglicht. Dabei ist außerdem die einfache Handhabung des feststoffartigen Transfektionsmittels von Vorteil.
  • All dies ist in Bezug auf die Verwendung des Transfektionsmittels besonders günstig. So kann das erfindungsgemäße nicht-virale Transfektionsmittel zur Transfektion von eukaryotischen Zellen verwendet werden. Dabei sind sowohl Anwendungen beispielsweise im Zellkulturlabor als auch unmittelbar im Organismus denkbar. Mit Blick auf letzteres kann das nicht-virale Transfektionsmittel zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden.
  • Ein Arzneimittel enthaltend ein erfindungsgemäßes nicht-virales Transfektionsmittel zeichnet sich wiederum vorteilhaft durch die einfache Handhabung und gut steuerbare loko-regionale Delivery von therapeutischen Nukleinsäuren aus. Auch eine protrahierte Freisetzung ist dabei gut und einfach steuerbar.
  • Mithin ist die Verwendung eines solchen Arzneimittels für eine gentherapeutische Behandlung zweckmäßig. Insbesondere, da das erfindungsgemäße nicht-virale Transfektionsmittel eine Vielzahl an Formulierungen und Verabreichungsformen problemlos möglich macht, kann das Arzneimittel ganz gezielt auf die entsprechende individuelle Behandlung abgestimmt werden.
  • Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem Wortlaut der Ansprüche sowie aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Darstellungen. Es zeigen:
  • 1 Transfektionseffizienz eingesponnener Nanoplexe, entsprechend Beispiel 4,
  • 2 Lagerbarkeit eingesponnener Nanoplexe, entsprechend Beispiel 5,
  • 3a Knockdown-Effizienz (PEO-Lösung), entsprechend Beispiel 6a,
  • 3b Knockdown-Effizienz (PEO/Dichlormethan-Lösung), entsprechend Beispiel 6b,
  • 3c Knockdown-Effizienz (PVA-Lösung), entsprechend Beispiel 6c und
  • 3d Knockdown-Effizienz (PEO/Wasser-Lösung), entsprechend Beispiel 6d
  • Beispiel 1 – Herstellung von Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen (PEI-F25LMW)
    • a) Zur Herstellung eines Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes zur frischen Anwendung oder zum Einfrieren sei beispielhaft die bekannte Herstellung von PEI F25-LMW/DNA-Komplexen genannt.
  • Dazu werden 1,3 μg DNA in 80 μl ,HEPES-Puffer' (10 mM bis 1 M HEPES, 150 mM NaCL, pH 7,4) gelöst und für 10 Minuten inkubiert.
  • 22 μl PEI F25-LMW (0,6 μg/μl) werden in 80 μl ,HEPES-Puffer' (10 mM bis 1 M HEPES, 150 mM NaCL, pH 7,4) gelöst und nach Ablauf der 10 Minuten zu der DNA-Lösung pipettiert.
  • Die Komplexierung erfolgt durch Inkubation für bis zu 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Komplexe können dann aliquotiert und eingefroren werden. Zur weiteren Verarbeitung müssen die Komplexe dann lediglich aufgetaut werden. Wenn die Komplexe aufgetaut wurden, werden sie vor Verwendung durch kurzes Vortexen gemischt und nochmals 30–60 min inkubiert.
  • Je nach Art und Größe der zu komplexierenden Nukleinsäure, können selbstverständlich alle Mengen und Volumina-Angaben, sowie die Mischungsverhältnisse der Polymer- und der Nukleinsäure-Lösung den jeweiligen Bedürfnissen angepasst werden. Auch das hergestellte Gesamtvolumen der Komplex-Lösung ist nur exemplarisch zu verstehen und kann selbstverständlich auch im Midi- oder Maxi- bzw. Industriellen Maßstab hergestellt werden.
    • b) Zur Herstellung eines Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes zur Lyophilisierung sei beispielhaft die bekannte Herstellung von PEI F25-LMW/DNA-Komplexen genannt.
  • Dazu werden 260 μg DNA in 1040 μl 5% Glucose in Wasser gelöst und für 10 Minuten inkubiert. 213 μl PEI F25-LMW (6,1 μg/μl) werden in 1040 μl 5% Glucose in Wasser gelöst und nach Ablauf der 10 Minuten zu der DNA-Lösung pipettiert. Nach kurzem Vortexen wird 1 h inkubiert und erneut kurz gevortext.
  • Es werden 26 Aliquots à 92 μl hergestellt und unter Standardbedingungen lyophilisiert (erniedrigte Temperatur, Vakuum). Die Rückstände können dann in verschiedenen wässrigen oder organischen Lösungsmitteln wieder aufgenommen werden.
  • Auch hier gilt: Je nach Art und Größe der zu komplexierenden Nukleinsäure, können selbstverständlich alle Mengen und Volumina-Angaben, sowie die Mischungsverhältnisse der Polymer- und der Nukleinsäure-Lösung den jeweiligen Bedürfnissen angepasst werden. Auch das hergestellte Gesamtvolumen der Komplex-Lösung ist nur exemplarisch zu verstehen und kann selbstverständlich auch im Midi- oder Maxi- bzw. Industriellen Maßstab hergestellt werden.
  • Beispiel 2 – Herstellung der Spinnlösung
  • Zur Herstellung der Spinnlösung werden zwischen 0,2 und 20 Gew.-% des zu verspinnenden Polymers in einem Lösungsmittel gelöst. Als Lösungsmittel kommen dabei bevorzugt Wasser, aber auch organische Lösungsmittel, z. B. Dichlormethan oder Hexafluorisopropanol in Frage. Die Auswahl richtet sich nach dem gewählten Trägerpolymer.
  • Beispiel 3 – Elektroverspinnen, Herstellung des Transfektionsmittels für siRNA
  • Zur Immobilisierung wurden jeweils 165 μg der PEI/siRNA-Komplexe (mit einer Luciferase-spezifischen bzw. mit einer unspezifischen siRNA), gelöst in 100 μL HEPES-Puffer (10 mM HEPES, 150 mM NaCl), aufgetaut und zu 200 μL einer 6 Gew.-% PEO/Wasser-Lösung gegeben. Nach der Vermischung in einem Kreisschüttler (2500 rpm) wurde die Spinnlösung bei einer Spannung von ca. 17 kV und einem Abstand von 14 cm auf Glasplättchen als Trägermatrix versponnen. Die Flussrate betrug 0,2 mL/h.
  • Beispiel 4 – Transfektionseffizienz eingesponnener Nanoplexe im Vergleich zu Lösungen
  • Man erkennt in 1, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Transfektionsmittels eine deutlich feinere Steuerung der Transfektionseffizienz und mithin der Dosierung eines in die Zellen einzubringenden Wirkstoffes erreichbar ist als mit herkömmlichen Transfektionslösungen.
  • Bei dem dargestellten Experiment werden 100.000 SKOV-3 Ovarialkarzinom-Zellen/Well einer Sixwell-Platte eingesät und 24 h in IMDM/10% FCS-Medium kultiviert. Anschließend werden z. B. zwischen 1 μg und 10 μg Nanofasern mit geträgerten PEI/Luciferase-DNA-Komplexen mit der Pinzette vom Glas-Trägerplättchen abgenommen oder mit Flüssigkeit abgespült und dem Medium zugesetzt. Alternativ können die Glasplättchen mit den aufgebrachten Nanofasern auch invertiert in das Well auf das Medium gelegt werden. Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgt typischerweise zwischen 48 h und 96 h nach Einbringen der Nanofasern über Chemilumineszenz im Luminometer.
  • Die Säulen 1 und 2 zeigen, dass ein deutlicher Unterschied in der Transfektionseffizienz auftritt, wenn bei einer Transfektion mit Hilfe des erfindungsgemäßen Transfektionsmittels die eingebrachte Menge DNA variiert wird. So wurden bei Säule 1 2,6 μg DNA und bei Säule 2 3,9 μg DNA eingesetzt. Die resultierende Lumineszenz – und somit die Wirksamkeit der in die Zellen gelangten Luciferase-Plasmide – unterscheidet sich um etwa eine Zehnerpotenz zwischen beiden Transfektionen. Wird die Menge der DNA dagegen auf herkömmliche Weise, etwa in dem die Menge zugegebener Lösung vervielfältigt wird, variiert, so zeigen die Säulen 3 und 4, dass nahezu kein Unterschied in der Transfektionseffizienz auftritt. Man erkennt deutlich, dass das erfindungsgemäße Transfektionsmittel somit eine deutlich verbesserte Steuerung und Dosierung der Delivery der Nukleinsäure-Wirkstoffe ermöglicht.
  • Beispiel 5 – Lagerbarkeit eingesponnener Nanoplexe
  • Man erkennt in 2, dass ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Transfektionsmittels die verbesserte Lagerbarkeit ist. Dadurch wird es beispielsweise vorstellbar, die Polymer-/Nukleinsäure-Komplex enthaltenden Nanofasern in einer Verabreichungsform wie beispielsweise Tabletten zu verarbeiten, die es ermöglicht, das Transfektionsmittel als Therapeutikum einem Patienten möglichst einfach zu verabreichen.
  • Die Nanofasern mit eingesponnenen Nanoplexen werden bei 4°C oder bei RT über einen längeren Zeitraum, typischerweise mehrere Wochen, trocken gelagert. Die Messung der Transfektionseffizienz erfolgt dann wie in Beispiel 4.
  • Während die Transfektionseffizienz der herkömmlicherweise verwendeten Lösung bei einer Lagerung über einen Zeitraum um 7 Tage um über zwei Zehnerpotzenzen abnimmt, ist bei den erfindungsgemäß in Nanofasern eingesponnenen Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen lediglich ein Rückgang um etwas über einer Zehnerpotzenz feststellbar. Die Beispiele 6a bis 6d, deren Ergebnisse in den 3a bis 3d dargestellt sind, zeigen darüber hinaus, dass mit Hilfe des erfindungsgemäßen Transfektionsmittels ein gezielter Knockdown von Genen durch das Einbringen von siRNA möglich ist. Dabei eignen sich einerseits verschiedene Spinnlösungen (Bsp. 6a bis 6d, 3a bis 3d) andererseits können die erhaltenen Nanofaser zusätzlich noch mit einem Polymerüberzug versehen werden (vgl. Bsp. 6d, 3d).
  • Beispiel 6a – Knockdown-Effizienz von PEI/siRNA-Komplexen, die in PEO-Lösung elektroversponnen werden
  • Es werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt. Diese werden dann entsprechend Beispiel 3 versponnen. Das so erhaltene Transfektionsmittel wird für folgendes Experiment verwendet:
    Es werden 40.000 stabil Luciferase-exprimierende SKOV-3/Luc Ovarialkarzinom-Zellen/Well einer 24-Well-Platte eingesät und 24 h in IMDM/10% FCS-Medium kultiviert. Anschließend werden z. B. zwischen 1 μg und 10 μg Nanofasern mit geträgerten PEI/Luciferase-siRNA-Komplexen mit der Pinzette vom Glas-Trägerplättchen abgenommen oder mit Flüssigkeit abgespült und dem Medium zugesetzt. Dabei kann es sich beispielsweise um PEO-Nanofasern mit 0,63 μg PEI-komplexierter Luciferase-siRNA bzw. einer unspezifischen Kontroll-siRNA handeln. Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgt typischerweise zwischen 48 h und 96 h nach Einbringen der Nanofasern über Chemilumineszenz im Luminometer.
  • Zur Kontrolle auf Spezifität werden in parallelen Ansätzen eine spezifische und eine unspezifische siRNA komplexiert und geträgert. Die Targeting-Effizienz errechnet sich aus der prozentualen Abnahme der Luciferase-Aktivität der mit Nanofaser-geträgerten PEI/spez. siRNA-Komplexen behandelten Zellen versus der Luciferase-Aktivität der mit Nanofaser-geträgerten PEI/unspez. siRNA-Komplexen behandelten Zellen.
  • Man erkennt in 3a, dass die Chemilumineszenz der mit spezifischer siRNA behandelten Zellen im Vergleich zu den mit unspezifischer siRNA behandelten Zellen deutlich abnimmt. Dabei zeigt Säule 9 die durch die Luciferase-Expression hervorgerufene Chemilumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden. Säule 10 zeigt die durch die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Chemilumineszenz. Durch die Behandlung mit der Kontroll-siRNA werden unspezifische, z. B. zytotoxische Effekte als Ursache für den Gen-Knockdown ausgeschlossen.
  • Beispiel 6b – Knockdown-Effizienz von PEI/siRNA-Komplexen, die in PEO/Dichlormethan-Lösung elektroversponnen werden
  • Es werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt.
  • Zur Herstellung von aus Dichlormethan gesponnenen Fasern wurden die in Glucose-Lösung lyophilisierten PEI/siRNA-Komplexe mit einer PEO/DCM-Lösung der Konzentration 1 Gew.-% aufgeschlämmt. Die erhaltene Lösung wurde bei 7,5 kV und einem Elektroden-Abstand von ca. 14 cm verarbeitet und auf Glasplättchen als Trägermatrix aufgebracht.
  • Die Knockdown-Effizienz wurde entsprechend Beispiel 6a bestimmt.
  • Wie in Beispiel 6a bzw. 3a, erkennt man auch hier, dass die spezifische Luciferase-siRNA im Gegensatz zur unspezifischen Kontroll-RNA einen Knockdown der Luciferase-Expression bewirkt. Dabei zeigt Säule 11 die durch die Luciferase-Expression hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden. Säule 12 zeigt die durch die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz.
  • Beispiel 6c – Knockdown-Effizienz von PEI/siRNA-Komplexen, die in PVA-Lösung elektroversponnen werden
  • Es werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt. Diese werden wie folgt durch Elektrospinning weiter verarbeitet.
  • Zur Immobilisierung wurden 165 μg der PEI/siRNA-Komplexe (sowohl der Luciferase-spezifischen, als auch der unspezifischen siRNA), gelöst in 100 μL 'HEPES-Puffer' (10 mM HEPES und 150 mM NaCl), aufgetaut und zu 200 μL einer 12 Gew.-% PVA/Wasser-Lösung gegeben. Nach der Vermischung in einem Kreisschüttler (2500 rpm) wurde die Spinnlösung bei einer Spannung von ca. 21 kV und einem Abstand von 14 cm auf Glasplättchen als Trägermatrix versponnen. Die Flussrate betrug 0,15 mL/h.
  • Die Knockdown-Effizienz wurde entsprechend Beispiel 6a bestimmt.
  • Wie in den Beispielen 6a und 6b bzw. 3a und 3b, erkennt man auch hier, dass die spezifische Luciferase-siRNA im Gegensatz zur unspezifischen Kontroll-RNA einen Knockdown der Luciferase-Expression bewirkt. Dabei zeigt Säule 13 die durch die Luciferase-Expression hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden. Säule 14 zeigt die durch die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz.
  • Beispiel 6d – Knockdown-Effizienz nach vier und nach sieben Tagen von PEI/siRNA-Komplexen, die in PEO/Wasser-Lösung elektroversponnen werden, wobei die Fasern mit PPX beschichtet werden
  • Es werden wie im Beispiel 1 beschrieben PEI/siRNA-Komplexe hergestellt. Diese werden wie in Beispiel 3 beschrieben und elektroversponnen.
  • Für die PPX-Beschichtung der mit PEI/siRNA-Komplex beladenen PEO-Fasern (siehe Beispiel 3) wurde der Beschichter Labcoater 1 PDS 2010 der Firma SPECIALTY COATING SYSTEMS zur chemischen Gasphasenabscheidung (CVD, chemical vapor deposition) verwendet. Die Fasermatten wurden an einer gebogenen Metallstange fixiert, welche am Boden der Beschichtungsapparatur befestigt wurde. Mit einer [2.2]Paracyclophan-Einwaage von 100 mg wurden etwa 50 nm und mit 1 g wurden ca. 500 nm dicke PPX-Beschichtungen erzeugt.
  • Die Knockdown-Effizienz wurde entsprechend Beispiel 6a bestimmt.
  • Wie in den vorangegangenen Beispielen 6a bis 6c bzw. 3a bis 3c, erkennt man auch hier, dass die spezifische Luciferase-siRNA im Gegensatz zur unspezifischen Kontroll-RNA einen Knockdown der Luciferase-Expression bewirkt. Dabei zeigt Säule 15 die vier Tage nach der Transfektion durch die Luciferase-Expression hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt. Säule 16 zeigt die durch die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz im gleichen Zeitraum. Säule 17 und Säule 18 zeigen dagegen die entsprechende Lumineszenz sieben Tage nach der Transfektion, wobei wiederum Säule 17 die durch die Luciferase-Expression hervorgerufene Lumineszenz der kultivierten Zellen, die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden, und Säule 18 die durch die Behandlung mit spezifischer Luciferase-siRNA verminderte Lumineszenz zeigt.
  • Man erkennt dabei in 3d, dass die Verminderung der Luciferase-Expression, die mit dem Knockdown einhergeht, bereits nach vier Tagen deutlich feststellbar ist. Danach bleibt sie auf einem konstant niedrigen Niveau erhalten (vgl. Säule 16 und Säule 18, Wirkung nach 4 und nach 7 Tagen). Dies zeigt, dass das erfindungsgemäße Transfektionsmittel auch eine gleichmäßige Wirkung über einen längeren Zeitraum erlaubt.
  • Die Erfindung ist nicht auf eine der vorbeschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern in vielfältiger Weise abwandelbar. So ist es beispielsweise vorstellbar, an die Nanofasern nach dem Verspinnen Liganden zu koppeln.
  • Die Löslichkeit der der Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe kann durch das zusätzliche Aufbringen einer äußeren Hülle, bspw. aus Lipiden, beeinflusst werden.
  • Vorstellbar ist auch, mehrere unterschiedliche Nukleinsäuren in einen Komplex einzubringen, bspw. Expressions- und Helferplasmide. Alternativ können auch mehrere unterschiedliche Komplexe gleichzeitig versponnen werden.
  • Man erkennt, dass ein nicht-virales Transfektionsmittel vorteilhaft aus Polymer/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern besteht, wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer bestehen. Die Nanofasern trägern die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, wobei das nicht-virale Transfektionsmittel zweckmäßig durch Elektrospinning hergestellt ist.
  • Man erkennt weiter, dass das kationische Polymer günstigerweise ein Polyimin bevorzugt Polyethylenimin ist und mit einem oder mehren daran gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert sein kann. Zweckmäßig kann es auch sein, das kationische Polymer mit einem oder mehreren Kohlenhydraten und/oder mit einem rezeptorspezifischen Liganden zu koppeln. Die Nukleinsäure ist eine DNA oder eine RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat, vorteilhaft eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure. Die Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren, bioverträglichen Polymeren. Sie bzw. das gesamte Transfektionsmittel können mit einem Polymerüberzug versehen sein.
  • Weiterhin erkennt man, dass ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen Transfektionsmittels die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes, Herstellung einer Spinnlösung enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, Elektrospinnen.
  • Man erkennt außerdem, dass das nicht-virale Transfektionsmittel zur Transfektion von eurkaryotischen Zellen und zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann. Das Arzneimittel kann mit Vorteil für gentherapeutische Behandlungen verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft mithin ein nicht-virales Transfektionsmittel bestehend aus Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern, wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer bestehen. Die Nanofasern trägern die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, wobei das nicht-virale Transfektionsmittel zweckmäßig durch Elektrospinning hergestellt ist. Das kationische Polymer ist günstigerweise ein Polyimin bzw. Polyethylenimin und kann mit einem oder mehren daran gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert sein. Zweckmäßig kann es auch sein, das kationische Polymer mit einem oder mehreren Kohlenhydraten und/oder mit einem rezeptorspezifischen Liganden zu koppeln. Die Nukleinsäure ist eine DNA oder eine RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat, vorteilhaft eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure. Die Nanofasern bestehen aus bioabbaubaren, bioverträglichen Polymeren. Sie bzw. das gesamte Transfektionsmittel können mit einem Polymerüberzug versehen sein. Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen Transfektionsmittels umfasst die folgenden Schritte: Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes, Herstellung einer Spinnlösung enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe, Elektrospinnen.
  • Man erkennt, dass das nicht-virale Transfektionsmittel zur Transfektion von eurkaryotischen Zellen und zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden kann. Das Arzneimittel kann mit Vorteil für gentherapeutische Behandlungen verwendet werden.
  • Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung und der Zeichnung hervorgehenden Merkmale und Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten, räumlicher Anordnungen und Verfahrensschritten, können sowohl für sich als auch in den verschiedensten Kombinationen erfindungswesentlich sein.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • - WO 96/02655 A1 [0004]
    • - WO 98/59064 A1 [0005]
    • - WO 01/43777 A1 [0008]

Claims (16)

  1. Nicht-virales Transfektionsmittel umfassend Polymer-/Nukleinsäure-Komplexen und Nanofasern, wobei die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe aus mindestens einer Nukleinsäure und mindestens einem kationischen Polymer bestehen.
  2. Nicht-virales Transfektionsmittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanofasern die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe trägern.
  3. Nicht-virales Transfektionsmittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-virale Transfektionsmittel durch Elektrospinning hergestellt ist
  4. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer ein Polyimin, bevorzugt Polyethylenimin (PEI) oder Polypropylenimin (PPI), besonders bevorzugt Polyethylenimin (PEI) ist
  5. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kationische Polymer mit einem oder mehreren daran gekoppelten hydrophilen Polymeren modifiziert ist.
  6. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekulargewicht des kationischen Polymers zwischen 0.6 kD und 2 000 kD, bevorzugt zwischen 0.6 kD und 800 kD, besonders bevorzugt zwischen 4 kD und 25 kD liegt.
  7. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine DNA oder eine RNA oder ein DNA- oder RNA-Derivat ist.
  8. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure eine therapeutisch wirksame Nukleinsäure ist.
  9. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanofasern aus bioabbaubaren, bioverträglichen Polymeren bestehen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe Polylactide, Polyvinylalkohole, Polyethylenglykole, Polycaprolacton, Polyhydroxybutyrate, Polyesterurethane, Cellulose, Celluloseacetat, Chitosan, Alginate, Collagen oder Co-Polymere davon und Elends.
  10. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Transfektionsmittel mit einem Polymerüberzug versehen ist, bevorzugt mit einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykole (PEG), Polyethlyenimine (PEI), Poly(diallyldimethylammoniumchlorid) (PDDA), Polylactide (PLA), Polycaprolacton (PCL), Polyesterurethane (PEU), Cellulose, Celluloseacetat, Chitosan, Alginate, Collagen, Poly-p-xylylen (PPX), Copolymere davon und Elends, oder Lipide, besonders bevorzugt mit einem Polymerüberzug aus einem bioabbaubaren Polymer.
  11. Nicht-virales Transfektionsmittel nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanofasern einen Durchmesser von 1 nm und 100 μm, bevorzugt zwischen 10 nm und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 50 nm und 3 μm haben.
  12. Verfahren zur Herstellung eines nicht-viralen Transfektionsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 umfassend die Schritte: – Bereitstellung des Polymer-/Nukleinsäure-Komplexes; – Herstellung einer Spinnlösung enthaltend die Polymer-/Nukleinsäure-Komplexe sowie mindestens ein Trägerpolymer; – Elektrospinnen.
  13. Verwendung eines nicht-viralen Transfektionsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Transfektion von eukaryotischen Zellen.
  14. Verwendung eines nicht-viralen Transfektionsmittels nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Herstellung eines Arzneimittels.
  15. Arzneimittel enthaltend ein nicht-virales Transfektionsmittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
  16. Verwendung eines Arzneimittels nach Anspruch 15 für die gentherapeutische Behandlung, bevorzugt für den therapeutischen Knockdown eines Gens.
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