MXPA99005465A

MXPA99005465A - Una nueva endoglucanasa.

Info

Publication number: MXPA99005465A
Application number: MXPA99005465A
Authority: MX
Inventors: Schulein Martin
Original assignee: Novozymes As
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 2002-07-22
Also published as: WO1998028410A1; JP2001507221A; ATE323156T1; BR9713780A; ES2262197T3; AU7873598A; EP0956348B1; DE69735677T2; DE69735677D1; TR199901393T2; EP0956348A1; US6043075A; JP4327255B2

Abstract

Una preparacion de enzima que comprende una endo-~1,4-a-glucanasa que tiene actividad optima a una temperatura arriba de 85°C que es endogena a una cepa que pertenece al filum de Bacterias Gram Positivas, p. ej. la cepa Dictyoglomus sp., DSM 6262, o que exhibe una actividad hacia carboximetilcelulosa (prueba de CMC) a 70°C y pH 10 que es mayor de 50% con respecto a la actividad a 70°C y pH optimo; y una construccion de ADN que comprende la secuencia de ADN que codifica para la endo-1,4-a-glucanasa; la enzima es util p. ej. en la industria textil para mejorar las propiedades de fibras celulosicas o tejidos o para proporcionar una apariencia de lavado de piedra de la mezclilla, o en procesos de limpieza industrial; o en materiales polimericos extruidos en caliente; o en la conversion de biomasa a azucares; o en la produccion de alcohol; o para predigestion de p. ej. granos usados en la produccion de alimento; o en la produccion de cafe instantaneo o procesos de extraccion similares.

Description

UNA NUEVA ENDOGLUCANASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una enzima con actividad celulolitica a temperatura alta, especialmente una endoglucanasa; una secuencia clonada de ADN que codifica la enzima con actividad celulolitica; un método para proporcionar un gen que codifica tal enzima; un método para producir la enzima; una composición de enzima que contiene la enzima con actividad celulolitica; y el uso de la enzima y composición de enzima para número de aplicaciones industriales .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las celulasas o enzimas celuloliticas son enzimas involucradas en la hidrólisis de celulosa. En la hidrólisis de celulosa nativa, se sabe que hay tres tipos principales de enzimas celulasa involucradas, es decir ce 1 ob i oh i dr o 1 as a ( 1 , 4 -be t a - D - g 1 u can celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91), endo-beta-1, 4-glucanasa (endo-1, 4-beta-D-glucan 4-glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4) y beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21). REF.: 30386 Especialmente las endoglucanasas (EC No. 3.2.1.4) constituyen un grupo interesante de hidrolasas para los usos industriales mencionados. Las endoglucanasas catalizan la endo hidrólisis de ligandos 1,4-beta-D-glicosidicos en celulosa, derivados de celulosa (tal como carboxi metil celulosa e hidroxi etil celulosa), liquenina, enlaces beta-1,4 en beta-1,3 glucanos mezclados tal como beta-D-glucanos de cereal o xiloglucanos y otro material de planta que contienen partes celulósicas. El nombre autorizado es endo-1,4-beta-D-glucan 4-glucano hidrolasa, pero el término abreviado endoglucanasa se usa en la presente especificación. La referencia puede hacerse a T.-M. Enveri, "Microbial Cellulases" en .M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, p. 183-224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Vol. 160, p. 200-391 (editado por Wood, W.A. and Kellogg, S.T.); Béguin, P., "Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Vol. 44, pp. 219-248; Béguin, P. an Aubert, J-P., "The bilogical degratation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13. (1994) p. 25-58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Vol. 1, pp. 169-196.

Las Celulosas se sintetizan por un gran número de microorganismos que incluyen hongos, actinomicetos, mixobacterias y bacterias verdaderas pero también por plantas. Especialmente se han identificado endoglucanasas de una amplia variedad de especificidades. Se han descrito muchas endoglucanasas bacterianas (Henrissant, B. and Bairoch, A. (1993) Biochem J. 293: 781-788; Gilbert, H.J. and Hazlewood, G.P. (1993) J. Gen. Microbiol. 139:187-194).

La subdivisión Clostridia es un grupo muy diverso de bacterias anaeróbicas que comprenden isiológicamente géneros muy diferentes. Previamente, el Cl ostridium se consideró un género que incluye toda bacteria anaeróbica que forma endo espora. Sin embargo la introducción de herramientas taxonómicas moleculares tal como la secuenciación de ADNr 16S ha revelado que el grupo es heterogéneo para un nivel muy lejano al género. Además, varios géneros de anaerobios que no forman esporas se clasificaron dentro de Clostridia, que cambió como un grupo taxonómico superior, una subdivisión. Esto es de acuerdo a los hábitats altamente diversificados para estos organismos. La subdivisión Clostridia, por ejemplo, comprende especies con temperatura de crecimiento óptima de un rango muy amplio El género Dictyoglomus comprende bacterias anaerobias termofilicas extremas filogenética ente situadas en la subdivisión Clostridia. Dictyoglomus spp. Están entre la mayoria de organismos termofilicos en la subdivisión Clostridia. En el árbol filogenético de ADNr 16S de Dictyoglomus se presenta con otros géneros ter ofílicos tal como Thermoanaerobacter, Thermoanaerobacterium y Syntrophomonas como las relativas mas cercanas. Sin embargo Dictyoglomus forma una amplia rama que confirma que Dictyoglomus realmente debería considerarse como un género separado.

Dictyoglomus sp . cepa Bl se aisló de una muestra de lodo y pulpa de un tanque que enfría masa de pulpa, p. e . de un ambiente termofílico hecho por el hombre. Una xilanasa de este organismo se ha descrito con respecto a la temperatura óptima (alrededor de 90°C) . La producción de xilanasa de esta -cepa se ha sometido a estudios de optimización de fermentación. Nunca se reportó la presencia de endoglucanasa de especies de.l género Dictyoglomus . Las celulasas dentro del filum Clostridia se han descrito de varias especies de las que unas pocas son termofílicas . En pocos casos se ha determinado la termoestabilidad de endoglucanasas, una de las especies mas estudiadas es Cl ostridi um thermocell um que se ha mostrado estable hasta 80°C. Thermoanaerobacter cell ulyti cus produce al menos dos endoglucanasas con estabilidad hasta 80° C.

Puede hacerse referencia a: Hudson et al. (1991) The cellulase activity of an extreme thermophile, Appl. Microbiol. Biotechnol. 35:270-273; Mathrani and Ahring (1991) Isolation and characterization of strictly xylan-degrading Dictyoglomus from man-made t ermophilic enviroment, Arch. Microbiol. 157:13-17; Adamsen et al. (1995) Optimization of extracellular xylanase production by Di c tyogl omus sp Bl in continuos-culture, Appl. Microbiol. Biotechnol. 44:327-332; Maidak et al. (1994) The Ribosomal Datábase Project, Nuc. Acids Res. 22:3485-3487; Honda et al. (1987) Cloning and expression in E . coli of a Thermoanaeroba cter cell ulyti cus gene encoding for heatstable beta-glucanase, Appl. Microbiol. Biotechnol. 25:480-483; Honda et al. (1988) Isolation of a new cellulase gene from a thermophilic anaerobe and its expression in E . col i , Appl. Microbiol. Biotechnol. 29:264-268.

Un uso industrial muy importante de enzimas celulolíticas es el uso para tratamiento de textil o fibra celulósicos, p. ej . como ingredientes en composiciones de detergente o composiciones suavizadoras de fibras, para bio-abrillantador de fibras nuevas (terminado de prendas), y para obtener una apariencia de "lavado de piedra" de fibras que contienen celulosa, especialmente mezclilla, y se han sugerido varios métodos para tal tratamiento, p. ej . en GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 y EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/000108 y PCT/DK95/00132. Otro uso industrial importante de enzimas celulíticas es el uso para tratamiento de pulpa de papel, p. ej . para mejorar el drenaje o para desentintado de papel reciclado.

También se sabe que las celulasas podrían o no podrían tener un dominio de enlace de celulosa (un CBD) . El CBD aumenta el enlace de la enzima a una fibra que contiene celulosa y aumenta la eficiencia de la parte activa catalítica de la enzima.

Hay una necesidad para proporcionar preparaciones de enzima celulasa económicamente factibles que podrían usarse para aplicaciones donde la actividad celulasa, preferentemente una endoglucanasa, es deseable a temperaturas altas.

El objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas composiciones de enzima o enzimas recombinantes que tienen actividad celulolítica sustancial a condiciones de temperatura alta y mejorar el funcionamiento en aplicaciones industriales, p. ej . en el procesamiento de pulpa de papel, tratamiento textil, procesos de lavandería, procesos de extracción o en alimento animal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los Inventores han tenido ahora éxito en clonar y caracterizar una secuencia de ADN del género bacteriano Di ctyogl omus que codifica una enzima que exhibe actividad celulolítica a temperaturas extremadamente altas en un rango muy amplio de pH, haciéndose posible preparar una composición de enzima celulolítica mono-componente con propiedades deseadas.

Por lo tanto, en un primer aspecto la invención se refiere a una preparación de enzima que tiene actividad endoglucanasa que tiene actividad óptima a una temperatura arriba de 85°C, preferentemente arriba de 90°C, mas preferentemente arriba de 95°C, especialmente arriba de 100°C.

En su segundo aspecto, la invención se refiere a una preparación de enzima que tiene actividad endoglucanasa hacia carboxi metil celulosa (prueba CMC) a 70°C y pH 10 mas alto que 50%, preferentemente mas alto que 55%, mas preferentemente mas alto que 60%, mas preferentemente mas alto que 65%, especialmente mas alto que 70%, relativo a la actividad a 70°C y pH óptimo .

En su tercer aspecto, la invención se refiere a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que tiene actividad endoglucanasa y actividad óptima arriba de 85°C, preferentemente arriba de 90°C, mas preferentemente arriba de 100°C, esta secuencia de ADN comprende a) la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Esch eri chi a coli DSM 11201, o b) un análogo de la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia del ADN obtenible del plásmido en Escheri chia col i DSM 11201, que i) es homologa, preferentemente al menos 60% homologa, con la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenida del plásmido en Escheri chia coli DSM 11201, o ii) hibridiza con la misma sonda de oligonucleótido como la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chi a coli DSM 11201, o iii) codifica un polipéptido que es horrfólogo, preferentemente al menos 60% homólogo, con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia coli DSM 11201, o iv) codifica un polipéptido que es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo aumentado contra la endoglucanasa purificada codificada por la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escherichia coli DSM 11201.

En su cuarto, quinto y sexto aspecto la invención proporciona un vector de expresión que alberga la secuencia de ADN clonada de la invención, una célula que contiene la secuencia de ADN clonada o el vector de expresión y un método para producir una enzima que exhibe actividad celulolítica, este método comprende cultivar la célula bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperar la enzima del cultivo .

Aún en otro aspecto la invención proporciona una enzima aislada que exhibe actividad celulolítica, caracterizada en (i) estar libre de impurezas homologas y (ii) la enzima se produce por el método descrito anteriormente .

La invención se refiere además a una enzima aislada que tiene actividad celulolític , preferentemente una endoglucanasa, que se codifica por la construcción de ADN de la invención. Además, la presente invención se refiere al uso de tal enzima o la preparación de enzima de la invención para aplicaciones industriales tal como en la industria textil para proporcionar las propiedades de fibras celulósicas o fibras textiles o para proporcionar una apariencia de lavado de piedra de la mezclilla; o en procesos de limpieza industriales; o en material polimérico extruido en caliente; o en la conversión de biomasa a azúcares; o en la producción de alcohol; o para predigestión de p. ej . granos usados en la producción de alimento; o en la producción de café instantáneo o procesos de extracción similares.

La invención también se refiere a un cultivo biológico sustancialmente puro aislado de la cepa Escheri chi a col i DSM 11201 que alberga una celulasa que codifica una secuencia de ADN, o alguna mutante de la cepa de E . coli .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En el presente contexto, el término "los 20 residuos aminoácidos que se presentan de forma natural" denota los 20 residuos aminoácido encontrados usualmente en proteínas y conocidos convencionalmente como alanina (Ala o A) , valina (Val o V) , leucina (Leu o L) , ísoleucina (lie o I), prolina (Pro o P), fenilalanina (Phe o F) , triptofano (Trp o W) , metionina (Met o M) , glicina (Gli o G) , serina (Ser o S), treonina (Thr o T), cisteína (Cys o C), tirosina (Tyr o Y) , asparagina (Asn o N) , glutamina (Gln o Q) , ácido aspártico (Asp o D) , ácido glutámico (Glu o E) , Lisina (Lys o K) , arginina (Arg o R) , e histidina (His o H).

La enzima y la preparación de enzima de la invención es activa sobre un amplio rango de pH, preferentemente activa a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11, preferentemente entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.

En una modalidad preferida, la enzima o la preparación de enzima de la invención se obtiene de o endógeno a una cepa que pertenece al filum de Bacteria Gran Positiva, mas preferentemente a la cepa que pertenece a la subdivisión Clostridia, aún mas preferentemente que pertenece al género Di ctyogl omus, especialmente que es la especie Di ctyogl omus sp . , DSM 6262.

En el presente contexto la expresión "una secuencia de ADN clonada", ya sea parcial o completa, se refiere a una secuencia de ADN clonada por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para relocalizar un segmento de ADN de su localización naturales a un sitio diferente donde será reproducido. Los procesos de clonación involucran excisión y aislamiento del segmento de ADN deseado, la inserción de la pieza de ADN en la molécula del vector y la incorporación del vector recombinante en una célula donde se replicarán copias múltiples o clones del segmento de ADN.

La "secuencia de ADN clonada" de la invención podría denominarse alternativamente "construcción de ADN" o "secuencia aislada de ADN".

La secuencia de ADN podría ser genómica, ADNc, u origen sintético o cualquier combinación de estas.

La celulasa que codifica parte de la secuencia de ADN clonada en el plásmido pSJ1678 presente en Esch eri chi a coli DSM 11201 y/o una secuencia análoga de ADN de la invención podría clonarse de una cepa del género bacteriano Di ctyogl omus , preferentemente la cepa Di ctyogl omus, DSM 6262, que produce la enzima con actividad celulasa, preferentemente endoglucanasa, u otro u organismos relacionados como se describe mas abajo .

Alternativamente, la secuencia análoga podría construirse en la base de la secuencia de ADN obtenida del plásmido presente en Escheri chia coli DSM 11201, p. ej . ser una sub-secuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótido que no dan aumento a otra secuencia de aminoácido de la celulasa codificada por la secuencia de ADN, pero que corresponde a la utilización del codón los organismos huésped destinados para la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótido que podrían dar aumento a una secuencia diferente de aminoácido (p. ej . una variante de la celulasa de la invención) .

Cuando se llevan a cabo sustituciones de nucleótido, los cambios de aminoácido son preferentemente de una naturaleza menor, p. ej . sustituciones de aminoácido conservativas que no afectan significativamente el aumento de la actividad enzimática de la proteína, eliminaciones pequeñas, típicamente de uno de aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminal, tal como un residuo metionina amino-terminal, un pequeño péptido enlazador de aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un tracto de poli-histidina, un epítope antigénico o un dominio de enlace.

Ejemplos de sustituciones conservativas están dentro del grupo de aminoácidos básicos (tal como arginina, usina, histidina) , aminoácidos ácidos (tal como ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (tal como glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (tal como leucina, isoleucina, valina), aminoácidos aromáticos (tal como fenilalanina, triptofano, tirosina) y aminoácidos pequeños (tal como glicina, alanina, serina, treonina, metionina) . Para una descripción general de sustitución de nucleótido, ver p . ej . Ford et al., (1991), Protein Expression and Purification 2, 95-107.

Será evidente para expertos en el arte que tales sustituciones pueden hacerse fuera de las regiones críticas para la función de la molécula y aún resulta en un polipéptido activo. Los aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ADN clonada de la invención, y por lo tanto preferentemente no sujete a sustitución, podría identificarse de acuerdo a procedimientos conocidos en el arte, tal como mutagénesis de sitio dirigido o mutagénesis por búsqueda de alanina (cf. p . ej . Cunningham and Wells, (1989), Science 244, 1081-1085). En la última técnica las mutaciones se introducen a cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes se prueban para actividad biológica (p . ej . celulolítica) para identificar residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Sitios de interacción sustrato-enzima también pueden determinarse por análisis de estructura de cristal como se determina por técnicas tal como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado de fotoafinidad (cf. p . ej . de Vos et al., (1992), Science 255, 306-312; Smith et al., (1992), J. Mol. Biol. 224, 899-904; Wlodaver et al., (1992), FEBS Lett. 309, 59-64) .

La endoglucanasa codificada por la secuencia de ADN de la construcción de ADN de la invención podría comprender un dominio que enlaza celulosa (CBD) que existe como una parte integral de la enzima codificada, o un CBD de otro origen podría introducirse en la endoglucanasa creando así una enzima híbrida. En este contexto, el término "dominio que enlaza celulosa" se intenta que se entienda como se definió por Peter Tomme et al. "Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" en "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No. 618, 1996. Esta definición clasifica mas de 120 dominios que enlazan celulosa en 10 familias (I-X), y demuestra que los CBD se encuentran en varias enzimas tal como celulasas, xilanasas, manasas, arabinofuranosidasas, acetil esterasas y quitinasas. Los CBD también se han encontrado en algas, p . ej . la alga roja Porphyra purpurea como una proteína no hidrolítica que enlaza polisacárido, ver Tomme et al., op . ci t . Sin embargo, la mayoría de los CBD son de celulasas y xilanasas, los CBD se encuentran en los términos N y C de proteínas o son internos. Los híbridos de enzima se conocen en el arte, ver p. ej . WO 90/00609 y WO 95/16782, y podrían prepararse transformando en una célula huésped una construcción de ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica el dominio que enlaza celulosa ligado, con o sin un enlazador, a una secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa y que crece en la célula huésped para expresar el gen fusionado. Los híbridos de enzima podrían describirse por la siguiente fórmula: CBD - MR - X en donde CBD es la región N-terminal o C-terminal de una secuencia de aminoácido que corresponde para al menos el dominio que enlaza celulosa; MR es la región media (el enlazador) , y podría ser un enlace, o un grupo que enlaza corto preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 átomos de carbono, mas preferentemente de 2 a 40 átomos de carbono; o es preferentemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 aminoácidos, mas preferentemente de 2 a 40 aminoácidos; y X es una región N-terminal o C-terminal de un polipéptido codificado por la secuencia de ADN de la invención.

La secuencia de ADN de la presente invención puede clonarse de la cepa Escheri chi a col i DSM 11201 usando métodos estándares p . ej . como se describe por Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab.; Cold Spring Harbor, NY .

La secuencia de ADN de la invención también puede clonarse por algún método general que involucra - clonar, en vectores adecuados, una biblioteca de ADN de cualquier organismo, p. ej . Di ctyogl omus , esperado para producir la endoglucanasa de interés, - transformar las células huésped adecuadas con dichos vectores, cultivar las células huésped bajo condiciones adecuadas para expresar cualquier enzima de interés codificada por un clon en la biblioteca de ADN, - cribar para clones positivos determinando cualquier actividad celulolítica de la enzima producida por tales clones, y - aislar la enzima que codifica el ADN a partir de tales clones.

Alternativamente, el ADN que codifica una celulasa de la invención podría, de acuerdo con procedimientos bien conocidos, clonarse convenientemente de una fuente adecuada, tal como cualquiera de los organismos mencionados después, por uso de sondas de oligonucleótidos sintéticas preparadas en la base de la secuencia de ADN obtenida del plásmido presente en Escherichia coli DSM 11201.

Homología de las secuencias de ADN La homología de la secuencia de ADN referida antes se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia de la segunda. La homología podría determinarse adecuadamente por medio de programas de cómputo conocidos en el arte tal como GAP proporcionado en el paquete del programa GCG (Needleman, S:B: and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Usando GAP con los siguientes valores para la comparación de la secuencia de ADN: creación adicional GAP de 5.0 y extensión adicional GAP de 0.3, la secuencia de ADN (parcial) exhibe un grado de identidad de al menos 60%, preferentemente de al menos 75%, mas preferentemente al menos 80%, mas preferentemente al menos 90%, mas preferentemente al menos 95%, mas preferentemente al menos 97% con la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenida del plásmido pfesente en Escheri ch±a coli DSM 11201.

Hibridización La hibridización referida antes se destina para indicar que la secuencia análoga de ADN (parcial) hibridiza con una sonda de oligonucleótido que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenida del plásmido presente en Escheri chia col i DSM 11201 bajo ciertas condiciones especificadas que se describen en detalle después.

Las condiciones adecuadas para determinar hibridización entre una sonda de nucleótido y una secuencia de ADN o ARN homologa involucra prerremojo del filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (citrato salino estándar) durante 10 min, y prehibridización del filtro en una solución de 5 x SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x solución de Denhardt (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado (Sambrook et al. 1989), seguido por hibridación en la misma solución que contiene un cebador aleatorio (Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal . Bi ochem . 132:6-13), 32P-dCTP-marcado (actividad específica > 1 x 109 cpm/µg) sonda durante 12 horas a ca . 45°C. El filtro se lava entonces dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5% de SDS a preferentemente no mas alto de 55°C, mas preferentemente no mas alto de 60°C, mas preferentemente no mas alto de 65°C, aún mas preferentemente no mas alto de 70°C, especialmente no mas alto de 75°C.

Las moléculas a las que la s;nda de oligonucleótido hibridiza bajo estas condiciones se detectan usando una película de rayos-x.

Homología para las secuencias de aminoácido La homología del polipéptido referido antes se determina como el grado de identidad entre las dos secuencias que indican una derivación de la primera secuencia de la segunda. La homología podría determinarse adecuadamente por medio de programas de cómputo conocidos en el arte tal como GAP proporcionados en el paquete del programa GCG (Needleman, S:B: and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Usando GAP con los siguientes valores para la comparación de la secuencia de polipéptido: creación adicional GAP de 3.0 y extensión adicional GAP de 0.1, el polipéptido codificado por una secuencia análoga de ADN (parcial) exhibe un grado de identidad de al menos 60%, preferentemente de al menos 70%, mas preferentemente al menos 80%, mas preferentemente de al menos 85%, mas preferentemente al menos 90%, mas preferentemente al menos 95%, especialmente al menos 97% con el polipéptido codificado por la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenida del plásmido presente en Esch eri chi a col i DSM 11201.

Reactividad cruzada inmunológica Los anticuerpos que se van a usar en la determinación de la reactividad cruzada inmunológica podrían prepararse por uso de una enzima celulolítica purificada. Mas específicamente, el antisuero contra la endoglucanasa de la invención podría aumentarse por inmunización de conejos (u otro roedores) de acuerdo al procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en: Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis , Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A. Johnstone and R. Thorpe Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (mas específicamente p. 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas podrían obtenerse del antisuero, por ejemplo por precipitación con sal ((NH4)2 S04), seguida por diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej . en DEAE-Sefadex. La caracterización inmunoquímica de proteínas podría hacerse ya sea por análisis de doble difusión de Outcherlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed . ) , Blackwell Scientific Publications, 1967, pp . 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen et al., suora , Capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis de cohete (N. Axelsen et al., Capítulo 2).

Fuentes Microbianas La taxonomía aplicada después es de acuerdo con Maidak et al. 1996 (The Ribosomal Datábase Project. Nucí. Acids Res. 24:82-85).

Para el propósito de la presente invención el término "obtenido de" u "obtenible de" como se usó aquí en conexión con una fuente específica, significa que la enzima se produce o puede producirse por la fuente específica, o por una célula en la que se ha insertado un gen de la fuente.

Se contempla en la actualidad que la celulasa de la invención podría obtenerse de una bacteria, en particular una Bacteria Gram Positiva, preferentemente de la subdivisión Clostridia, en particular una cepa del género Di ctyogl omus .

En una modalidad preferida, la celulasa de la invención se obtiene de la cepa de Di ctyogl omus, DSM 6262.

Se contempla en la actualidad que una secuencia de ADN que codifica una enzima homologa a la enzima de la invención podría obtenerse de otras cepas bacterianas, especialmente cepas que pertenecen al género Di ctyogl omus .

Una aislado de una de Di ctyogl omus sp. de la que una celulasa de la invención puede derivarse es públicamente disponible en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, DSM 6262.

Además, el plásmido pSJ1678 que comprende la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa de la invención se ha transformado en una cepa de la Esch eri chia col i que se depositó por los inventores de acuerdo al Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patente en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, República Federal Alemana, el 11 de Octubre de 1996 bajo el número de depósito DSM 11201.

Vectores de expresión recombinante Un vector recombinante que comprende una construcción de ADN que codifícala la enzima de la invención podría ser cualquier vector que podría someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante, y la selección del vector dependerá a menudo de la célula huésped en que se va a introducir. Así, el vector podría ser un vector que se replica autónomamente, p. ej . un vector que existe como una entidad extracromosomal, la replicación de este es independiente de la replicación cromosomal, p. ej . un plásmido. Alternativamente, el vector podría ser uno que, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de la célula huésped en parte o en su integridad y se replica junto con el cromosoma (s) dentro del que se ha integrado.

El vector es preferentemente un vector de expresión en el que la secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención se enlaza operablemente a segmentos adicionales requeridos para transcripción del ADN. En general, el vector de expresión se deriva del ADN del plásmido o viral, o podría contener elementos de ambos. El término "operablemente enlazado" indica que los segmentos se arreglan para que funcionen de acuerdo con sus fines proyectados, p. ej . la transcripción inicia en un promotor y procede a través de la secuencia de ADN que codifica para la enzima.

El promotor podría ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula huésped de selección y podría derivarse de genes que codifican proteínas ya sea homologas o heterólogas a la célula huésped.

Ejemplos de promotores adecuados para usar en células huésped bacterianas incluyen el promotor del gen maltogénico amilasa de Bacillus stearother ophilus, el gen alfa amilasa de Bacillus licheniformis, el gen alfa amilasa de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis, o el gen xilosidasa de Bacillus pumilus, o los promotores del fago Lambda PR o PL o los promotores lac, trp o tac de E . coli .

La secuencia de ADN que codifica la enzima de la invención también podría, si es necesario, conectarse operablemente a un terminador adecuado.

El vector recombinante de la invención podría comprender además una secuencia de ADN que permita al vector replicarse en la célula huésped en cuestión.

El vector también podría comprender un marcador seleccionable, p. ej . el producto de un gen del que complementa un defecto en la célula huésped, o un gen que codifica resistencia a p. ej . antibióticos similares a canamicina, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina, espectinomicina, o similares, o resistencia a metales pesados o herbicidas.

Para dirigir una enzima de la presente invención en la ruta de secreción de las células huésped, una secuencia de señal de secreción (también conocida como una secuencia guía, secuencia prepro o pre secuencia) podría proporcionarse en el vector recombinante. La secuencia de la señal de secreción se une a la secuencia de ADN que codifica la enzima en el marco de lectura correcto. Las secuencias de señal de secreción se colocan comúnmente 5 ' a la secuencia de ADN que codifica la enzima. La secuencia de señal de secreción podría ser la que se asocia normalmente con la enzima o podría ser de un gen que codifica otra proteína secretada .

Los procedimientos usados para ligar las secuencias de ADN que codifican la presente enzima, el promotor y opcionalmente el terminador y/o secuencia de señal de secreción, respectivamente, o para ensamblar estas secuencias por esquemas de amplificación PCR adecuados, y para insertarlos en vectores adecuados que contienen la información necesaria para la replicación o integración, se conocen bien por expertos en el arte (cf., por ejemplo, Sambrook et al., OP . cit . ) .

Células Huésped La secuencia de ADN que codifica la presente enzima introducida en la célula huésped podría ser homologa o heteróloga al huésped en cuestión. Si es homologa a la célula huésped, p. ej . producida por la célula huésped en la naturaleza, se conectará típicamente operable a otra secuencia promotora o, si es aplicable, otra secuencia de señal de secreción y/o secuencia de terminadora en su ambiente natural . El término "homólogo" se destina para incluir una secuencia de ADN que codifica una enzima nativa para el organismo huésped en cuestión. El término "heterólogo" se destina para incluir una secuencia de ADN no expresada por la célula huésped en la naturaleza. Así, la secuencia de ADN podría ser de otro organismo, o podría ser una secuencia sintética.

La célula huésped en la que la construcción de ADN o el vector recombinante de la invención se introduce podría ser cualquier célula que es capaz de producir la presente enzima e incluye bacterias, levadura, hongos y células eucarióticas superiores. Una célula huésped preferida incluye células procarióticas, archeae y hongos filamentosos.

Ejemplos de células huésped fúngicas que, en cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son células de hongos filamentosos tal como las cepas que pertenecen a cualquiera de los géneros Aspergillus , Fusarium y Trichoderma , mas específicamente las cepas que pertenecen a las especies Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium graminerarum y Trichoderma reesei.

Ejemplos de células huésped bacterianas que, en cultivo, son capaces de producir la enzima de la invención son bacterias gram positivas tal como cepas de Bacillus , tal como cepas de B. subtilis , B. licheniformis, B. lentus, B. brevi s , B. s tea r o thermophi lu s , B. a 1 k a 1 oph i 1 u s , B. amyloliquefaciens, B. liquefaciens , B. coagulans , B. círculans , B. lautus, B. megatherium o B. thuringiensis r o cepas de Streptomyces, tal como S. li vi dans o S . murinus, o bacterias gram negativas tal como Esch eri chia col i . La transformación de la bacteria podría efectuarse por transformación del protoplasto, electroporación, conjugación, o usando células competentes de una forma conocida per se (de. Sambrook et al . , supra ) .

Cuando se expresa la enzima en la bacteria tal como E . coli , la enzima podría mantenerse en el citoplasma, típicamente como granulos insolubles (conocidos como cuerpos de inclusión) , o podría dirigirse al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el caso anterior, las células se usan y los granulos se recuperan y desnaturalizan después que la enzima se repliega diluyendo al agente desnaturalizante. En el último caso, la enzima podría recuperarse del espacio periplásmico rompiendo las células, p. ej . por sonicación o choque osmótico, para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la enzima.

Cuando se expresa la enzima en bacterias gram positivas tal como cepas de Ba ci ll us o Streptomyces , la enzima podría mantenerse en el citoplasma, o podría dirigirse al medio extracelular por una secuencia de secreción bacteriana. En el último caso la enzima podría recuperarse del medio como se describe después.

Método para producir una enzima celulolítica La presente invención proporciona un método para producir una enzima aislada de acuerdo a la invención, en donde una célula huésped apropiada, que se ha transformado con una secuencia de ADN que codifica la enzima, se cultiva bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y la enzima resultante se recupera a partir del cultivo.

Como se define aquí, un polipéptido aislando (p. ej . , una enzima) es un polipéptido que es esencialmente libre de otros polipéptidos, p.ej., al menos aproximadamente 20% puro, preferentemente al menos aproximadamente 40% puro, mas preferentemente aproximadamente 60% puro, aún mas preferentemente aproximadamente 80% puro, mas preferentemente aproximadamente 90% puro, y aún mas preferentemente al menos 95% puro, como se determinó por SDS-PAGE.

El termino "polipéptido aislado" podría denominarse alternativamente "polipéptido purificado" .

Cuando un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica la enzima se transforma dentro de una célula huésped heteróloga es posible permitir la producción recombinante heteróloga de la enzima de la invención.

Así es posible para hacer una composición altamente purificada o monocomponente celulolítica, caracterizada en que está libre de impurezas homologas.

En este contexto las impurezas homologas significan cualquier impureza (p. ej . otros polipéptidos diferentes de la enzima de la invención) que se originan a partir de la célula homologa de donde la enzima de la invención se obtiene originalmente.

En la presente invención la célula huésped homologa podría ser una cepa de Di ctyogl omus sp..

El medio usado para cultivar las células huésped transformadas podría ser cualquier medio convencional adecuado para crecer las células huésped en cuestión. La enzima celulolítica expresada podría secretarse convenientemente dentro del medio cultivo y podría recuperarse del mismo por procedimientos bien-conocidos que incluyen separar las células del medio por centrifugación o filtración, precipitando los componentes proteínicos del ambiente por medio de una sal tal como sulfato de amonio, seguido por procedimientos cromatográficos tal como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o similares .

Composiciones de enzima Aún en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición de enzima que comprende una enzima que exhibe actividad celulolítica como se describió antes.

La composición de enzima de la invención podría, además de las celulasas de la invención, comprender uno o mas de otros tipos de enzima, por ejemplo la hemi-celulasa tal como xilanasa y mananasa, otra celulasa o componentes de endoglucanasa, quitinasa, lipasa, esterasa, pectinasa, cutinasa, fitasa, oxidoreductasa, proteasa o amilasa.

La composición de enzima podría prepararse de acuerdo con métodos conocidos en el arte y podría estar en la forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de enzima podría estar en la forma de un granulado o un micro granulado. La enzima que se va a incluir en la composición podría estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en el arte .

Las celulasas termoestables tienen usos potenciales. en muchas industrias y aplicaciones diferentes. Se dan después ejemplos de usos preferidos de la composición de enzima de la invención. La dosificación de la composición de enzima de la invención y otras condiciones bajo las cuales se usa la composición podrían determinarse en base de los métodos conocidos en el arte.

La composición de enzima de acuerdo a la invención podría ser útil para al menos uno de los siguientes fines .

Usos En la industria textil las celulasas se usan para tratamiento de algodón y otros materiales celulósicos para obtener un tratamiento superficial de las fibras que resultan en tejidos con propiedades alteradas tal como tendencia a pelado reducida, remoción de pelusa, suavizador de tejido, mejores efectos de manejo o visuales. Especialmente las celulasas se usan para producir una apariencia de "lavado de piedra" de la mezclilla. El uso de celulasas a altas temperaturas hace posible crear nuevas apariencias de me?clilla y que no son mezclilla de algodón/fibras celulósicas. Las celulasas termoestables pueden incluirse en tratamientos a altas temperaturas de tejidos que no han sido posibles antes, la celulasa se lava arriba de 80°C o bajo condiciones de vapor con relación de licor muy baja es posible que dé el potencial de crear nuevas apariencias .

El uso de celulasas termoestables en procesos industrialmente de limpieza hace posible obtener un proceso de limpieza mas fácil cuando el material indeseable que se va remover se basa en la materia celulósica. Ejemplos son limpieza de membranas de ultra filtración, tubos y similares en la comida/alimento.

La incorporación de celulasa termoestable en materiales de plástico y polímero extruidos en caliente con relleno de celulosa, resultará en degradabilidad mas alta de estos materiales en la naturaleza.

Los materiales lignocelulósicos forman una gran parte de desechos agrícolas y forestales y en papel que es muy dominante en residuos municipales. Este residuo se quema típicamente, el cual desde un punto de vista de energía es un desecho enorme de recursos. Mucho trabajo se ha asignado a la tarea de desarrollar un proceso efectivo y económico para la conversión de esta biomasa a azúcares que pueden fermentarse para producir p. ej . alcohol para usar como combustible. Los procesos propuestos para la conversión de lignocelulósicos a azúcares incluyen el uso de celulasas pero se necesitan dosificaciones muy altas que los hacen ellos irreales en gran escala industrial desde un punto de vista económico. El uso de celulasas termoestables con propiedades de licuefacción hace tal proceso de bioconversión mas realista. El procesamiento a alta temperatura abre la estructura de la pared celular en muchos materiales de planta y hace a la celulosa mas accesible para el ataque de la enzima.

En la producción industrial de alcohol de diferentes clases de granos, el proceso tradicional incluye la licuefacción con alfa amilasa a temperaturas alrededor de 80-100°C. La inclusión de celulasa en este paso aumentará la producción de azucares fermentables . Esta prelicuefacción de celulosa también hará la inclusión de celulasas tradicionales en el siguiente proceso realista, debido a una velocidad de hidrólisis mas alta que sin prelicuefacción.

La predigestión de granos; centeno, cebada, maíz, etc para producción de alimentos es otro uso potencial de celulasa termoestable, esto para incrementar la digestibilidad del alimento en el animal.

La extracción de café para la producción * de café instantáneo se lleva a cabo a temperaturas de 85-150°C en una batería de columnas de percolación. El agua pasa a contracorriente de la mayoría de células extraídas hacia una llenada justo con café fresco. La temperatura de operación para las células con el café fresco es aprox. 100°C. La inclusión de celulosas de termófilas en este punto incrementará la capacidad de las columnas dado que la materia soluble se libera mas fácil cuando se abre la estructura de la pared celular.

La inclusión de celulasas en otros procesos tradicionales de alta temperatura para la extracción de aceite o compuestos de aroma/sabor de fuentes vegetales naturales en la misma forma como para la extracción incrementará la capacidad o rendimiento. Un ejemplo es la extracción de aceite de palma o aceite de semilla de palma que es un proceso acuoso a temperatura alta.

MATERIALES Y MÉTODOS Organismos depositados : Di ctyogl omus sp . DSM 6262, comprende la celulasa que codifica la secuencia de ADN de la invención.

Escheri chia coli DSM 11201 que contiene el plásmido que comprende la secuencia de ADN que codifica la enzima celulolítica de la invención, en el vector de clonación pSJ1678.

Otras cepas : Cepa E: coli : Células de E . coli SJ2 (Diderichsen, B., Wested, U., Hedegaard, L., Tensen, B.R., Sj0holm, C. (1990) La clonación de aldB, que codifica alfa-acetolactato descarboxilasa, una exoenzima de Ba ci l l us brevi s . J. Bacteriol., 172, 4315-4321), se prepararon de y se transformaron por electroporación usando un electroporador Gene Pulser™ de BIO-RAD como se describe por el suministrar.

Plásmido: pSJ1678 como se expone en la solicitud internacional publicada como WO 94/19454 que se incorpora aquí por referencia.

Métodos de biología molecular general : Las manipulaciones y transformaciones de ADN se realizaron usando métodos estándares de bilogía molecular (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, F.M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology" . John Wiley and Sons, 1995; Harwood, C.R., y Cutting, S.M. (eds.) "Molecular Biological Methods for Bacillus" . John Wiley and Sons, 1990) .

Las enzimas para manipulaciones de ADN se usaron de acuerdo a las especificaciones de los suministradores.

Aislamiento de la secuencia de ADN que codifica la enzima celulítica de la invención: La secuencia ADN que codifica la endoglucanasa de la invención, puede obtenerse del organismo depositado E . coll , DSM 11201, por extracción del ADN del plásmido por métodos conocidos en el arte (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) .

Clonación del gen de endoglucanasa Preparación de ADN genómico La cepa Di ctyogl omus sp., DSM 6262, se propagó en un matraz de vidrio de 1 1 durante dos días a 70°C en el medio como se describe después.

Composición del medio anaeróbico estricto para la cepa DSM 6262: 1.0 g de NH, Cl, 0.1 g de NaCl, O.lg de MgCl2 0.05g de CaCl2, 0.4g de K2HP04-3H20, 0.75 g de extracto de levadura, 4.0 g de xilana de haya (Lenzing), 0.5 mg de Resazurina, 1.0 ml de metales* traza 1.0 ml de solución de vitamina, 3.0 g de NaHC03, H20 hasta 1 1.

* Solución de metal traza: 2.0 g de FeCl2-4H20, 0.05 g de ZnCl2, 0.05 g de MnCl2, 0.05 g de A1C13, 0.05 g de NiCl2, 0.1 g de Na2Se03-5H20, 0.05 g de H3B03, 0.03 g de CuCl2, 0.5 g de (NH4) 6Mo7024-4H20, 0.05 g de CoCl2-6H20, 0.5 g de EDTA, 1.0 ml de HCl Conc., H20 hasta 1 1.

Nivelar y distribuir 10 ml por botella bajo N2/C02 (4:1) . Tapar con tapones de hule impermeables a 02 y poner en autoclave a 140°C durante 20 min. Adicionar 0.1 ml de solución de vitamina DSM #141 de la solución anaeróbica esterilizada con filtro y 0.2 ml de 2.5 g/1 de Na2S-9H20 de solución de reserva sometida a autoclave justo antes de la inoculación con técnica de jeringa anaeróbica estéril.

Las células se cosecharon, y se aisló el ADN genómíco ADN por el método descrito por Pitcher et al. (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J.(1989) Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol. 8:151-156) .

Construcción de la biblioteca genómica El ADN genómico se digirió parcialmente con la enzima de restricción 5ua3A, y se fraccionó el tamaño por electroforesis en un gel de agarosa al 0.7%. Los fragmentos entre 2 y 7 kb de tamaño se aislaron por electroforesis en papel DEAE-celulosa (Dretzen, G., Bellard, M., Sassone-Corsi, P., Chambón, P. (1981). A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acrylamide gels. Anal. Biochem., 112, 295-298) .

Los fragmentos de ADN aislados se ligaron al ADN del plásmido pSJ1678 digerido con BamEI , y la mezcla de ligación se usó para transformar E . col i SJ2.

Las células se colocaron en placa de agar LB que contenía 0.1% de CMC ( Carboxi-Metil-Celulosa de Sodio, Aqualon, Francia) y 9 µg/ml de Cloranfenicol para dar 500-1000 c.f.u. /placa y se incubaron durante toda la noche a 37°C.

Identificación de clones positivos por actividad : Después de la incubación las colonias se colocaron en placa por replica en un conjunto de placas de agar LB+CAM y después se incubaron mas a 37°C durante aprox. 20 horas. Una capa que contenía 0.1% de CMC, 1 % de agarosa HSB, en un amortiguador pH 7 apropiado se vertió en las placas de replica y se incubó durante aprox. 20 horas a 65°C. Las colonias positivas a endoglucanasa se identificaron tiñendo con 0.1% de solución acuosa de Rojo Congo (SIGMA, USA) seguido por lavado en NaCl 2 M. Aparecieron halos amarillos en posiciones donde se presentaron los clones positivos endoglucanasa .

Las células de las colonias positivas a la enzima se esparcieron para el aislamiento de colonia simple en agar, y una colonia simple que produjo la enfima se seleccionó para cada una de las colonias identificadas que produjeron la endoglucanasa.

Caracterización de clones positivos: De las placas reestriadas los clones positivos a endoglucanasa se obtuvieron como colonias simples, y se extrajeron los plásmidos. Los fenotipos se confirmaron por retransformación de E . coli SJ2, y los plásmidos caracterizaron por digestión con restricción.

Medio Agar TY y LB (como se describe en Ausubel, F.M. et al., (eds.) "Current Protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995) .

Condiciones de Hibridación (para usarse en la evaluación de la propiedad ii) de la construcción de ADN de la invención) : Condiciones adecuadas para determinar la hibridación entre una sonda de nucleótido y una secuencia de ADN o ARN homologa involucra el premojado del filtro que contiene los fragmentos de ADN o ARN para hibridizar en 5 x SSC (citrato salino estándar) durante 10 min, y la prehibridización del filtro en una solución de 5 x SSC (Sambrook et al. 1989), 5 x solución de Denhart (Sambrook et al. 1989), 0.5% de SDS y 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado desnaturalizado (Sambrook et a'_ . 1989), seguido por hibridización en la misma solución que contiene un cebador aleatorio (Feinberg, A.P. y Vogelstein, B. (1989) Anal . Bi ochem . 132: —13), sonda 32P-dCTP-marcado (actividad especifica > 1 x 109 cpm/µg) durante 12 horas a ca, 45°C. El filtro se lava después dos veces durante 30 minutos en 2 x SSC, 0.5 % de SDS a preferentemente no mayor de 55°C, mas preferentemente no mayor de 60°C, mas preferentemente no mayor de 65°C, aún mas preferentemente no mayor de 70°C, especialmente no mayor de 75°C.

La sonda de nucleótido que se va a usar en la hibridación es la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido presente en Escheri chia coli DSM 11201.

Reactividad cruzada inmunológica Los anticuerpos que se van a usar para determinar la reactividad cruzada inmunológica podrían prepararse mediante el uso de una endoglucanasa purificada. Mas específicamente, antisuero contra la endoglucanasa de la invención podría aumentarse inmunizando conejos (u otros roedores) de acuerdo al procedimiento descrito por N. Axelsen e_£_ a_l. en: A Manual of Ouantitative Immunoe lectrophoresis , Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o A. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistrv in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982, (mas específicamente pp . 27-31). Las inmunoglobulinas purificadas podrían obtenerse del antisuero, por ejemplo por precipitación con sal (( NH4)2S04), seguido por diálisis y cromatografía de intercambio iónico, p. ej . en DEAE-Sefadex. La caracterización inmunoquímica de proteínas podría hacerse por análisis de doble difusión de Outcherlony (O. Ouchterlony en: Handbook of Experimental Immunolosy (D.M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publications, 1967, pp . 655-706), por inmunoelectroforesis cruzada (N. Axelsen e_t. al . , supra , Capítulos 3 y 4), o por inmunoelectroforesis de cohete (N. Axelsen e_L. a_l. , Capítulo 2).

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran la invención .

EJEMPLO 1 Clonación y expresión de una endoglucanasa de Di ctyogl omus sp . DSM 6262 Una biblioteca de Di ctyogl omus sp., DSM 6262, se construyó en E . coli y se cribó como se describe en Materiales y Métodos. Una transformante, positiva aislada fue DSM 11201 que contenía el plásmido pSJl678 que comprendía la secuencia de ADN que codifica la enzima celulolítica de la invención .

El clon de E . coli aislado se probó simultáneamente en placas de agar LB+CAM que contenían 0.1% de AZCL beta-glucan, AZCL xiloglucan, AZCL HE celulosa, AZ.CL xilan, AZCL curdlan o galacto anan . Las placas se incubaron durante aprox. 48 horas a 37°C seguido por incubación a 65°C. La actividad de la enzima se identificó por halos azules que rodearon las colonias. El clon se encontró positivo en AZCL beta-glucan, AZCL xiloglucan, AZCL HE celulosa.

Preparación de solución de enzima del clon de E . coli DSM 11201 DSM 11201 se inoculó como un precultivo en un matraz agitado que contenía 200 ml de medio de caldo Super con la siguiente composición (por litro) : Triptona 32 g, extracto de levadura 20 g, NaCl 5g, CMC 5 g, pH 7.2-7.3 ajustado con NaOH 1 M. Se sometió a autoclave a 121°C, 20 minutos. Después de la esterilización se adicionó cloranfenicol hasta una concentración final de 6 mg/ml.

El matraz agitado se incubó en un agitador giratorio a 280 rpm, 37°C, durante 16 horas. 1 ml del cultivo se inoculó a 100 matraces agitados con 200 ml de medio de caldo Super y se incubó a 37°C, 280 rpm de 16 a 18 horas. Centrifugación a 3000 rpm de los 20 litros de cultivo de E . coli , resuspensión del paquete en 800 ml de amortiguador Tris-maleato 50 mM, pH 7.0. Las células se rompieron a 800 bar con un Homogeneizador de Laboratorio de Alta Presión Rannie. Centrifugación durante 1 hora, 10.000 rpm y colección del sobrenadante claro.

EJEMPLO 2 Purificación y caracterización de la endoglucanasa clonada de Di ctyogl omus sp . DSM 6262 600 ml de extracto celular de E . coli se trató primero con calor a 70°C durante 5 min seguido por centrifugación a 5000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se filtró a través de filtro Whatman D y se obtuvieron 200 ml totales con una actividad de 11 CMCU por ml (determinación de CMCU, ver después).

La solución se pasó en una columna S-Sefarosa equilibrada con un amortiguador de acetato de sodio 0.05 M. La endoglucanasa enlazada se eluyó con cloruro de sodio 0.5 M y un volumen total de 300 ml se obtuvo con 2 CMCU/ml . Esta solución se ajustó a pH 9.0 y se equilibró con amortiguador de etanolamina 20 mM pH 9.0 y una celda de ultrafiltración Amicon con una membrana con un corte de 10 kD. Después, cuando la conductividad es de alrededor de 250 micro S/cm la solución se aplica a una columna de Q-Sefarosa equilibrada con el mismo amortiguador. La endoglucanasa se enlazara y puede eluirse usando un gradiente de cloruro de sodio. Debido a conductividad muy alta en el primer ensayo se obtiene solo 2 ml con 65 CMCU/ml. • * Finalmente, la solución se concentró y se aplicó a una columna de tamaño Superdex 200 en acetato de sodio 0.1 M pH 6.0 y la endoglucanasa pura se eluyó en un volumen de 22 ml que se concentró usando una celda de ultrafiltración Amicon con una membrana con un corte de 6 kD. Se obtuvo 1 ml con 40 CMCU por ml . Esta muestra mostró una sola banda en SDS-PAGE con un PM de 30 kD y un pl de 6.5. La proteína se electromanchó y se aplicó para secuenciación N-terminal usando un secuenciador Applied Biosystems modelo 473A. El secuenciador de proteína se corrió de acuerdo a las instrucciones del fabricante y se obtuvo la siguiente secuencia: QTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKNLPLTLELNFFNIAAY- La endoglucanasa pura tiene actividad en p-Nitrofenil-beta-D-celobiosida (Sigma), CMC, HE celulosa (Megazyme) y celulosa dilatada acida.

Una unidad de CMCU se define como la cantidad de enzima que libera el equivalente a 1 mmol de glucosa por min bajo condiciones estándar.

Condiciones estándar: prueba de CMC a 70°C La enzima se incubó durante 20 min. en una solución al 0.75% de CMC (7L de Hercules) en un amortiguador de barbiturato de sodio 0.1 M pH 8.5. Después de la incubación el aumento en los grupos terminales reductores se determinó usai.do PHBAH (SIGMA H-988253H7704 (HIDRAZIDA DE ÁCIDO p-HIDROXI BENZOICO ) y con un estándar de glucosa se calculó la formación de grupos terminales equivalentes de glucosa por min (Lever, M. (1972) A new reaction for colometric determination of carbohydrates . Anal. Biochem. Vol 47, página 273-279) La endoglucanasa mostró 137 CMCU/mg og proteína a 70°C y pH 8.5 (50 CMCU por A280) .

Perfil de actividad de temperatura de la endoslucanasa La endoglucanasa se incubó en la prueba de CMCU a pH 8.5 a diferentes temperaturas y la actividad después de 20 min. de incubación se determinó como se describe antes. No se desarrollaron las incubaciones arriba de 90DC. La cantidad de azúcar reductora obtenida a esta temperatura fue la mas alta y se usó para el cálculo de la actividad relativa a temperaturas mas bajas. emp . Actividad Reí 90°C 100% 80°C 76% 70°C 40% 60sC 26% 50°C 14% 40°C 7% Perfil de la actividad de pH La endoglucanasa se incubó en la prueba de CMCU a 70°C usando diferentes amortiguadores en el intervalo de pH de 4.5 a 11 y la actividad después de 20 min. de incubación se determinó como se describe antes.

Amortiguadores: pH 4.5, 5.0 y 5.5; acetato de Na 0.1 M pH 6.0; Na-MES 0.1 M pH 6.5, 7.0 y 7.5; Na-MOPS 0.1 M pH 8.0 y 8.5; EPPS 0.1 M pH 9.0, 9.5, 10.0, 10.5 y 11.0; Na- glicina 0.1 M Mas de 50% de actividad relativa se obtuvo en el intervalo de pH 5.5 a 11.

Prueba de p-Nitrofenil-beta-D-celobiosida Una unidad PNPU se define como la cantidad de enzima que libera un mmol de p-Nitrofenol por minuto de p-Nitrofenil-beta-D-celobiosida (Sigma) bajo condiciones estándar.

Método: La cinética de estado estable, detección directa del producto p-nitrofenol, da un color amarillo, que se detecta a 405 nm. La actividad se mide como el aumento de absorbancia, la parte lineal de la curva se usa para determinar la pendiente (AU/seg). La actividad se calcula usando una absorbancia de p-Nitrofenol en amortiguador de fosfato pH 7.5: Absorb.ancia en una probeta de 1 cm, lmM de 0.018 a 405 nm (0.014 a 420 nm).

Condiciones de prueba: 475 ml de p-NP-beta-D-celobiosida 10 mM en amortiguador de fosfato de Na, pH 7.5 25 ml solución de enzima Procedimiento : La medición se hace en Espectrofotómetro de Arreglo de Diodo HP 8452A controlado termostáticamente a 70°C en una probeta de 0.75 ml, ancho de 1 cm.

La absorbancia a 405 nm se mide en 300 seg con una medición cada 20 seg.

El endoglucanasa mostró 170 PNPU por A280 a 70°C y pH 7.5 Celulosa dilatada acida La solución de reserva PASC se preparó de la siguiente forma usando acetona enfriada en hielo y ácido fosfórico. 5 gramos de celulosa (Avicel®) se humedeció con agua, y se usaron 150 ml de ácido orto-fosfórico al 85% enfriado en hielo. La mezcla se colocó en baño de hielo bajo agitación lenta durante 1 hr. Después 100 ml de acetona enfriada en hielo se agregaron con agitación. La suspensión se transfirió a un filtro Buchner con disco sinterizado pyrex número 3 y después se lavó tres veces con 100 ml de acetona enfriada en hielo, y se absorbió tan seco como fue posible después de cada lavado. Finalmente, la torta del filtro se lavó un par de veces con 500 ml de agua, se succionó para secar tanto como fue posible después de cada lavado. El PASC se mezcló con agua desionizada para un volumen total de 300 ml, se mezcló a homogeneidad (usando el Homogeneizador Ultra Turrax) y se almacenó en el refrigerador (hasta un mes) .

Equilibración de sustrato con amortiguador: 20 gramos de solución de reserva de PASC de celulosa dilatada con ácido fosfórico se centrifugó durante 20 min a 5000 rpm., se vertió el sobrenadante; el sedimento se resuspendió en 30 ml de amortiguador y se centrifugó durante 20 min. a 5000 rpm., el sobrenadante se vertió, y el sedimento se resuspendió en amortiguador para un total de 60 g que correspondió a una concentración de sustrato de 5 g de celulosa/litro.

Amortiguador para la determinación de pH 8.5: Barbital 0.1 M.

Procedimiento 1. Dilución de muestras de enzima * * La solución de enzima se diluye en el mismo amortiguador como el sustrato. 2. Reacción de la enzima El sustrato en la solución de amortiguador se precalentó durante 5 min. a 80°C (2 ml ) .

Después la solución de enzima (diluida) 0.5 ml se adiciona y se mezcla durante 5 seg. Los blancos de enzima se obtienen adicionando el reactivo de paro antes de la solución de enzima. Se incuba durante 20 min. a 80°C. La reacción se para adicionando 0.5.ml de solución de NaOH al 2% y mezclando durante 5 seg.

Las muestras se centrifugan durante 20 min. a 5000 rpm. 1 ml de sobrenadante se mezcla con 0.5 ml de reactivo PHBAH y se hierve durante 10 min. Los tubos de ensaye se enfrían en un baño de agua fría . 3. Determinación de grupos terminales reductores La absorbancia a 410 nm se mide usando un espectrofotómetro . Una curva de glucosa estándar se obtuvo usando concentraciones de glucosa de 5, 10, 15 y 25 mg/l en el mismo amortiguador y adicionando reactivo PHBAH antes de hervir. La liberación de equivalente de glucosa reductora se calculó usando esta curva estándar.

Determinación de kcat y Kp La actividad catalítica en celulosa dilatada con ácido se determinó usando la prueba como se describió antes bajo condiciones estándar a pH 8.5 y 80°C con diferentes concentraciones de sustrato. Las constantes cinéticas se calcularon usando el programa de computación Grafit para la cinética de Michaélis-Menten. Basado en la composición de aminoácido de la endoglucanasa se determinó el coeficiente de extinción molar que es de 85630. Por lo tanto, se obtuvieron los siguientes resultados: Km = 2.5 gramos de celulosa dilatada con ácido por litro EJEMPLO 3 Expresión de una endoglucanasa termoestable en Ba ci l l us subtilis La cepa de Ba cill us subtili s descrita después, que alberga el plásmido de expresión que codifica la endoglucanasa termoestable clonada de Di ctyogl omus sp . DSM 6262, se depositó por los inventores de acuerdo al Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional de Microorganismos para los Fines de Procedimiento de Patente en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania, el 16 de Diciembre de 1997 bajo el número de depósito DSM 11903.

Materiales Cepas E . coli SJ2 (Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sj0holm, C. (1990) Cloning of aldB, which encodes alpha-acet olact a t e decarboxylase, an exoenzyme from Ba cill us brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321) . Las células electrocompetentes se prepararon y transformaron usan do un Bio-Rad Genepulser™ como se recomienda por el fabricante .

B . subtilis A164. Esta cepa es un derivado de la B. subtilis ATCC 6051a, que es deficiente en la esporulación y que ha tenido los genes apr y npr rotos. Las roturas se realizaron esencialmente como se describe en (Eds. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch and Richard Losick (1993) Ba cill us subtilis and other Gram-Positive Bacteria, American Society for microbiology, p. 618) . Las células competentes se prepararon y se transformaron como describe por Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Ba cill us subtil i s : evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121:296-304.

Plásmidos pUBllO:. Plásmido descrito en (McKenzie, T., Hoshino, T, . Tanaka, T. and Sueoka, N. The nucleotide sequence of pUBllO: some salient features in relation to replication and its regulation Plasmid 15 (2), 93-103 (1986)) y (Mckenzie, T., Hoshino, T., Tanaka, T. and Sueoka, N. Correction. A revisión of the nucleotide sequence and functional map of pUBllO Plasmid 17 (1), 83-85 (1987) ) . pMUTIN-4-MCS : El plásmido puede obtenerse en el Laboratoire de Genetique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en Josas -CEDEX, Francia.

Medio Agar LB (como se describe en Ausubel, F. M. et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995) .

LBPG es agar LB suplementado con 0.5% de Glucosa y fosfato de potasio 0.05 M, pH 7.0.

Celulosa AZCL-HE se adiciona al agar LBPG al 1 %. La celulosa AZCL-HE es de Megazyme, Australia.

Medio BPX se describe en la solicitud internacional publicada como WO 91/09129.

Métodos : El plásmido se construyó y el clon se estableció esencialmente como sigue: El pMUTIN4MCS es un plásmido de E . coli que tiene un promotor híbrido SPAC (Yansura et al. (1984) Use of E . coli lac repressor and operator to control gene expression in Ba ci ll us subtili s , PNAS, Vol81, pp . 439-443) y un gen lacZ bajo control transcripcional de este promotor. Además el plásmido contiene el gen lacl bajo control de un Promotor penP de Ba cíll us spe . Así cuando en B . subti l i s el lacl se expresará y enlazará al operador del promotor SPAC-operador y esto inhibirá la transcripción de la secuencia corriente ' abajo. El promotor es el mismo como en Yansura et al., sin embargo el operador se modificó en un palíndroma perfecto. Un sitio HindIII justo corriente abajo de la región Promotor-operador hizo posible romper el gen lacZ por inserción de otro gen, es decir el gen endoglucanasa de esta invención. De este modo saliendo la expresión de endoglucanasa bajo el control del promotor SPAC-Operador .

En el plásmido pMUTIN4MCS de E . col i un sitio que enlaza ribosoma (RBS) y un péptido señal con un sitio SacII para fines de clonación, se clonaron como un fragmento HindII-SacI. Estableciendo de este modo el siguiente sitio que enlaza ribosoma y péptido señal que codifica la secuencia de ADN: HindIII RBS • * 5 * -AAGCTTGTTACACATTGAAAGGGGAGGAGAATC?TGAAAC?ACA???? GG CTTTACGCCCGA TTGCTGACGCTGTTATTTGCGCTCATCTTCTTGCTGCCTCA Not l S ac l TTCTGCAGCCG CGGCA GCGGCCGC GAGCTC- 3 ' Escrito en itálica es la secuencia de ADN que codifica un péptido señal de Ba cill us sp . que cuando se fusionó a otra secuencia ADN que codifica la parte madura de una proteína dirigirá esto al exterior de una célula de Ba cill us sp .

La secuencia anterior codifica el sitio HindIII de pMUTIN4MCS seguido directamente por un RBS de Ba ci ll us subtil i s y una secuencia de ADN que codifica un péptido señal de Ba ci l l us spe . que terminando con un sitio SacII introducido artificialmente que es seguido por un sitio Notl y uno de restricción SacII. El plásmido se estableció en E . coli SJ2 por electroporación y colocando en placas de agar LB con 100 µg/ml de ampicilina e incubando las células durante la noche a 37°C. El plásmido resultante se denominó pMUTIN4-Señal SacII-Notl.

El gen endoglucanasa termostable se clonó como un fragmento PCR digerido con SacII-Eagl .

El fragmento PCR se obtuvo usando el estuche HiFi Expand PCR de Boehringer Mannheim y la reacción se desarrolló como se recomienda por el fabricante. El fragmento de ADN se amplificó del plásmido pDSM11201. El gen endoglucanasa termostable- se clonó originalmente de Di ctyogl omus spe . DSM6262 y se depositó como un clon de E . coli (DSM 11201) que aloja un plásmido con el gen endoglucanasa. Los dos cebadoras PCR se usaron como sigue : #30519 5 ' -CATTCTGCAGCCGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGC-3 * #30637 5 ' -CATGACACGGCCGATTATTTAAGCTCAATATCAAAATTTGAG-3 ' El fragmento PCR y el ?MUTIN4-Señal Sacll-Notl se digirió con SacII-Eagl, se ligaron juntos y se usaron para transformar E. coli SJ2 por electroporación y colocando en placas de agar LB con 100 µg/ml de ampicilina e incubando las células durante la noche a 37°C. El plásmido resultante en SJ2 se denominó pMB447A.

Después de haber clonado el gen endoglucanasa en fusión con el péptido señal anterior (en el sitio SacII-Not/Eagl) el siguiente marco de lectura abierto resultó bajo el control transcripcional del promotor SPAC-operador: ATGAAACAACAAAAACGGCTTTACGCCCGATTGCTGACGCTGTTATTTGCGC TCATCTTCTTGCTGCCTCATTCTGCAGC CGCGGCACAAACTCCAAAATACAAAGACGCATTTATACTTAAAGCACCTTCC TCAGGCGATGTCACAACTAAAAATCTTC CTCTCACCTTAGAACTCAACTTTTGGAATATTGCAAACTATGAAGGAAATAC ATGGATGGCATTTTATAAAGAAGAAGAT ACTGTTGAATATTATGCCGACATAAAAAACATAGTACTTAAGGATAAAAATT CATGGGTACATGGATATCCTGAAGTCTA CTATGGGTACAAACCATGGGCTGGCCATGGGAATTCCATTGAGAAATTAGCT CTTCCTAAAAAGGTATCAGAATTTCCAG ACGTTCTCTTCAATCTAAAATACAACATATGGTACGAGAAGAATCTTCCTAT AAATTTTGCTATGGAAACATGGATAACA AAAGAACCCTATCAGAAAACCGTTACTTCAGGGGATATAGAGATGATGGTAT GGCTATATGCTAATAGACTTTCTCCTGC AGGGCGAAAGGTAGGAGAAGTAAAAATACCTATCATCCTAAACGGTAATCAA AAAGACATTATCTGGGAAGTATATCTTT CCCCTATGAGCTGGGACTACGTGGCCTATAAATCAAAAGAAAATATTCTTCA AGGAC GGT AAAATACCAATAAATGAA TTTTTGAAACACCTAAGAACAATTTTAGCCAACAATCCAAGTAGAATAACCC CAGAGAAAT GATCAGATGT TGTGAC AGTCTGGGAAATTGGAACAGAATTTGGCGATCCATATACTACTGAGGCAAAA TTTGGATGGACTTTCTCAAATTTTGATA TTGAGC AAATAA y la proteína derivada MKQQKRLYARLLTLLFALIFLLPHSAAAAQTPKYKDAFILKAPSSGDVTTKN LPLTLELNFWNIANYEGGTWMAFYKEED TVEYYADIKNIVLKDKNSWVHGYPEVYYGYKPWAGHGNSIEKLALPKKVSEF PDVLFNLKYNIWYPKNLPINFAMETWIT KEPYQKTVTSGDIEMMVWLYANRLSPAGRKVGEVKIPIILNGNQKDIIWEVY LSPMSWDYVAYKSKENILQGQVKIPINE FLKHLRTILANNPSRITPEKFDQMYVTVWEITTEFGDPYTTEAKFGWWTFSN FDIELK.

Para permitir propagar el pMB447A en Bacillus subtilis el plásmido de E . coli se fusionó a un derivado de pUBllO (un plásmido propagable en B. subtilis): En el sitio Ncil de pUBllO un sitio Sacl y Notl se introdujeron usando un polienlazador la inserción resultante tuvo la siguiente secuencia: CCCGGGAGCTCGCGGCCGCCCCGG Los dos sitios Ncil están subrayados entre estos están los sitios Sacl y Eagl (Notl) .

Este plásmido se digirió entonces con Sacl y Eagl y se ligó a pMB447A digerido con Sacl Eagl, la ligación se uso para transformar Bacillus subtilis A164. Los clones se establecieron y cosecharon durante la noche en placas LBPG-10 Kana celulosa AZCL-HE. Al siguiente día estas placas se incubaron a 70°C durante 5 horas y la aparición de halos azules indicaron la expresión positiva de endoglucanasa termostable.

Cuando se analizó el ADN del plásmido aislado del clon MB505 (DSM 11903) fue evidente que el plásmido tuvo que padecer la recombinación y el plásmido resultante fue mas pequeño que el tamaño del plásmido esperado de 12.5 kb . De este modo pareció que el plásmido tuvo mas pérdida del plásmido pMUTIN 4 Señal SacII-Notl de E . coli , resultando en un plásmido de tamaño aproximado de 5.5 kb .

El plásmido resultante tuvo las siguientes características esenciales: La endoglucanasa codificada en el plásmido de DSM 11903 se expresó positivamente sin tener que adicionar IPTG y el plásmido confirió resistencia a 10 µg/ml de Canamicina .

El MB505 se cultivó 5 días en matraces agitados de 50Q ml con dos placas y 100 ml de medio BPX a 37°C a 300 rpm.

Purificación v caracterización Se recibió en matraces agitados de 5000 ml fluido de cultivo de Bacillus con el clon MB 505, y el fluido de cultivo se trató en caliente calentándolo a 70°C y se conservó a esta temperatura durante 5 min bajo agitación. Después se enfrío y se centrifugó a 9000 rpm durante 20 min. Se obtuvieron 4000 ml de sobrenadante claro que contenía 2.4 CMCU por ml .

El CMCU se determinó a 70°C y pH 8.5. 6000 CMCU se aplicaron a 3000 ml de DEAE A-50 Sefadex equilibrados en amortiguador Mes 50 M pH 6.2. El material sin enlazar contenido total 5700 CMCU.

El material sin enlazar se aplicó a una columna Q-Sefarosa de 1000 ml equilibrada con amortiguador de etanolamina 20 mM pH 9.5. La enzima enlazada s& eluyó usando un gradiente de NaCl.

El producto purificado parcialmente se concentró usando una celda de ultrafiltración amicon con una membrana con un valor de corte de 6 kDa.

La fracción concentrada se formuló con 40% de no-nopropilenglicol .

Se obtuvo un total de 250 ml con una concentración de 9.7 CMCU por ml (2425 CMCU en total) y se usó para pruebas de aplicación.

Métodos Inmunológicos : Se usó celulasa altamente purificada de Di ctyogl omus (del ejemplo 2) para la producción de antisuero .

Se condujo el procedimiento de inmunización en DAKO usando conejos. Cada conejo se inmunizó con 100 µl de celulasa (0.4 g de proteína por ml) se mezcló con 100 µl de adyuvante. Cada conejo se inmunizó 15 veces con intervalos de una semana. El suero de conejo se colectó y la gamaglobulina se purificó del suero.

Las placas de Mancini, por ejemplo 25 ml de gel de agarosa al 1% (15*10 cm) , con 50 µl de gamaglobulina (A280 = 106.5) y con pozo de 4 mm en el que la muestra de 10 µl se aplicó y se incubó durante 1 día a temperatura ambiente en una cámara húmeda.

La placa se lavó en agua de NaCl 0.95 durante varias veces y se tiñó con azul de coomassei siguiendo el procedimiento estándar.

Se obtuvieron los siguientes diámetros de la celulasa de Di ctyogl omus altamente purificada o el formulado de MB505 parcialmente purificado, respectivamente : Celulasa de Dí ct?osl omus altamente purificada: 40 CMCU dio 11.5 mm de diámetro. 20 CMCU dio 9.5 mm de diámetro. 10 CMCU dio 7 mm de diámetro MB505 formulado: 10 CMCU 8 mm de diámetro.

Otra familia de 12 celulasas (p. ej . del género fúngico Tri choderma ,* Humi col a , Aspergi ll us ) no formaron inmuno-precipitado bajo estas condiciones.

EJEMPLO 4 Bioabrillantado de Celulasa de Di ctyogl omus a 90°C Experimental Materiales y equipo Aparatos: Mathis Pad-steam Range, Tipo: PSA-HTF Tejido: Tejido de algodón unido a dispositivo de blanqueado (Test fabrics Inc.): N.O. blanco, algodón 100%, estilo 460. El tejido se cortó en piezas de un tamaño de 20x30 cm (aprox. 12.5 g cada uno) .

Enzima: Dictyoglomus, lote MB505, 9.7 CMC U/ml Amortiguador: amortiguador de fosfato 15 mM pH 6.0 amortiguador de fosfato 15 mM pH 8.1 Procedimiento de relleno: Las muestras de tejido se acondicionaron en un AATCC estándar (American Association of Textile Chemists and Colourists) clima ambiente (humedad relativa de 65+2% y temperatura de 70+3°F) durante al menos 24 horas. Se obtuvo su peso.

Las soluciones de enzima se hicieron de enzima mezclada con amortiguador. El pH se ajustó y la actividad de la enzima en las soluciones se mostraron en la Tabla 1 de abajo. Los muestras de tejido se sumergieron en soluciones de enzima durante al menos 45 segundos y después se rellenaron. Después del relleno, las muestras de tejido se pesaron y colgaron en el vaporizador Mathis inmediatamente. El porcentaje de solución en el tejido mostró como absorción de humedad de las muestras de tejido también se presentó en la Tabla 1: Tabla 1 Bioabrillantado en Vaporizador: Las muestras de tejido se trataron en vaporizador a las siguientes condiciones: Temperatura: 90°C Tiempo: 90 min Humedad Relativa: 100% Todas las muestras de tejido se transfieren y se enjuagaron en agua desionizada durante al menos 5 minutos. Se secaron al aire y después se acondicionaron en el AATCC clima ambiente durante 24 horas antes de la evaluación .

Evaluación Pérdida de Resistencia: se midió la resistencia del tejido en el probador Mullen Burst modelo C de acuerdo a ASTM D3786 - 87. Los resultados son promedios de al menos 8 mediciones.

Observación de pelado: Se midió de acuerdo a ASTM D 4970 -89 usando un Probador Matindale Pilling a 500 revoluciones. El pelado en el tejido se evaluó visualmente de escala 1 a 5, en donde 1 es pelado muy severo y 5 es sin pelado. Los resultados son promedio de al menos 2 mediciones .

Resultados y Conclusiones Los resultados se resumen abajo en los resultados se muestran en la Tabla 2 y 3. 1. Como aumentos de la concentración de la enzima, el pelado observa aumentos (en la tabla 3), 2. La celulasa de Dictyoglomus da mejor observación de pelado a pH 8.1 que a pH 6.0 (Tabla 3), 3. En las presentes condiciones, el Bioabrillantado da poca pérdida de resistencia al tejido a pH 6 . 0 (menos de 5%), pero no se detectó pérdida de resistencia a pH 8.1.

Puede concluirse que el bioabrillantado de tejido de algodón con celulasa de Dictyoglomus mejora significativamente la resistencia al pelado del tejido en las condiciones de este estudio. En las condiciones preferidas tal como pH de aproximadamente 8, la buena resistencia al pelado se obtuvo sin pérdida de resistencia detectable.

Tabla 2 Tabla 3 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos a que la misma se refiere .

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

LISTADO DE SECUENCIAS FORMACIONES GENERALES: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Novo Nordisk A/S (B) CALLE: Novo Alie (C) CIUDAD: Bagsvaerd (E) PAÍS: Dinamarca (F) CÓDIGO POSTAL: (ZIP) : DK-2880 (G) TELÉFONO: 45 4444 8888 (H) TELEFAX: 45 4449 3256 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Una Nueva Endoglucanasa ;iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) FORMA DE LECTURA DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Floppy disk (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS-DOS (D) PAQUETERÍA: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 867 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1: ATGAAAAAAT CTTTACTTTC TCTTATCCTC ATACTTCTTC TTATTACTCT CTCCTTCAGT 60 CAAACTCCAA AATACAAAGA CGCATTTATA CTTAAAGCAC CTTCCTCAGG CGATGTCACA 120 ACTAAAAATC TTCCTCTCAC CTTAGAACTC AACTTTTGGA ATATTGCAAA CTATGAAGGA 180 AATACATGGA TGGCATTTTA TAAAGAAGAA GATACTGTTG AATATTATGC CGACATAAAA 240 AACATAGTAC TTAAGGATAA AAATTCATGG GTACATGGAT ATCCTGAAGT CTACTATGGG 300 TACAAACCAT GGGCTGGCCA TGGGAATTCC ATTGAGAAAT TAGCTCTTCC TAAAAAGGTA 360 TCAGAATTTC CAGACGTTCT CTTCAATCTA AAATACAACA TATGGTACGA GAAGAATCTT 420 CCTATAAATT TTGCTATGGA AACATGGATA ACAAAAGAAC CCTATCAGAA AACCGTTACT 480 TCAGGGGATA TAGAGATGAT GGTATGGCTA TATGCTAATA GACTTTCTCC TGCAGGGCGA 540 AAGGTAGGAG AAGTAABAAT ACCTATCATC CTAAACGGTA ATCAAAAAGA CATTATCTGG 600 GAAGTATATC TTTCCCCTAT GAGCTGGGAC TACGTGGCCT ATAAATCAAA AGAAAATATT 660 CTTCAAGGAC AGGTAAAAAT ACCAATAAAT GAATTTTTGA AACACCTAAG AACAATTTTA 720 GCCAACAATC CAAGTAGAAT AACCCCAGAG AAATTTGATC AGATGTATGT GACAGTCTGG 780 GAAATTGGAA CAGAATTTGG CGATCCATAT ACTACTGAGG CAAAATTTGG ATGGACTTTC 840 TCAAATTTTG ATATTGAGCT TAAATAA 867 (2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 288 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ;Ü) TIPO DE MOLÉCULA: proteína ;xí) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: Met Lys Lys Ser Leu Leu Ser Leu lie Leu lie Leu Leu Leu lie Thr 1 5 10 15 Leu Ser Phe Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Lys Asp Ala Phe lie Leu Lys 20 25 30 Ala Pro Ser Ser Gly Asp Val Thr Thr Lys Asn Leu Pro Leu Thr Leu 35 40 45 Glu Leu Asn Phe Trp Asn lie Ala Asn Tyr Glu Gly Asn Thr Trp Met 50 55 60 Ala Phe Tyr Lys Glu Glu Asp Thr Val Glu Tyr Tyr Ala Asp lie Lys 65 70 75 80 Asn lie Val Leu Lys Asp Lys Asn Ser Trp Val His Gly Tyr Pro Glu 85 90 95* Val Tyr Tyr Gly Tyr Lys Pro Trp Ala Gly His Gly Asn Ser lie Glu 100 105 110 Lys Leu Ala Leu Pro Lys Lys Val Ser Glu Phe Pro Asp Val Leu Phe 115 120 125 Asn Leu Lys Tyr Asn lie Trp Tyr Glu Lys Asn Leu Pro lie Asn Phe 130 135 140 Ala Met Glu Thr Trp lie Thr Lys Glu Pro Tyr Gln Lys Thr Val Thr 145 150 155 160 Ser Gly Asp lie Glu Met Met Val Trp Leu Tyr Ala Asn Arg Leu Ser 165 170 175 Pro Ala Gly Arg Lys Val Gly Glu Val Lys lie Pro lie lie Leu Asn 180 185 190 Gly Asn Gln Lys Asp lie lie Trp Glu Val Tyr Leu Ser Pro Met Ser 195 200 205 Trp Asp Tyr Val Ala Tyr Lys Ser Lys Glu Asn lie Leu Gln Gly Gln 210 215 220 Val Lys lie Pro lie Asn Glu Phe Leu Lys His Leu Arg Thr lie Leu 225 230 235 240 Ala Asn Asn Pro Ser Arg lie Thr Pro Glu Lys Phe Asp Gln Met Tyr 245 250 255 Val Thr Val Trp Glu lie Gly Thr Glu Phe Gly Asp Pro Tyr Thr Thr 260 265 270 Glu Ala Lys Phe Gly Trp Thr Phe Ser Asn Phe Asp lie Glu Leu Lys 275 280 285

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una preparación de enzima que tiene actividad endo-1, 4-ß-glucanasa, caracterizada porque tiene actividad óptima a una temperatura arriba de 85°C.

2. La preparación de acuerdo a la reivindicación 1, caracterizada porque la temperatura es una temperatura arriba de 90°C, preferentemente arriba de 95°C, mas preferentemente arriba de 100°C.

3. La preparación de acuerdo a la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque la preparación de enzima es obtenible de o endógena a una cepa que pertenece al filum de Bacterias Gram Positivas.

4. La preparación de acuerdo a la reivindicación 3, caracterizada porque la cepa pertenece a la subdivisión Clostridia .

5. La preparación de acuerdo a la reivindicación 4, caracterizada porque la cepa pertenece al género Di ctyogl omus, preferentemente es la especie Di ctyogl omus sp . , DSM 6262.

6. La preparación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque es activa a un pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11, preferentemente entre aproximadamente 5.5 y aproximadamente 10.

7. Una preparación de enzima que tiene actividad endoglucanasa, caracterizada porque la actividad hacia carboximetilcelulosa (prueba de CMC) a 70°C y pH 10 es mayor que 50% con respecto a la actividad a 70°C y pH óptimo .

8. La preparación de acuerdo a la reivindicación 7, caracterizada porque la actividad relativa es mayor que 55%, preferentemente mayor que 60%, mas preferentemente mayor que 65%, especialmente mayor que 70%.

9. La preparación de acuerdo a la reivindicación 7 u 8, caracterizada porque la preparación de enzima es obtenible de o endógena a una cepa que pertenece al filum de Bacterias Gram Positivas.

10. La preparación de acuerdo a la reivindicación 9, caracterizada porque la cepa pertenece a la subdivisión Clostridia.

11. La preparación de acuerdo a la reivindicación 10, caracterizada porque la cepa pertenece al género Di c tyogl omus , preferentemente es la especie Di ctyogl omus sp . , DSM 6262.

12. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima que tiene actividad endoglucanasa y actividad óptima arriba de 85°C, preferentemente arriba de 90°C, mas preferentemente arriba de 100°C, caracterizada porque esta secuencia de ADN comprende a) la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia col i DSM 11201, o b) un análogo de la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia coli DSM 11201, que i) es homólogo, preferentemente al menos 60% homólogo, con la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia coli DSM 11201, o ii) hibridiza con la misma sonda de oligonucleótido como la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia coli DSM 1101, o iii) codifica un polipéptido que es homólogo, preferentemente al menos 60% homólogo, con el polipéptido codificado por una secuencia de ADN que comprende la secuencia de ADN que comprende la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia col i DSM 11201, o iv) codifica a un polipéptido que es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo aumentado contra la endoglucanasa purificada codificada por la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia coli DSM 11201.

13. La construcción de ADN de acuerdo a la reivindicación 12, caracterizada porque la secuencia de ADN se aisla de o se produce en la base de una biblioteca de ADN de un procariote o una archeae, preferentemente de una bacteria.

14. La construcción de ADN de acuerdo a la reivindicación 13, caracterizada porque la secuencia de ADN se aisla de o se produce en la base de una biblioteca de ADN de una cepa que pertenece al filum de Bacterias Gram Positivas, preferentemente a la subdivisión Clostridia, en particular una *cépa de Di ctyogl omus, especialmente Di ctyogl omus sp . DSM 6262.

15. La construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12-14, caracterizada porque la secuencia de ADN se aisla de Escheri chia coli , DSM 11201.

16. La construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12-15, caracterizada porque comprende además una secuencia de ADN que codifica un dominio que enlaza celulosa (CBD) .

17. La construcción de ADN de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizada porque comprende además una secuencia de ADN que codifica un dominio que enlaza celulosa (CBD) , el dominio que enlaza celulosa y el núcleo de la enzima (dominio catalíticamente activo) de la enzima codificada por la secuencia de ADN de la construcción de ADN que se enlaza operablemente.

18. Un vector de expresión recombinante, caracterizado porque comprende una construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12-17.

19. Una célula, caracterizada porque comprende una construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12-17 o un vector de expresión recombinante de acuerdo a la reivindicación 18.

20. Una célula de acuerdo a la reivindicación 19, caracterizada porque es una célula procariótica, en particular una célula bacteriana, o una célula endógena de la que se origina la secuencia de ADN, que codifica una enzima que exhibe actividad endoglucanasa.

21. Una célula de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Bacillus, preferentemente una cepa que pertenece al grupo que consiste de Bacillus subtilis , Bacillus lentus , Bacillus liquefaciens y Bacillus linchen! formís .

22. Una célula de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de un hongo filamentoso, preferentemente una cepa que pertenece al grupo que consiste del género Aspergillus , Fusarium y Trichoderma, mas preferentemente una cepa que pertenece al grupo que consiste de las especies Asprgillus niger , Aspergillus oryzae, Fusarium graminerarum y Trichoderma reesei.

23. Una célula de acuerdo a la reivindicación 20, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Dictyoglomus , preferentemente Dictyoglomus sp., DSM 6262.

24. Una célula de acuerdo a la reivindicación 19, caracterizada porque la célula pertenece a una cepa de Saccharomyces , preferentemente una cepa de Saccharomyces cerevisiae .

25. Un método para producir una enzima que tiene actividad de endoglucanasa y actividad óptima arriba de 85°C, preferentemente arriba de 90°C, mas preferentemente arriba de 100°C, caracterizado porque el método comprende cultivar una célula de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 19-24 bajo condiciones que permiten la producción de la enzima, y recuperar la enzima del cultivo.

26. Una enzima aislada que tiene actividad endoglucanasa, caracterizada porque la enzima es (i) libre de impurezas homologas, y (ii) se produce por el método de acuerdo a la reivindicación 25.

27. Una enzima que tiene actividad endoglucanasa y actividad óptima arriba de 85°C, preferentemente arriba de 90°C, mas preferentemente arriba de 100°C, caracterizada porque la enzima a) se codifica por una construcción de ADN de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 12-17, o b) se producida por el método de acuerdo a la reivindicación 25, o c) es un polipéptido producido por Di c tyogl omus sp , DSM 6262, que se codifica por la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia coli DSM 11201, o d) es inmunológicamente reactiva con un anticuerpo aumentado contra una endoglucanasa purificada codificada por la secuencia de ADN que corresponde a la endoglucanasa que codifica parte de la secuencia de ADN obtenible del plásmido en Escheri chia col i DSM 11201.

28. Una preparación de enzima, caracterizada porque se enriquece en la enzima de acuerdo a la reivindicación 26 o 27.

29. La preparación de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-11 y 28, caracterizada porque comprende adicionalmente una o mas enzimas seleccionadas del grupo que consiste de mananasas, galactánasas, xilanasas, arabinasas, pectin acetil esterasas, poligalacturonasas, ramnogalacturonasas, pectin ligasas, pectato ligasas, pectin metilesterasas, endoglucanasas, proteasas, lipasas, amilasas, cutinasas, peroxidasas, lacasas, celobiohidrolasas y transglutaminasas .

30. Un cultivo biológico sustancialmente puro aislado de la cepa Escherí chi a coli , DSM 11201.

31. Uso de la enzima de acuerdo a la reivindicación 26 o 27 o la preparación de enzima de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-11, 28 y 29 en la industria textil para mejorar las propiedades de fibras celulósicas o tejido o para proporcionar una apariencia de piedra lavada de mezclilla; o en procesos de limpieza industrial; o en material polimérico extruido en caliente; o en la conversión de biomasa a azúcares; o en la producción de alcohol; o para predigestión de p. ej . granos usados en la producción de alimento; o en la producción de café instantáneo o procesos de extracción similares.