CN119817819B - 戊糖片球菌mpl5在促进食物中结合钙转化成离子钙、改善骨质疏松中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了戊糖片球菌MPL5及其促进食物中结合钙转化成离子钙、改善钙生物可及性的应用，属于微生物技术领域。本发明提供的戊糖片球菌MPL5在培养液或组合物发酵液中均能够有效促进结合钙转化成离子钙（＞60%），进而提高钙的生物利用度；还能够改善和调理骨质疏松，具体体现在：显著提高骨质疏松模型小鼠的骨密度、骨小梁数目、骨小梁连通性和骨小梁连接密度，显著降低骨小梁分离度和结构模型指数，从而减少骨质疏松的发生。本发明的戊糖片球菌MPL5在制备促进离子钙转化、辅助缓解骨质疏松的功能性食品、保健食品中，具有非常广泛的应用场景，健康安全。

Description

戊糖片球菌MPL5在促进食物中结合钙转化成离子钙、改善骨 质疏松中的应用

技术领域

本发明涉及微生态技术领域，具体涉及戊糖片球菌MPL5（包括其发酵物）在促进食物中结合钙转化成离子钙和改善骨质疏松中的应用。

背景技术

骨质疏松症是一种以骨量低下、骨微结构破坏而导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性代谢性骨病，常见于老年人。随着年龄的增加，骨细胞及成骨细胞代谢活动、性腺代谢活动、食物消化、营养吸收等都在不断衰退，这些都会导致骨质疏松的发生。此外，现在很多人存在长期的不良生活及饮食习惯，如：熬夜、挑食、过量饮酒/咖啡/碳酸饮料等，导致骨质大量流失，因此，这种疾病也发生在青年，甚至是未成年群体中。

作为构成骨骼和牙齿的重要物质，钙参与肌肉收缩、神经递质的合成与释放、激素的合成与分泌、血液凝固等众多复杂的生命活动，充分的钙质摄入，有利于改善骨质疏松。对于骨质疏松的群体来说，即使每日膳食中的食物含有丰富的钙质，但是这些钙质未能得到很好转化时，不能满足人体对钙的需求，骨质疏松症状仍不能得到改善。

食物中的钙大多以结合钙的形式存在，如果要被人体吸收，需要转化为离子钙，才能快速被肠道吸收。如何将有效地促进食物中的结合钙转化为离子钙，成为本领域亟待解决的技术问题。我们通过大量实验发现能够促进食物中结合钙转化为离子钙的益生菌，极大地提高了肠道对钙的吸收和利用，人体食用后，有利于改善骨质疏松。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种戊糖片球菌MPL5，该戊糖片球菌MPL5能够促进食物中结合钙转化成离子钙，有利于改善骨质疏松，效果显著，且健康安全。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明第一方面提供了一种戊糖片球菌，所述戊糖片球菌为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）MPL5，于2023年6月30日保藏于广东省微生物菌种保藏管理中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No.63606，并于公开日为2023年12月22日、公开号为CN117264852A的中国发明专利申请中公开。

戊糖片球菌为兼性厌氧菌，隶属于片球菌属，是乳酸菌的一种，能以多种糖为碳源产生大量的有机酸，无蛋白水解作用，对啤酒花防腐剂敏感。作为一种益生菌，戊糖片球菌主要分布于新鲜麦芽汁及发酵植物材料中，如酸腌菜、青贮料中。戊糖片球菌是一种可食用菌种，目前已被证实具有提高营养物质合成和代谢，抑制病原菌的生长，降低血清胆固醇，提高人体免疫力等益生功能。但是，目前并未发现可以促进食物中的结合钙转化成离子钙的戊糖片球菌菌株。

本发明中，华南农业大学广东省微生态制剂工程技术研究中心偶然在储藏熟透的芒果果肉中发现一株戊糖片球菌新菌株，将其命名为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）MPL5。通过实验发现，该菌株具有促进食物中的结合钙转化成离子钙的功能，且转化率＞60%。

本发明第二方面提供了一种微生态制剂，所述菌剂中包含上述的戊糖片球菌MPL5。

进一步地，所述微生态制剂可以包含各种上述戊糖片球菌MPL5的制剂，包括但不限于菌悬液、发酵液等。

本发明第三方面提供了一种改善骨质疏松的发酵物，所述发酵物是将所述的戊糖片球菌MPL5接种在组合物中，经发酵后得到；

其中，所述组合物包括按重量份计的如下组分：榛子仁30~40份、燕麦20~30份、黄小米10~15份、低聚果糖10~20份、低聚异麦芽糖10~30份、水苏糖5~10份、水500~700份。

榛子仁营养价值高，有“坚果之王”的美称，富含钙、磷和铁等多种矿物质，其中钙的含量高达815mg/100g，对于保护骨骼健康、增强体质、抵抗疲劳、延缓衰老非常有益；而且还含有能使人体骨骼、皮肤、肌腱、韧带等组织坚固的锰元素及具有重要生理功能的多种维生素，如维生素B1、B2、B6和E，其中维生素E的含量高达33.9 mg/100g，具有较强的抗氧化作用。

燕麦为禾本科燕麦属作物，含有丰富的蛋白质、脂质、膳食纤维、碳水化合物、矿物质、抗氧化剂（如维生素E、酚酸、黄酮、甾醇和生物碱等）等多种营养物质，其中，铁含量为大米的8倍，钙含量为大米的5倍，硒含量为大米的35倍，长期食用不仅可以有效预防老年人的钙流失、骨质疏松等疾病，维持人体钙元素的平衡，还有利于预防过早衰老、慢性疾病、癌症、心血管疾病和中风。

黄小米中含有丰富的钙、铁、锌、镁、磷等微量元素，这些微量元素在人体生长发育和免疫调节中起着不可或缺的作用；此外，黄小米的脂肪酸组成合理，不饱和脂肪酸如亚麻酸、亚油酸含量在85%以上，尤其是亚油酸含量为65.05%。这些脂肪酸以甘油酯的形式存在，对皮肤、微血管、中枢神经系统都具有保护作用，并可防治动脉硬化和肝硬化，是脂溶性维生素和脂溶性色素（胡萝卜素）的良好溶剂，有利于人体吸收这些营养素。

榛子仁、燕麦和黄小米中均含有丰富的钙元素，这些钙元素主要以结合钙的形式存在。本发明中，以戊糖片球菌MPL5为发酵菌种，对包含榛子仁、燕麦和黄小米在内的组合物进行发酵处理，利用戊糖片球菌MPL5能够促进结合钙转化成离子钙的特性，将榛子仁、燕麦和黄小米中富含的结合钙转化为离子钙，使发酵物中含有丰富的且易于被人体吸收利用的离子钙，有利于改善骨质疏松。此外，榛子仁、燕麦和黄小米中还含有丰富的蛋白质、脂质、膳食纤维、碳水化合物、其他矿物质、微量元素等多种营养元素，且经发酵处理后更容易被人体吸收，能够更好的满足人体生长发育的需要。

低聚果糖、低聚异麦芽糖、水苏糖属于功能性低聚糖，稳定性较高，难以被人体消化道的酶系分解，但是能够作为益生菌的碳源，可促进益生菌的繁殖代谢。

上述组合物中，榛子仁的重量份为30~40份，例如可以为30份、31份、32份、33份、34份、35份、36份、37份、38份、39份、40份等。燕麦的重量份为20~30份，例如可以为20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份等。黄小米的重量份为10~15份，例如可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份等。低聚果糖的重量份为10~20份，例如可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份等。低聚异麦芽糖的重量份为10~30份，例如可以为10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份、21份、22份、23份、24份、25份、26份、27份、28份、29份、30份等。水苏糖的重量份为5~10份，例如可以为5份、6份、7份、8份、9份、10份等。水的重量份为500~700份，例如可以为500份、550份、600份、650份、700份等。

进一步地，在优选的实施例中，所述组合物包括按重量份计的如下组分：榛子仁30份、燕麦30份、黄小米15份、低聚果糖10份、低聚异麦芽糖10份、水苏糖5份、水500份。

本发明第四方面提供了一种改善骨质疏松的发酵物的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将配方量的榛子仁、燕麦和黄小米清洗后混匀，加水进行破壁，得到浆液；然后将破壁液进行熬煮，趁热再次破壁；过滤后，收集滤液，得到浆液；

S2. 将配方量的低聚果糖、低聚异麦芽糖和水苏糖混匀，加入所述料液中，溶解混匀后进行灭菌，得到培养基质；

S3. 将戊糖片球菌MPL5接种于所述培养基质中，经厌氧培养后，得到发酵半成品；

S4. 对所述发酵半成品进行低温高压均质，得到所述发酵物。

进一步地，步骤S2中，所述灭菌的条件为121℃下灭菌15min。

进一步地，步骤S3中，所述戊糖片球菌MPL5的接种量为：菌液的添加量为5~20重量份，优选为10重量份；菌液的浓度为3.0×10¹⁰CFU/mL。所述厌氧培养的条件为：培养温度为37℃，培养时间为16h。

本发明步骤S4中，采用低温高压均质技术的目的是：在低温下，由于突然减压和高速冲击，细胞破裂，细胞内酶与底物之间的空间位阻被消除。此技术不仅能促进菌株细胞的自溶，充分释放胞内营养成分，还能保护菌株代谢物的生物活性，使得发酵制品在功效和生物利用度方面得到极大提升。人体食用此发酵物之后，能显著改善骨质疏松。

进一步地，步骤S4中，在进行低温高压均质时，均质压力为150~200MPa，例如可以为150 MPa、160 MPa、170 MPa、180 MPa、190 MPa、200 MPa等。循环次数可为2~5次。

本发明第五方面公开了所述的戊糖片球菌、所述的微生态制剂或所述的发酵物在制备促进食物中结合钙转化成离子钙的制剂中的应用。

本发明第六方面公开了所述的戊糖片球菌、所述的微生态制剂或所述的发酵物在制备改善骨质疏松的制剂中的应用。

进一步地，所述戊糖片球菌包括但不限于活菌型和灭菌型。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1. 本发明提供的戊糖片球菌MPL5，能够促进食物中结合钙转化为离子钙，转化率＞60%，极大地提高了肠道对钙的吸收和利用。人体食用后，有利于改善骨质疏松。

2. 本发明利用戊糖片球菌MPL5对包括榛子仁、燕麦和黄小米在内的组合物进行发酵处理，利用戊糖片球菌MPL5能够促进结合钙转化成离子钙的特性，将榛子仁、燕麦和黄小米中富含的结合钙转化为离子钙，使发酵物中含有丰富的离子钙，且生物利用度高，有利于改善骨质疏松。

3. 本发明中的低温高压均质技术，不仅能促进菌株细胞的自溶，充分释放胞内营养成分，还能保护菌株代谢物的生物活性，使得发酵制品在功效和生物利用度方面得到极大提升。人体食用此发酵物之后，能显著改善骨质疏松。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

下述实施例与对比例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

菌株筛选：

将储藏熟透的芒果去皮，取果肉，首先在含溴甲酚紫 MRS 固体培养基上通过稀释平板涂布和划线纯化等方法，分离出多株产酸菌株；其次通过石蕊牛奶显色试验、产酸性能的测定，进一步筛选出一株产生有机酸效率高的菌株。根据形态学特征、生理生化特征以及三代16S扩增子测序分析鉴定，该菌株为戊糖片球菌，将其命名为 MPL5。

基因序列鉴定结果：

aagcatgcgcgtgctatacatgcagtcgaacgaacttccgttaattgattatgacgtacttgtactgattgagattttaacacgaagtgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccagaagtaggggataacacctggaaacagatgctaataccgtataacagagaaaaccgcatggttttcttttaaaagatggctctgctatcacttctggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggcaaaggctcaccaaggcagtgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgctagatggtggggactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacgtgggtaagagtaactgtttacccagtgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtcttttaagtctaatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctggacatggatacaggtggcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgattactaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagtaatccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaagaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgacagtctaagagattagaggttcccttcggggacagaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattactagttgccagcattaagttgggcactctagtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagtcgcgagaccgcgaggttaagctaatctcttaaaaccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccggtggggtaaccttttaggagctagccgtctaagcgat。

测试例一：戊糖片球菌MPL5的结合钙转化率测定

1、实验菌株：戊糖片球菌MPL5

2、样品制备

（1）培养基制备

称取MRS液体培养基粉末104.48g，加入2000mL纯净水，搅拌溶解，量取100mL，记为溶液A，其余记为溶液B。向溶液B中加入5.0g碳酸钙、5.0g乳钙，搅拌均匀，即得，记为溶液C。将溶液A、溶液C灭菌15min，灭菌温度为121℃，冷却至37℃，即得培养基，分别记为培养基A、培养基C。

（2）菌种活化

取出戊糖片球菌MPL5的冻干保藏管，开口，用0.6mL无菌生理盐水溶解菌粉，吸取全部菌液至MRS固体培养基上，涂布均匀，37℃厌氧培养24小时，挑取2环菌落至10mL 培养基A中，37℃厌氧培养24小时后，调节菌液浓度为1.0×10⁹CFU/mL，即得菌液。

（3）培养

吸取1mL菌液至100mL的培养基C中，混合均匀，分别厌氧培养0h、4h、8h、12h、16h、20h，依次记为A组、B组、C组、D组、E组、F组，每组做3个平行，培养温度为37℃，即得培养液。

（4）离心

将培养液用离心机离心10分钟，离心条件为4℃，8000 r/min。离心结束时，分离沉淀及上清液，即得上清液，称重，沉淀用2倍体积的清水冲洗，即得沉淀物，称重。

3、结合钙、离子钙转化率测定

（1）钙显色剂的配制

将储存液 1、储存液 2、甲醇按 20：9：14 的比例配成钙显色剂，临用前配制。其中，储存液 1的配制方法：称取邻甲酚酞络合剂 32.5 mg，加水 100 ml，加浓盐酸 7.5 mL，充分溶解后定容到 500 mL 容量瓶中；储存液 2的配制方法为：量取二乙胺 21 mL，加水定容至500 mL容量瓶中，混匀。

（2）工作曲线绘制

分别吸取0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mL 3mg/mL的钙标准溶液到10 mL容量瓶中定容，得到不同浓度的钙标准液。在570nm测定不同浓度的钙标准液的分光度，以钙离子浓度和吸光度为横纵坐标绘制标准曲线。

（3）对沉淀物和上清液进行称重，取0.1mg样品加入5mL具塞比色管中，用与样品等量的纯化水代替样品作试剂空白。准确加入4mL钙显色剂，混匀。5min后，于570nm处用0.5cm比色皿比色。利用标准曲线法测定不同组别的上清液和沉淀物中钙的含量，计算结合钙的转化率，求平均值（按四舍五入法进行修约，保留小数点后两位），结果如表1所示。

4、结果与分析

碳酸钙、乳钙均为钙与其他化合物结合而成的结合钙，不溶于水，因此离心后，存在于沉淀物中。在发酵过程中，一部分结合钙能被转化成离子钙，即钙以离子的形式存在，易溶于水，因此离心后，存在于上清液中。由表1可知，与A组相比，B组～F组的沉淀物的钙含量不断减少，上清液的钙含量不断增加，转化率不断增加，说明随着发酵时间的延长，结合钙不断被菌株转化成离子钙。其中，F组的转化率最高，E组与F组的转化率相差最小，说明发酵16h后，菌株的生长状况趋于饱和，培养液中的结合钙转化情况趋于饱和，结合钙转化成离子钙的转化率均＞60%。

实施例1

本实施例提供了一种促进食物中结合钙转化成离子钙的发酵制品，包括以下步骤：

S1、原料选择：选择干燥的、无霉变、无虫蛀的榛子仁、燕麦、黄小米，质量合格的低聚果糖、低聚异麦芽糖、水苏糖。

S2、清洗及称量：将榛子仁、燕麦、黄小米用清水清洗3次，沥干后，称取榛子仁30份、燕麦30份、黄小米15份，混合均匀，即为混合物A。

S3、破壁：称取500份纯化水，与混合物A混合均匀，用破壁机破壁1min，转速为36000r/min，再倒入熬煮锅中，熬煮20min，补充损失的水分，趁热用破壁机破壁0.5min，依次用60目、100目过滤网过滤，收集滤液，记为料液B。

S4、调配：称取低聚果糖10份、低聚异麦芽糖10份、水苏糖5份，混合均匀，加入料液B中，搅拌溶解，即得，记为料液C。

S5、灭菌：对料液C进行灭菌，灭菌条件为121℃、15min，冷却至37℃，即得组合物，记为组合物D。

S6、菌种活化：取出戊糖片球菌MPL5的冻干保藏管，开口，用0.6mL无菌生理盐水溶解菌粉，吸取全部菌液至MRS固体培养基上，涂布均匀，37℃厌氧培养24小时，挑取2环菌落至10mL组合物D中，37℃厌氧培养24小时后，调节菌液浓度为3.0×10¹⁰CFU/mL，即得菌液，记为菌液E。

S7、接种发酵：取5重量份的菌液E，加入组合物D中，混合均匀，37℃厌氧培养16小时，冷藏8h，即得半成品，记为半成品F。

S8、均质：对半成品F进行低温高压均质，均质压力150MPa ，循环次数3次，温度4℃，所得终产物即为发酵制品。

实施例2~4与对比例1

实施例2~4与对比例1的制备方法与实施例1相同，区别在于：菌液的添加量不同。菌液具体的添加量如表2所示。

表2

测试例二：离子钙含量测定

1、取5g发酵制品，用5g纯化水洗涤、离心，收集上清液，每个实施例、对比例做3组平行。

2、按照《GB 5009.92食品安全国家标准食品中钙的测定》的火焰原子吸收光谱法，对上清液的钙含量进行测定，求平均值（按四舍五入法进行修约，保留小数点后两位），结果如表3所示。

3、结果与分析

表3

经过戊糖片球菌MPL5的发酵，组合物中的结合钙逐渐被转化成离子钙，用纯化水洗涤后，离子钙能溶解于水中。由表3可知，与对比例1相比，实施例1～实施例4的离子钙含量均有增加，说明戊糖片球菌MPL5能促进食物中的结合钙转化成离子钙，其中实施例4的发酵制品的离子钙含量最高，且与实施例2、实施例3的发酵制品的离子钙含量接近，说明实施例2、实施例3、实施例4的菌液添加量，都能使食物中的结合钙充分转化成离子钙，菌株的代谢活动接近饱和。因此，选择实施例2的菌液添加量作为最佳添加量，所得的发酵制品的结合钙能充分转化成离子钙。

对比例2~8

对比例2~8的制备方法与实施例2相同，区别在于：发酵原料的配比不同。发酵原料具体的配比如表4所示。

对比例9

对比例9的制备方法与实施例2相同，区别在于：对比例9未采用高压均质技术，其步骤S8为：将半成品F升温至常温（25℃），用胶体磨均质，循环次数3次，所得的终产物即为发酵制品。

实施例5

本实施例提供了一种固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、取出戊糖片球菌MPL5的冻干保藏管，开口，用0.6mL无菌生理盐水溶解菌粉，吸取全部菌液至MRS固体培养基上，涂布均匀，37℃厌氧培养24小时，挑取2环菌落至10mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24小时后，调节菌液浓度为1.0×10¹¹CFU/mL，即得菌液，记为菌液A。

S2、将菌液A离心，分离沉淀和上清液，将沉淀与冻干保护剂混合均匀，即得菌液，记为菌液B。

S3、对菌液B进行真空冷冻干燥，再粉碎过筛，即得粉末，所得的粉末为活菌型的戊糖片球菌MPL5菌粉。

S4、将10份戊糖片球菌MPL5菌粉与90份低聚果糖混合均匀，即得粉末，所得的粉末为固体制剂A。

实施例6

本实施例提供了一种固体制剂的制备方法，包括以下步骤：

S1、取出戊糖片球菌MPL5的冻干保藏管，开口，用0.6mL无菌生理盐水溶解菌粉，吸取全部菌液至MRS固体培养基上，涂布均匀，37℃厌氧培养24小时，挑取2环菌落至10mL MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24小时后，调节菌液浓度为1.0×10¹¹CFU/mL，即得菌液，记为菌液A。

S2、将菌液A离心，分离沉淀和上清液，将沉淀与冻干保护剂混合均匀，即得菌液，记为菌液B。

S3、对菌液B进行真空冷冻干燥，再粉碎过筛，即得粉末，所得的粉末为戊糖片球菌MPL5菌粉。

S4、将戊糖片球菌MPL5菌粉在60℃的条件下加热45min，再升温至80℃保持20min，最后粉碎过筛，即得粉末，所得的粉末为灭活型的戊糖片球菌MPL5菌粉。

S5、将10份灭活型的戊糖片球菌MPL5菌粉与90份低聚果糖混合均匀，即得粉末，所得的粉末为固体制剂B。

测试例三：离子钙含量测定

1、取5g发酵制品，用5g纯化水洗涤、离心，收集上清液，每个实施例做3组平行。

2、按照《GB 5009.92食品安全国家标准 食品中钙的测定》的火焰原子吸收光谱法，对上清液的钙含量进行测定，求平均值（按四舍五入法进行修约，保留小数点后两位），结果如表5所示。

请参见表5，结果显示，采用不同原料组方制备的发酵制品，其离子钙含量均有差异，其中，实施例2的发酵制品中的离子钙含量最高。这说明，原料组方对于最终发酵制品中离子钙的含量有影响，实施例2中特定组方的原料经戊糖片球菌MPL5发酵后得到的发酵制品中，具有最高的离子钙含量。

测试例四：骨质酥松小鼠模型试验

1、溶液制备

（1）0.5％羧甲基纤维素钠(0.5% CMC-Na)溶液：精密称量5g羧甲基纤维素钠溶解于去离子水中，超声并搅拌使其溶解均匀，定容至1000 mL，4℃保存备用。

（2）D-半乳糖溶液（D-gal溶液）：精密称量1.5g D-半乳糖溶解于生理盐水中，搅拌使其充分溶解均匀，定容至100mL，4℃保存备用。

（3）阿仑膦酸钠溶液：精密称量14mg阿仑膦酸钠粉末，超声并搅拌使其均匀分布于0.5% CMC-Na溶液中，定容至 10mL，4℃保存备用。

2、实验动物：ICR小鼠，3月龄，雄性，体重28±2g，清洁级。

3、分组及造模

将小鼠随机分成14组，每组6只，记为A组～N组。A组腹腔注射等体积生理盐水，其余13组小鼠均腹腔注射D-gal溶液，给药剂量为150mg/kg，每周3次，持续12周。具体给药方式如表6所示。

4、给药

C组小鼠给药剂量为14mg/kg，每周灌胃给药1次；D组～L组小鼠灌胃实施例的发酵制品，给药剂量为260mg/kg，A组和B组小鼠灌胃等量的0.5%CMC-Na溶液，每天灌胃，持续12周。具体给药方式如表6所示。

5、小鼠骨骼标本采集及处理

取小鼠右侧股骨，剔净多余的组织，以生长板向上100层作为ROI区域，以12μm的层厚扫描股骨远端并进行Micro-CT检测。检测指标包括：骨密度（BMD）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨小梁数目（Tb.N）、结构模型指数（SMI）、骨小梁连通性（Conn）及骨小梁连接密度（Conn.Dn），结果如表7所示。

6、结果与分析

表7的结果显示，与A组相比，B组小鼠的BMD、Tb.N、Conn、Conn.Dn等指标显著降低，Tb.Sp、SMI等指标显著增加，说明老年性骨质疏松小鼠造模成功，骨质流失严重。

与B组相比，C组小鼠的BMD、Tb.N、Conn、Conn.Dn等指标显著增加，Tb.Sp、SMI等指标显著降低，说明阳性药物（阿仑膦酸钠）对老年性骨质疏松有明显的治疗作用。

与B组相比，D组～K组小鼠的BMD、Tb.N、Conn、Conn.Dn等指标均有不同程度的增加，Tb.Sp、SMI等指标均有不同程度的降低，说明用不同组方的组合物制备的发酵制品对骨质疏松的改善效果不同。其中，J组小鼠的BMD、Tb.N、Conn、Conn.Dn等指标最高，Tb.Sp、SMI等指标最低，说明小鼠的骨质疏松改善效果最好，流失的骨质得到很好的重筑和修复。

与B组相比，M组～N组小鼠的BMD、Tb.N、Conn、Conn.Dn等指标均有不同程度的增加，Tb.Sp、SMI等指标均有不同程度的降低，说明戊糖片球菌MPL5菌粉的活菌型与灭活型对骨质疏松均有改善作用，且改善效果不同。

与J组相比，L组小鼠的BMD、Tb.N、Conn、Conn.Dn等指标显著降低，Tb.Sp、SMI等指标显著增加，说明L组小鼠的骨质疏松改善效果比J组差，均质条件的变化会对发酵制品的效果产生显著影响。

因此，结合表5、表7的实验结果，选择J组的发酵制品，即实施例2作为最佳组方，所得的发酵制品离子钙含量最高，改善骨质疏松效果最好。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员可以理解为：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化、删减、增加和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (2)

1. 一种戊糖片球菌发酵物，其特征在于，所述戊糖片球菌为戊糖片球菌MPL5，其保藏编号为GDMCCNo：63606；所述发酵物是将戊糖片球菌MPL5接种在组合物中，经发酵后得到；其中，所述组合物由按重量份计的如下组分制成：榛子仁30份、燕麦30份、黄小米15份、低聚果糖10份、低聚异麦芽糖10份、水苏糖5份、水500份；

所述发酵物的制备方法包括以下步骤：

S1. 将配方量的榛子仁、燕麦和黄小米清洗后混匀，加水进行破壁，得到浆液；然后将浆液进行熬煮，趁热再次破壁；过滤后，收集滤液，得到料液；

S2. 将配方量的低聚果糖、低聚异麦芽糖和水苏糖混匀，加入所述料液中，溶解混匀后进行灭菌，得到培养基质；

S3. 将戊糖片球菌MPL5接种于所述培养基质中，经厌氧培养后，得到发酵半成品；

S4. 对所述发酵半成品进行低温高压均质，得到所述发酵物；

其中，步骤S3中，接种戊糖片球菌MPL5时采用的菌液为10重量份，菌液的浓度为3.0×10¹⁰CFU/mL；

步骤S4中，在进行低温高压均质时，均质压力为150MPa，温度为4℃，循环次数为3次。

2.权利要求1所述的戊糖片球菌发酵物在制备增加骨密度的制剂中的应用，其特征在于，所述戊糖片球菌MPL5为活菌型。