MXPA98004081A - Derivados de acido 4,7-dialcoxi-n-acetilneuraminico y metodos para deteccion de virus de influenza tipos a y b en muestras clinicas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a sustratos deácido 4,7-dialcoxi-N-acetilneuramínico cromogénico y fluorogénicos que pueden usarse para detectar influenza tipos A y B en muestras o especímenes clínicos. Más particularmente, la presente invención proporciona sustratos deácido 4,7-dialcoxi-N-acetilneuramínico que pueden usarse para distinguir entre diversos virus teniendo actividad de neuraminidasa. De esta manera, los virus de influenza tipo Ay B pueden distinguirse de los virus de para-influenza tipo 1, 2, 3 y 4 y de paperas usando los derivados deácido 4,7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de esta invención.

Description

DERIVADOS DE ACIDO 4 , 7-DIALCOXI-N-ACETILNEURAMIN CO Y MÉTODOS PARA DETECCIÓN DE VIRUS DE INFLUENZA TIPOS A Y B EN MUESTRAS CLÍNICAS La presente invención proporciona sustratos de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico cromogénicos y fluorogénicos que pueden usarse para detectar influenza tipos A y B en muestras o especímenes clínicos. Mas particularmente, la presente invención proporciona sustratos de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico que pueden usarse para distinguir entre diversos virus teniendo actividad de neuraminidasa. De esta manera, los virus de influenza tipo A y B pueden distinguirse de los virus de para-influenza tipo 1, 2 , 3 y 4 y de paperas usando los derivados de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de esta invención. Antecedentes de la Invención Las enfermedades infecciosas son la razón mas común de las visitas al consultorio médico. Los virus son responsables de mas de estas infecciones que todos los demás grupos de microorganismos combinados. De todas las diversas infecciones ocasionadas por virus, los virus respiratorios (influenza A y B; para-influenza 1, 2, 3 y 4; virus sincitial respiratorio; y adenovirus) son los mas prevalecientes como grupo. La letalidad del virus de la influenza fue descubierta tan temprano como 430 AC en la plaga de Atenas (Langmuir y colaboradores, New. Engl. J. Medicine 313 (1985) 1027) . La influenza es la causa número uno de enfermedades respiratorias agudas y un contribuyente de la sexta causa principal de mortalidad en los Estados Unidos anualmente (Monthly Vital Statistics Report, vol. 43, No. 6 (1995) ) . Como resultado, se ha tornado cada vez mas importante el desarrollo de métodos de diagnóstico para virus e infecciones virales . El rápido diagnóstico de las infecciones virales también se ha convertido en parte integral de la buena práctica médica. Algunos virus tienen antígenos definibles contra los cuales pueden producirse anticuerpos. Por tanto, se han usado ampliamente inmuno-ensayos para la medición de la presencia de un virión. Donde es deseable medir un grupo mas amplio de viriones, puede ser posible detectar un componente particular del virus. Por ejemplo, los virus de la influenza expresan glicoproteínas de superficie teniendo actividad de neuraminidasa (sialidasa) . La enzima neuraminidasa hidroliza sustratos que contienen ácido N-acetilneuramínico enlazado 2-cetosídicamente (Neu5Ac, también conocido como ácido siálico) . Neu5Ac consiste en una columna vertebral de nueve átomos de carbono, un grupo carboxilo y un grupo N-acetilo. La estructura general, así como el sistema de numeración usado para denotar los átomos de carbono, se muestran Cuando un virión con actividad de neuraminidasa es incubado con un glicósido cromogénico o fluorogénico de Neu5Ac, la enzima cortará el aglicón cromogénico o fluorogénico del sustrato, y el producto de reacción indicará la presencia de un virión. A través de toda esta descripción, el grupo N-acetil unido al carbono en la posición 5 en la fórmula anterior será denotado como AcH . Un método para detectar la presencia de un virus a través de la reacción de una enzima con un sustrato cromogénico para la enzima es descrito en la patente de los Estados Unidos No. 5,252,458, la cual es incorporada en la presente por referencia. Un ensaye para la medición directa de neuraminidasa de influenza fue desarrollado por Yolken y colaboradores (J. Infec-tious Diseases 142^ (1980) 516-523) . Yolken y colaboradores usaron el 4-metilumbeliferilo-2-cetósido de Neu5Ac como un sustrato fluorescente para medir actividad de neuraminidasa en preparaciones que contienen pequeñas cantidades de virus cultivado así como en algunas muestras de lavado nasal de voluntarios humanos infectados con el virus de la influenza. Yolken y colaboradores sugirieron que "el desarrollo exitoso de ensayes de enzima fluorométricos para la detección de neuraminidasa de influenza podrían de esta manera proporcionar medios prácticos de diagnóstico de la influenza que sean suficientemente rápidos para permitir la institución de intervenciones preventivas y terapéu-ticas apropiadas". De acuerdo con Yolken y colaboradores, los ensayes colorimétricos fueron insuficientemente insensibles para aplicaciones clínicas. En contraste, Yolken y colaboradores notaron que los ensayes fluorométricos podrían ser adecuados para detectar neuraminidasa de influenza en muestras clínicas . Pachucki y colaboradores (J. Clinical Microbiolosy 26 (1988) 2664-2666) probaron el 4-metilumbeliferil-2-cetósido de Neu5Ac en especímenes clínicos recolectados de pacientes de influenza. Debido a su baja sensibilidad, el ensaye no fue útil para detectar neuraminidasa directa y rápidamente en especímenes clínicos. Sin embargo, el ensaye identificó 91% de aislados virus-positivos 25 horas después de inoculación de cultivos de tej idos . El uso de sustratos de Neu5Ac modificados puede incrementar la especificidad del ensaye de neuraminidasa. En ácidos siálicos, el carbono en la posición 4 (C-4) ha sido reportado jugar un papel importante en las interacciones enzima-sustrato. Además, como es sabido que las enzimas bacterianas salivales exhiben actividad de neuraminidasa (Varki y colaboradores, J. Biol. Chem. 258 (1983) 12465-12471), es esencial eliminar estas interacciones indeseables. Se ha mostrado ya que los cetósidos de 4-metoxi-Neu5Ac son resistentes hacia ciertas sialidasas bacterianas, pero son cortados rápidamente por ciertas sialidasas virales (Beau y colaboradores, Eur. J. Biochem. 106 (1980) 531-540) . Aunque la modificación de la posición 4 de los ácidos N-acetilneuramínicos proporciona especificidad entre cierta reactividad neuraminidasa viral y bacteriana, todavía sería deseable obtener sustratos que permitan mayor especificidad o diferenciación entre las diversas reactividades neuraminidasa viral mientras se mantiene la especificidad entre reactividades neuraminidasa viral y bacteriana. Tales sustratos, por ejemplo, permitirían alta especificidad para tipos particulares de virus que contienen neuraminidasa y permitirían regímenes de tratamiento mejores y mas dirigidos. Tales sustratos también permitirían vigilancia mas precisa de infecciones virales e intervención médica mas enfocada, según sea apropiado. Los sustratos de ácido N-acetilneuramínico 4, 7 -modificado cromogénicos y fluorogénicos de la presente invención permiten mayor especificidad o diferenciación entre las diversas reactividades neuraminidasa viral mientras mantienen la especificidad entre reactividades neurami-nidasa viral y bacterial. Compendio de la Invención Esta invención se refiere a sustratos de ácido N-acetilneuramínico 4, 7 -modificado cromogénicos y fluorogénicos, que pueden usarse para la detección e identificación de los virus de la influenza en especímenes clínicos. Mas específicamente, esta invención se refiere a sustratos de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico cromogénicos y fluorogénicos que pueden usarse para la detección y la identificación de virus de la influenza en especímenes clínicos. Estos sustratos de ácido N-acetilneuramí-nico 4 , 7-modificado pueden usarse en pruebas de diagnóstico para distinguir entre virus de influenza tipo A y B y otros virus que poseen enzimas neuraminidasa en especímenes clínicos. Esta invención también se refiere a métodos de diagnóstico que emplean tales sustratos. Como se usan en la presente, los términos "grupo cromogénico y fluorogénico" y "grupo marcador o reportero" están destinados a incluir, sin limitación, moléculas que exhiben absorbancia o fluorescencia. El término "color" similarmente destinado a incluir, sin limitación, absorbancia y fluorescencia. Es un objetivo de esta invención el de proporcionar sustratos de ácido N-acetilneuramínico 4 , 7-modificado cromogénicos y fluorogénicos útiles en métodos de diagnóstico para la detección de virus. Otro objetivo de esta invención es el de proporcionar un método práctico, conveniente y efectivo desde el punto de vista de costos para la detección de virus de influenza tipo A y B en especímenes clínicos. Otro objetivo de esta invención es el de proporcionar un método de diagnóstico práctico, conveniente y efectivo desde el punto de vista de costos, que pueda distinguir entre virus de influenza tipo A y B y otros virus teniendo reactividad neuraminidasa general en especímenes clínicos . Todavía otro objetivo de esta invención es el de proporcionar un ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de la fórmula general : donde Rx y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono. De preferencia, tanto Rx como R2 son grupos metilo. Todavia otro objetivo de esta invención es el de proporcionar un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramíni-co de la fórmula general: donde Rx y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un grupo cromogénico o fluorogénico. De preferencia, tanto Rx como R2 son grupos metilo y R3 es un grupo cromogénico . Todavía otro objetivo de esta invención es el de proporcionar un método para detectar virus de influenza tipo A y B en una muestra clínico de un individuo del que se sospecha tener una infección respiratoria viral, dicho método comprendiendo : (1) incubar la muestra clínica con un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico cromogénico o fluorogénico de la fórmula general : donde Rx y R2 son radicales alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un grupo cromogénico o fluorogénico que exhibe un color distintivo y característico cuando se corta del sustrato o una sal del sustrato; (2) observar la muestra clínica incubada para determinar si se forma el color distintivo y característico, donde la formación del color distintivo y característico indica la presencia de virus de influenza tipos A o B en la muestra clínica. Todavía otro objetivo de esta invención es el de proporcionar un método para detectar virus de la influenza tipo A y B en una muestra clínica de un individuo con sospecha de tener una infección respiratoria viral, dicho método comprendiendo : (1) dividir la muestra clínica en una primera porción y una segunda porción; (2) incubar la primera porción con un primer sustrato de un ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de la fórmula general : donde Rx y R2 son radicales alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un primer grupo cromogénico o fluorogénico que exhibe un primer color distintivo y característico cuando se corta del primer sustrato o una sal del primer sustrato; (3) observar la primera porción incubada para determinar si se forma el primer color distintivo y característico, donde la formación del primer color distintivo y característico indica la presencia de virus de influenza tipo A o B en la muestra clínica; (4) incubar la segunda porción con un segundo sustrato de ácido 4-alcoxi-N-acetilneuramínico cromogénico o fluorogénico de la fórmula general: donde R4 es un radical alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R5 es un segundo grupo cromogénico o fluorogénico que exhibe un segundo color distintivo y característico cuando se corta del segundo sustrato o una sal del segundo sustrato; y (5) observar la segunda porción incubada para determinar si se forma el segundo color distintivo y característico, donde la formación del segundo color distintivo y característico indica la presencia de virus reactivos a neuraminidasa en la muestra clínica; donde la presencia de los colores primero y segundo indica la presencia de virus de influenza tipo A o B solos o en combinación con virus reactivos a neuraminidasa distintos de los virus de influenza tipo A y B en la muestra clínica; donde la presencia del segundo color y la ausencia del primer color indican virus reactivos a neuraminidasa distintos de los virus de influenza tipo A y B en la muestra clínica; y donde la ausencia de los colores primero y segundo indica la ausencia de virus reactivos a neuraminidasa en la muestra clínica. Otros objetivos, ventajas, aspectos y características de la presente invención serán mas evidentes al considerarse la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas. Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a un ácido 4,7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de la fórmula general : donde R? y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono. R? y R2 pueden ser grupos alquilo iguales o diferentes. Los grupos alquilo superiores (es decir, cuando R contiene 3 a 4 átomos de carbono) pueden incluir isómeros lineales y ramifica-dos. De preferencia, Rx y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 o 2 átomos de carbono; con mayor preferencia, Rx y R2 son ambos grupos metilo. El ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de la presente invención puede ser preparado usando el siguiente esquema de reacción general: El material inicial 1 (derivado 8, 9-O-isopropilidina-metil éster-metilo cetósido de Neu5Ac) es preparado a partir de Neu5Ac, como se describe generalmente en la patente de los Estados Unidos No. 5, 556,.963, concedida el 17 de septiembre de 1996 a la solicitante (solicitud No. de Serie 08/286,573, presentada el 5 de agosto de 1994), la cual es incorporada en la presente por referencia. Neu5Ac está comercialmente disponible (MediHerb Inc., 4540 S. Navajo #1, Englewood, Colorado 80110, Estados Unidos) . Puede también sintetizarse enzimáticamente de N-acetil-D-manosamina y ácido pirúvico usando ESQUEMA 1 el procedimiento descrito por Kim y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 110 (1988) 6481, e ilustrado por la siguiente ecuación: La reacción enzimática puede ser supervisada por cromatografía de capa delgada (TLC) y el producto puede ser purificado por cromatografía de intercambio de iones. Neu5Ac es primero convertido en un alquilo éster alquilo cetósido de la fórmula general: como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,556,963. Los grupos hidroxilo vecinos en C-8 y C-9 de este metilo éster metilo cetósido son protegidos por la formación de un cetal ( 1 ) por tratamiento con cantidades efectivas de acetona y un catalizador ácido para formar el cetal. Catalizadores ácidos adecuados incluyen ácido p-toluenosulfónico, sales de ácido p-toluenosulfónico tales como la sal piridinio (PPTS) y otras sales, ZnCl2, FeCl3, y similares. El catalizador ácido preferido es la sal piridinio no higroscópica de ácido p-toluenosulfónico. El metilo éster metilo cetósido protegido (1.) es entonces alquilado para formar una mezcla del compuesto 2. conteniendo un grupo alcoxi en la posición 4 y el compuesto 3. con grupos alcoxi tanto en la posición 4 como la 7. La alquilación del grupo hidroxilo en C-4 y C-7 puede ser metilación, etilación, propilación, o butilación, con lo cual el grupo hidroxi en C-4 en 2 sea convertido en un grupo -OR y los grupos hidroxi en C-4 y C-7 en 3. sean convertidos en grupos -OR donde R es un radical alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono. De preferencia, la alquilación en C-4 y/o C-7 es metilación o etilación, con lo cual se obtengan derivados 4-metoxi o 4-etoxi o 4,7-dimetoxi o 4,7-dietoxi . Con mayor preferencia, la alquilación en C-4 y/o C-7 es metilación, con lo cual se obtienen derivados 4-metoxi o 4,7-dimetoxi . La introducción de los grupos alquilo superior en las posiciones C-4 y C-7 es generalmente mas lenta que la metilación y los rendimientos son algo inferiores. A mayor abundamiento, sustratos cromogénicos con grupos alquilo superior tienden a ser menos susceptibles a corte enzimático que 4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac, con ello dando como resultado ensayes menos sensibles. No obstante, para algunos ensayes y aplicaciones específicos, tales grupos alquilo superiores en C-4 y C-7 pueden ser útiles e incluso preferidos . La alquilación en el grupo hidroxilo libre, mas estéricamente impedido en C-7 puede ser estimulada controlando las condiciones de reacción, como se describe inmediatamente en lo sucesivo. De acuerdo con el proceso, el intermediario 1 es tratado con un exceso (generalmente mayor de 1.5 equivalentes molares) de un agente de alquilación en una dispersión alrededor de 80% de hidruro de sodio. El agente de alquilación es seleccionado del grupo que consiste en sulfato de dimetilo, sulfato de dietilo, sulfatos de dipropilo, y sulfatos de dibutilo. La reacción es generalmente conducida a una temperatura de alrededor de 0 a alrededor de 30 °C por alrededor de 10 minutos a alrededor de 48 horas. De preferencia, la temperatura de reacción está en el rango de alrededor de 0 a alrededor de 22 °C. Se prefieren generalmente tiempos de reacción mas largos cuando se forman los grupos alcoxi superiores en las posiciones 4 y 7. En una forma de realización preferida de la invención, una reacción de metilación para formar grupos metoxi en C-4 y C-7 es conducida a una temperatura de alrededor de 0 a alrededor de 22 °C, por alrededor de 10 a alrededor de 30 minutos. En otra forma de realización preferida de la invención, una reacción de etilación para formar grupos etoxi en C-4 y C-7 es conducida a una temperatura de alrededor de 0 a alrededor de 30°C, con mayor preferencia de alrededor de 0 a alrededor de 22°C, por alrededor de 1 a alrededor de 24 horas. El tratamiento del metilo éster metilo cetósido protegido 1 con exceso de agente de alquilación (por ejemplo, sulfato de dimetilo) produce una mezcla del compuesto 2 conteniendo un grupo alcoxi en la posición 4 y compuesto 3_ con grupos alcoxi en ambas posiciones 4 y 7. Generalmente, se usa un exceso de alrededor de 1.5 equivalentes molares de agente de alquilación. De preferencia, se usan alrededor de 1.5 a alrededor de 2.0 equivalentes molares del agente de alquilación. Generalmente, la cantidad del compuesto 3. deseado es incrementada con relación al compuesto 2 al incrementarse la cantidad del agente de alquilación. La mezcla de reacción que resulta de tal tratamiento generalmente contiene el compuesto 4-alcoxi 2 como el producto mayor y alrededor de 10 a 20% en peso del compuesto 4,7-dialcoxi 3_. La separación parcial de los compuestos 2 y 3. puede obtenerse, por ejemplo mediante cromatografía en columna y subsecuente cristalización a partir de una mezcla de acetona-hexano, la cual remueve de manera preferencial el compuesto 4-alcoxi 2 . El residuo resultante contiene una mezcla de los dos compuestos enriquecidos con el material 4 , 7-dialcoxi; generalmente, la relación molar de los dos compuestos es incrementada a al menos alrededor de 1:1. La remoción del grupo cetal del compuesto 3. es lograda mediante tratamiento con alrededor de ácido acético al 80%. La hidrólisis del ácido acético también puede dar como resultado la acetilación parcial en el grupo hidroxilo C-9. Por ende, el producto de la hidrólisis puede ser tratado con metóxido de sodio para remover cualesquiera grupos acetato en C-9. La desprotección final de 4. es llevada a cabo mediante tratamiento alcalino e hidrólisis ácido posterior para dar el producto 4,7-dialcoxi-Neu5Ac final (5_) . Desde luego, el compuesto 4-alcoxi 2. presente en la mezcla también será tratado de manera similar para dar como resultado el compuesto 4-alcoxi-Neu5Ac correspondiente. El 4 , 7-dialcoxi-Neu5Ac resultante puede ser utilizado adicionalmente mediante acoplamiento a cualquier grupo marcador o reportero adecuado, incluyendo, por ejemplo, un grupo marcador cromogénico o fluorogénico. El grupo marcador o reportero preferido es un grupo cromogénico, incluyendo, por ejemplo, 4-cloro-1-naftol, 6-bromo-l-naftol, y 5-bromo-4-cloro-indola . 4,7-dialcoxi-Neu5Ac modificado, cromogénico, puede ser incorporado en un ensaye de neuraminidasa útil para detectar actividad de neuraminidasa viral de influenza tipo A y B en muestras o especímenes clínicos. Métodos para sintetizar y usar tales sustratos de ácido N-acetilneuramínico modificado en las posiciones 4,7, cromogénico, en ensayes virales, son similares a los descritos para los sustratos modificados en la posición 4, relacionados, en la publicación PCT WO 91/09972; Yolken y colaboradores, J. Infectious Diseases 142 (1980) 516-523; y Pachucki y colaboradores, J. Clinical Microbioloqy 26 (1988) 2664-2666, cada una incorporada en la presente por referencia. Desde luego, los ácidos , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínicos de la presente pueden usarse para formar otros derivados cromogénicos y fluorogénicos y pueden usarse en otros ensayes virales. Generalmente, el grupo marcador cromogénico o fluorogénico puede ser incorporado en 4 , 7-dialcoxi-Neu5Ac (5_) usando el siguiente esquema de reacción (usando 5-bromo-3-indolilo como un grupo marcador ejemplificativo) : ESQUEMA 2 El compuesto 5_ es primero convertido en el derivado metilo éster correspondiente por tratamiento con ácido trifluoroacético concentrado y metanol, y el éster es entonces reaccionado con cloruro de acetilo en exceso para formar el derivado cloroacetato-metilo éster de 4, 7-dialcoxi-Neu5Ac (6.) . Acoplar 6. con la sal sodio de 5-bromo-3-indolilo da lugar al éster acetoxi metílico de ácido 5-bromo-indol-3-ol-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico (7.) . La desacetilación de 7. es efectuada por tratamiento con metóxido de sodio en metanol para dar el compuesto 8. y tratamiento subsecuente con hidróxido de sodio da la sal sodio de ácido 5-bromo-3-indolil-4, 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico (9.) . Desde luego, el 4-alcoxi-Neu5Ac en la mezcla sufre reacciones de acoplamiento similares para formar la sal de ácido 5-bromo-3-indolil-4-metoxi-N-acetilneuramínico . El derivado 4,7-dialcoxi acoplado 9. es entonces separado de la mezcla de los dos compuestos acoplados (es decir, los derivados 4-alcoxi y 4, 7-dialcoxi) por cromatografía de líquidos de alto desempeño (HPLC) usando, por ejemplo, una columna de sílice de placa inversa C18. La mezcla de los productos acoplados puede ser disuelta en agua y cargada en la columna. Los productos son separados por un gradiente que se incrementa de metanol, con las fracciones apropiadas recolectadas y formadas en estanque. El ácido 5-bromo-3-indolil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico purificado, resultante (9.) puede ser secado y almacenado hasta usarse. Generalmente, el producto resultante es esencialmente libre del derivado 4-metoxi. Es importante que esta mezcla sea esencialmente libre del derivado 4-metoxi pues es altamente reactiva con el virus de las paperas y otros virus que contienen neuraminidasa. Como se señaló antes, los derivados 4,7-dialcoxi cromogénicos o fluorogénicos de esta invención son de la fórmula general : donde Rx y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un grupo cromogénico o fluorogénico. Rx y R2 pueden ser grupos alquilo iguales o diferentes. De preferencia, tanto Rx como R2 son grupos metilo y R3 es un grupo cromogénico. Con mayor preferencia, R3 es 4-metilumbeliferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, o 6-bromo-2-naftilo. Incluso con mayor preferencia, R3 es 4-metilumbeliferilo, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, o 5-bromo-3-indolilo . R3 mas preferido es 5-bromo-3-indolilo. Sales simples de estos sustratos, tales como las sales Na+, K+ y NH4+, pueden también usarse.

Ejemplos de derivados 4,7-dialcoxi Neu5Ac cromogénicos que caen dentro de la fórmula anterior incluyen alfa-cetósido de ácido 4-metilumbeliferil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 2-nitrofenil- , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 4 -ni trofenil-4 , 7 -metoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 3-cianoumbeliferil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 3-resorufin-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 5-bromo-3-indolil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 3-indolil-4 , 7 -dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 2- [4- (4-nitrofenilazo) fenil] -4, 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 2- [ 4- (4-nitrofenilazo) resor-cinil] -4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 3-metoxifenil-4, 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 3-dimetilaminofenil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 6-bromo-2-naftil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, alfa-cetósido de ácido 4-cloro-l-naftil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico, así como los derivados 4,7-dietoxi, 4 , 7-dipropilo y 4,7-dibutilo correspondientes. Generalmente, se prefieren los derivados 4 , 7-dimetoxi . Si se desea, pueden usarse derivados 4,7-dialcoxi "mixtos" (por ejemplo, 4-metoxi-7-etoxi) . Los derivados 4,7-dialcoxi cromogénicos o fluorogénicos pueden ser usados en pruebas de diagnóstico de virus de influenza tipo A y B en muestras clínicas. Las muestras clínicas que son probadas en la invención serán típicamente secreciones faríngeas, nasofaríngeas o respiratorias recolectadas de pacientes que sufren o que se sospecha que sufren de influenza, como especímenes de lavado, de hisopo o de expectoración. El lavado, la expectoración o el hisopo serán de preferencia combinados con una solución amortiguadora acuosa conteniendo un estabilizante antes de mezclarse con el sustrato. La solución amortiguadora generalmente contiene un amortiguador que mantiene el pH a alrededor de 4 a 7, de preferencia 5.5 a 6.5, opcionalmente alrededor de 0.1 a 10% en peso de detergente no iónico, una pequeña cantidad (1-20 mM) de catión de metal alcalino-térreo (Ca, Mg, de preferencia Ca) , y una cantidad suficiente de un estabilizante seleccionado del grupo que consiste en alditoles, monosacáridos y disacáridos para acrecentar la estabilidad térmica del ácido neuramínico en la muestra. El volumen de solución amortiguadora combinada con la muestra será normalmente de 0.1 a 2 ml . El amortiguador puede ser orgánico o inorgánico. Amortiguadores adecuados incluyen, por ejemplo, amortiguadores convencionales de ácidos orgánicos y sus sales, tales como amortiguadores de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico, etc.), amortiguadores de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio) , amortiguadores de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido succínico-succinato disódico, etc.), amortiguadores de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato, mezcla de ácido tartárico-tartrato de potasio, mezcla de ácido tartárico-hidróxido de sodio, etc.), amortiguadores de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico), amortiguadores de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato de sodio, mezcla de ácido glucónico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido glucónico-gluconato de potasio, etc.), amortiguadores de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato de sodio, mezcla de ácido oxálico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido oxálico-oxalato de potasio, etc.), amortiguadores de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactado de sodio, mezcla de ácido láctico-hidróxido de sodio, mezcla de ácido láctico-lactato de potasio, etc.), amortiguadores de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato de sodio, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, etc.), amortiguadores de malato (por ejemplo, mezcla de ácido D, L-málico-malato disódico), amortiguadores de fosfato (por ejemplo, mezcla de fosfato monosódico-hidróxido de sodio, mezcla de fosfato trisódico-ácido hidroclorhídrico, etc.), ácido (N-mo r f o l ino ) etano s u l fóni co , [ b i s - ( 2 -hidroxietil) imino] tris (hidroximetil) metano, ácido N-2-acetamidoiminodiacético, 1, 3-bis [tris (hidroxi-metil) metilamino] propano, ácido piperacin-N, N' -2-etanosulfónico, ácido N-2-acetamido-2-aminoetanosulfónico, ácido 3- (N-morfolino) -2-hidroxipropanosulfónico, ácido 3- (N-morfolino) propanosulfónico, ácido 2- [tris (hidroxietilpiperacina-N, ' -2-etanosulfónico, ácido 3- [tris- (hidroximetil) metilamino] -2-hidroxipropanosulfónico . Detergentes no iónicos útiles en la solución amortiguadora incluyen, por ejemplo, Pluronics, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80, Tritón X-100, NP-40 y los alquilo glucósidos tales como alquilo glucósidos C8 y C9. El detergente es un componente opcional y facilita la liberación de la neuraminidasa del envolvente viral. Estabilizadores que se usan en la solución amortiguadora incluyen, por ejemplo, alditoles trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol, manitol, las hexosas glucosa y fructosa y el disacárido sacarosa. Estos estabilizadores pueden ser usados solos o en combinación. A fin de estabilizar la actividad de los virus que contienen neuraminidasa, los estabilizadores son añadidos al sistema de formulación líquida/excipiente en una cantidad de 0.2 a 2.1 M y, de preferencia, 0.6 a 2.0 M. Una vez mezclada con la solución amortiguadora, la muestra puede ser almacenada por períodos prolongados, de preferencia a 2 a 8°C, sin pérdida significativa de actividad de neuraminidasa. El sustrato será añadido normalmente a la muestra amortiguada, estabilizada, en cantidades que varían entre 0.05 y 0.5 mM. La mezcla es incubada a temperatura desde ambiental hasta fisiológica (es decir, alrededor de 18 a 40°C) por un tiempo suficiente para permitir que cualquier neuraminidasa en la muestra reaccione con el sustrato. Ese tiempo normalmente estará en el rango de 1 minuto a 4 horas, habitualmente 5 a 120 minutos, y mas habitualmente 30 a 60 minutos. Si hay actividad de neuraminidasa en la muestra, el grupo marcador o reportero será liberado del sustrato y el precipitado del marcador o reportero liberado impartirá un color característico a la mezcla. Especialmente para derivados colorimétricos , la mezcla de reacción resultante es de preferencia transferida a un dispositivo de recolección que contiene un filtro de membrana porosa y una almohadilla absorbente para impregnarse de solución. Un dispositivo de recolección semejante es mostrado en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/479,789, pendiente (presentada el 7 de junio de 1995), la cual es incorporada en la presente por referencia. En la presencia de neuraminidasa de influenza tipo A y B, el grupo reportero en Neu5Ac 4 , 7-modificado es liberado por la acción de la neuraminidasa y la molécula reportera resultante es recolectada como un precipitado de color sobre la membrana de filtro porosa. La presencia de tal producto de color indica un diagnóstico positivo de influenza tipos A y B; la ausencia de tal producto de color indica un diagnóstico negativo de influenza tipos A y B.

La concentración o la recolección del precipitado de color incrementa la sensibilidad de la prueba de diagnóstico. Sin embargo, tales dispositivos de recolección no son necesarios para la práctica de la invención. La siguiente tabla indica el color característico generado cuando la neuraminidasa reacciona con diversos derivados de Neu5Ac 4 , 7-modificado cromogénico o fluorogénico y libera la molécula reportera.

Los presentes derivados de 4,7-dialcoxi Neu5Ac cromogénicos y fluorogénicos solo exhiben el color característico en presencia del virus de la influenza tipo A y B. No exhiben el color característico (es decir, no ocurre liberación de la molécula reportera) en la presencia de para-influenza tipos 1, 2, 3 y 4, paperas, virus respiratorios sincitiales y/o adenovirus. Mas aún, los derivados 4,7-dialcoxi Neu5Ac cromogénicos y fluorogénicos no exhiben reactividad a neuraminidasa bacteriana. Para mantener el grado deseado de selectividad, los derivados 4,7-dialcoxi Neu5Ac deben estar esencialmente libres de los derivados 4-alcoxi Neu5Ac correspondientes. Los máximos niveles de los derivados 4-alcoxi Neu5Ac que permiten selectividad aceptable pueden ser determinados de manera experimental usando cepas conocidas de los diversos tipos de virus. Generalmente, los niveles de los derivados 4-alcoxi Neu5Ac deben ser menores de 5% en peso, y de preferencia menores de alrededor de 0.5% en peso . Una prueba de diagnóstico potencialmente mas informativa puede ser obtenida combinando la reactividad a neuraminidasa y la selectividad de los derivados 4,7-dialcoxi Neu5Ac cromogénicos y fluorogénicos de la presente y los derivados 4-alcoxi Neu5Ac cromogénicos y fluorogénicos en una sola prueba. En tal sistema, la muestra clínica es dividida en dos porciones que son luego incubadas por separado con los derivados 4,7-dialcoxi y 4-alcoxi Neu5Ac, respectivamente. La presencia y/o la ausencia del color característico en las dos muestras incubadas puede usarse para determinar mas estrechamente el tipo de virus, si lo hay, presente en la muestra clínica. Si solo están presentes virus de influenza tipo A o B en la muestra clínica, entonces ambos derivados 4-alcoxi y 4,7-dialcoxi exhibirán los colores característicos de sus moléculas reporteras. Si están presentes en la muestra clínica tanto virus de influenza tipo A o B y virus reactivos a neuraminidasa distintos de los virus de influenza tipo A y B, entonces cada porción exhibirá el color característico de su molécula reportera. Si solo están presentes en la muestra clínica virus reactivos a neuraminidasa distintos de los virus de influenza tipo A y B, entonces solo los derivados 4-alcoxi exhibirán el color característico de su molécula reportera. Si no están presentes en la muestra clínica virus reactivos a neuraminidasa, entonces ninguna porción exhibirá el color característico de su molécula reportera. En consecuencia, la presente invención proporciona técnicas sencillas y rápidas para diagnosticar selectivamente influenza, especialmente tipos A y B, que pueden llevarse a cabo en la clínica o el consultorio médico y permitir al médico prescribir la terapia apropiada para tratar la infección y/o el tratamiento profiláctico apropiado a personas en contacto estrecho con el paciente infectado. Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar la invención. Ejemplo 1. La síntesis de 4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac fue llevada a cabo usando las reacciones mostradas en el Esquema 1. Una solución fría (temperatura de baño de hielo) del derivado de isopropilideno 1 (1.2 g) en alrededor de 10 ml de acetonitrilo seco fue saturada con nitrógeno. Se añadió hidruro de sodio (270 mg; dispersión al 80% en aceite) y la mezcla fue agitada por 20 minutos. Se añadió sulfato de dimetilo (1 ml) y continuó la agitación por 30 minutos adicionales usando un baño de hielo para enfriar la mezcla . La mezcla resultante fue filtrada a través de Celite y el precipitado fue lavado con acetonitrilo seco. El precipitado fue evaporado y el residuo fue secado y extraído con acetona. Después de la filtración, se evaporó de nuevo el filtrado. El residuo resultante fue secado y sometido a cromatografía sobre gel de sílice. La elución con cloruro de metileno/metanol (25:1) removió diversos productos secundarios. La elución continuada con el mismo sistema solvente proporcionó un jarabe que contiene 2 y 3., que fue cristalizado a partir de acetona-hexano . Se recolectó 2 cristalino (177 mg) . El filtrado contuvo una mezcla de 2 y 3 (alrededor de 1:1) pero con una mayor proporción de 3. que la mezcla original. El filtrado conteniendo 3. (1.22 g) fue tratado con ácido acético acuoso al 80% (15 ml) a 85°C por una hora. La mezcla fue evaporada y co-evaporada con agua. El residuo fue sometido a cromatografía. La elución con cloruro de metileno/metanol (5:1) removió un producto secundario menor. La elución continuada con el mismo sistema solvente dio el producto 4. parcialmente desprotegido (0.87 g; rendimiento de 80%) . El cetósido de 4 , 7-dimetoxi-metilo éster metilo (4_) (0.87 g) fue tratado con hidróxido de sodio 1 M (3 ml) en metanol (5 ml) y agua (5 ml) a temperatura de habitación por una hora. La mezcla fue neutralizada con resina Dowex 50 (H+) ; la resina fue removida por filtración y lavada con metanol. El filtrado combinado fue evaporado. El residuo fue tratado con resina Dowex 50 (H+) (1.5 g) en ácido hidroclorhídrico 0.025 M a 100°C por dos horas. La resina fue removida por filtración y el filtrado recolectado y evaporado. El residuo fue secado bajo vacío para dar 4, 7-dimetoxi-Neu5Ac (5.) esencialmente puro (0.71 g; rendimiento de 88%) . Ejemplo 2. La síntesis de 5-bromo-3-indolil-4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac fue llevada a cabo usando las reacciones mostradas en el Esquema 2. El compuesto 5_ (1.0 g) fue tratado con ácido trifluoroacético (0.2 ml) en metanol (25 ml) durante la noche, a temperatura de habitación. La mezcla fue evaporada. El residuo fue secado y tratado con cloruro de acetilo (5 ml) en cloruro de metileno (5 ml) . La mezcla de reacción fue agitada durante la noche a temperatura de habitación y luego evaporada.

El residuo fue secado para proporcionar el cloruro crudo (6.) (1.36 g) . El producto crudo 6 no fue purificado adicionalmente debido a su inestabilidad. Una suspensión del producto crudo 6. (0.7 g) y 1-acetil-5-bromo-indol-3-ol (0.26 g) en acetona (5 ml) fue saturada con nitrógeno. Se añadió una solución de hidróxido de sodio 1 M (1 ml) . La mezcla de reacción fue agitada bajo nitrógeno por una hora. Después de evaporación, el residuo fue secado y sometido a cromatografía sobre gel de sílice. La elución con cloruro de metileno/metanol (25:1) removió el cromógeno sin reaccionar (0.128 g) . La elución continuada con el mismo sistema solvente dio fracciones conteniendo principalmente el producto acoplado 7_ (0.114 g) . El producto acoplado 7. (0.114 g) fue tratado con metóxido de sodio 1 M en metanol (0.1 ml) por 30 minutos a temperatura de habitación. Después de neutralización con resina Dowex 50 (H+) , la resina fue removida y lavada con metanol. El filtrado combinado fue evaporado. El residuo fue secado y sometido a cromatografía sobre gel de sílice. Fracciones conteniendo principalmente el producto acoplado 8. fueron estancadas y evaporadas para dar alrededor de 60 mg de 8.. El producto acoplado 8. (60 mg) fue tratado con hidróxido de sodio 1 M (0.5 ml) en metanol acuoso al 50% (5 ml) por 30 minutos a temperatura de habitación. La mezcla fue neutralizada con resina Dowex 50 (H+) . La resina fue removida por filtración y lavada con metanol. El filtrado combinado fue evaporado y el residuo fue purificado mediante HPLC. Las primeras fracciones contuvieron un producto no acoplado. El material acoplado apareció como un pico amplio que consistió tanto en 4-metoxi-Neu5Ac acoplado como 4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac acoplado (producto 9.) . Como una cantidad menor del derivado 4-metoxi acoplado puede tornar no específico el análisis de diagnóstico, solo se estancaron fracciones altamente puras conteniendo 9.. Al ocurrir evaporación, se recolectó 9. altamente purificado (4 mg) ; el material recolectado contuvo menos de alrededor de 5% en peso del derivado 4-alcoxi correspondiente. Ejemplo 3. Este ejemplo demuestra la especificidad de 5-bromo-3-indolil-4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac (9.) del Ejemplo 2 en pruebas de diagnóstico de influenza A y B en virus cultivados. Los virus fueron cultivados a partir de aislados frescos de pacientes o cultivos de material congelado usando la línea celular, el medio y las condiciones de incubación apropiados, adecuados para el desarrollo y cultivo del virus particular. Se usaron las siguientes células: (1) células RMK (riñon de mono Rhesus) para virus de influenza y para-influenza; (2) células Hep-2 (carcinoma de laringe humana) para virus respiratorio sincitial y adenovirus; y (3) células VERO (riñon de mono verde africano) para paperas. Todas las células fueron cultivadas a monocapas casi confluentes en tubos o matraces con mínimo medio esencial con suero al 5-10% a 37°C. Las infecciones con virus fueron llevadas a cabo en las líneas celulares apropiadas con ínimo medio esencial sin suero a 37 °C. Los cultivos infectados con virus fueron supervisados y confirmados observando la apariencia de efectos citopáticos característicos y probando con ensayes de inmunofluorescencia usando anticuerpos monoclonales específicos al tipo de virus. Los siguientes efectos citopáticos característicos fueron observados para cada uno de los virus usados, como sigue: (1) influenza A y B: áreas de células grandes, de forma irregular, granulares o vacuoladas con progresiva degeneración de la monocapa celular; (2) para-influenza 1: pequeñas células redondeadas a través de toda la monocapa celular; (3) para-influenza 2: sincitios oscuros, granulares e irregulares que se retraen de la monocapa celular; (4) para-influenza 3: células alargadas, fusiformes, que se retraen eventualmente y alejan de la monocapa celular; (5) virus respiratorio sincitial: sincitios grandes, de forma irregular que aparecen como células grandes, multi-nucleadas con fronteras indistintas a través de toda la monocapa celular; (6) adenovirus: células grandes, redondeadas, picnóticas, que se agregan eventualmente en láminas celulares redondeadas y se desprenden del recipiente de cultivo; y (7) paperas: sincitios con vacuolación y degeneración celular a través de toda la monocapa celular. Los anticuerpos monoclonales específicos al tipo de virus, comerciales, fueron usados en ensayes de fluorescencia para confirmar el cultivo de cada virus en los cultivos inoculados . Las células de los cultivos infectados fueron fijadas con metanol en porta-objetivos de vidrio y luego incubadas a 37 °C con anticuerpos monoclonales marbetados con fluoresceína. Se usaron ensayes de fluorescencia tanto directos como indirectos. Para los ensayes directos, las células fijas, infectadas con el virus, fueron incubadas por 30 minutos con los anticuerpos monoclonales marbetados con isotiocianato de fluoresceína (FITC), específicos al tipo de virus. Para los ensayes indirectos, las células fijas, infectadas con el virus, fueron incubadas por 30 minutos con anticuerpos monoclonales no marbetados, específicos al tipo de virus, seguido por incubación por 30 minutos adicionales con anticuerpos monoclonales marbetados con FITC secundarios . Los porta-objetivos fueron cubiertos con medio de montaje y examinados usando un microscopio fluorescente. Un resultado de virus positivo fue verificado por la presencia de un manchado verde manzana específico del virus, característico. La presencia de efectos citopáticos progresivos y característicos (junto con confirmación de virus específico acompañante con ensaye de fluorescencia) fue una indicación de que el virus inoculado particular había proliferado en forma máxima. Después de alcanzar máximo crecimiento del virus y confirmación de la presencia del virus apropiado, los fluidos de cultivo fueron cosechados para evaluación con los sustratos cromogénicos del ácido 4-metoxi-N-acetilneuramínico y del ácido 4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico . Los fluidos de cultivo conteniendo virus (0.1 ml) fueron mezclados con los sustratos cromogénicos en 1 o 2ml de una solución conteniendo excipientes y amortiguador diseñados para alcanzar pH óptimo y óptima actividad de neuraminidasa. La solución de amortiguador/excipiente contenía amortiguador málico/malato 35 mM con cloruro de calcio 10 mM, 0.85% de cloruro de sodio, 0.1% de manitol, 0.5% de metanol, y 0.1% de metil parabén. La combinación de sustrato y amortiguador a un pH de alrededor de 5.4 fue determinada proporcionar detección específica de virus que producen neuraminidasa con resultados claramente negativos para virus que no producen neuraminidasa y cultivos negativos en virus . Las soluciones de prueba fueron incubadas a 37 °C por alrededor de una hora, después de lo cual la reacción fue detenida por la adición de 0.2 ml de un concentrado amortiguador que cambió el pH a alrededor de 9 y ayudó a incrementar la precipitación del cromógeno liberado. La mezcla de reacción completa fue entonces transferida a un dispositivo de recolección conteniendo un filtro de membrana selectivamente porosa y una almohadilla absorbente para impregnarse de la solución, con lo cual se concentra el precipitado. El dispositivo de recolección es descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/479,789, pendiente (presentada el 7 de junio de 1995) . La aparición de un precipitado de color apropiado indicó una reacción positiva, mientras que la ausencia de tal precipitado de color apropiado indicó una reacción negativa. Usando el cromógeno de 5-bromo-3-indolilo, el color característico para una prueba positiva fue azul. Se usaron los siguientes virus para probar el sustrato de ácido 5-bromo-3-indolil-4-metoxi-N-acetilneuramínico (BI-4-MeONeu5Ac) y el sustrato de ácido 5-bromo-3-indolil-4 , 7-dimetoxi-N-acetilneuramínico (BI-4 , 7- (MeO) 2Neu5Ac) .

Los siguientes resultados fueron obtenidos usando estos diversos cultivos de virus. Los cultivos de virus fueron desarrollados a sus máximos títulos (determinados por la observancia de efectos citopáticos característicos de virus extensivos -alrededor de 90 a 100%- en la lámina celular, y confirmación con ensayes de fluorescencia de manchado color verde manzana brillante, específico de virus, en la mayoría de las células) para asegurar que cualesquiera diferencias de reacción no se deban a concentraciones virales no detectables.

Se usó una escala de clasificación de 1+ a 3+, con base en la intensidad del color de reacción, para indicar niveles relativos de actividad de neuraminidasa detectable. Los colores de clasificación fueron igualados con muestras de color de una fuente de referencia estándar (The Pantone Color Specific Book 747XR) . Una clasificación de 1+ (color ligero) indica un positivo bajo, 2+ (color moderado) indica un positivo moderado, y 3+ (color profundo) indica un positivo alto. Un resultado negativo es indicado por la ausencia del color característico. Un resultado indeterminado es indicado si una traza muy tenue o sugerencia del color característico puede estar presente por observación visual . Como puede verse de estos resultados, los virus que contienen neuraminidasa de influenza tipo A y B fueron los únicos organismos probados que dieron una reacción positiva con sustratos tanto de 4-metoxi-Neu5Ac como de 4, 7-dimetoxi-Neu5Ac, sin diluir y a todas las diluciones probadas. Para para-influenza tipos 1, 2 y 3 y el virus de las paperas, el sustrato de 4-metoxi-Neu5Ac dio reacciones tanto negativas como positivas, dependiendo de la dilución. El sustrato de 4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac dio una reacción negativa con para-influenza tipos 1, 2 y 3 y el virus de paperas sin diluir y en todas las diluciones. Los virus que no contienen neuraminidasa (es decir, virus respiratorio sincitial y adenovirus) produjeron resultados negativos con ambos sustratos. Asimismo, los controles negativos a virus sin virus fueron apropiadamente negativo. Estos resultados demuestran claramente la especificidad de los sustratos cromogénicos de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico para virus de influenza tipo A y B. Ejemplo 4. Resultados similares a los reportados en el Ejemplo 3 fueron obtenidos usando 5-bromo-4-cloro-indol-3-ol y 4-metilumbeliferona como moléculas reporteras en 4-metoxi-Neu5Ac y 4 , 7-dimetoxi-Neu5Ac . Se espera que se ocurran numerosas modificaciones y variaciones en la práctica de la invención a los técnicos en la materia al considerarse la descripción detallada de la invención precedente. En consecuencia, tales modificaciones y variaciones están destinadas a quedar incluidas dentro de los alcances de las reivindicaciones siguientes.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico de la fórmula general : donde Rl y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono.
2. 2. Un ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico, como se define en la reivindicación 1, donde tanto Rx como R2 son grupos metilo.
3. 3. Un ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico, como se define en la reivindicación 1, donde tanto Rx como R2 son grupos etilo.
4. 4. Un sustrato de ácido 4, 7-dialcoxi-N-acetilneuramí-nico de la fórmula general: donde Rx y R2 son grupos alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un grupo cromogénico o fluorogénico.
5. 5. Un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramíníco, como se define en la reivindicación 4, donde tanto R? como R2 son grupos metilo y R3 es un grupo cromogénico.
6. 6. Un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico, como se define en la reivindicación 5, donde R3 es seleccionado del grupo que consiste en 4-metilumbeliferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, y 6-bromo-2-naftilo .
7. 7. Un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico, como se define en la reivindicación 6, donde R3 es 5-bromo-3-indolilo .
8. 8. Un sustrato de ácido 4, 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico, como se define en la reivindicación 6, donde R3 es 5-bromo-3-indolilo .
9. 9. Un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico, como se define en la reivindicación 8, donde R3 es seleccionado del grupo que consiste en 4-metilumbeliferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, y 6-bromo-2-naftilo .
10. 10. Un método para detectar virus de influenza tipo A y B en una muestra clínica de un individuo de quien se sospecha tener una infección respiratoria viral, dicho método comprendiendo : (1) incubar la muestra clínica como un sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico cromogénico o fluorogénico de la fórmula general: donde Rx y R2 son radicales alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un grupo cromogénico o fluorogénico que exhibe un color distintivo y característico cuando se corta del sustrato o una sal del sustrato; (2) observar la muestra clínica incubada para determinar si se forma el color distintivo y característico, donde la formación del color distintivo y característico indica la presencia de virus de influenza tipo A o B en la muestra clínica.
11. 11. Un método como se define en la reivindicación 10, donde tanto Rx como R2 son grupos metilo y R3 es un grupo cromogénico .
12. 12. Un método como se define en la reivindicación 11, donde R3 es seleccionado del grupo que consiste en 4-metilumbeli-ferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, y 6-bromo-2-naftilo .
13. 13. Un método como se define en la reivindicación 12, donde R3 es 5-bromo-3-indolilo .
14. 14. Un método como se define en la reivindicación 10, donde tanto Rt como R2 son grupos etilo y R3 es un grupo cromogénico .
15. 15. Un método como se define en la reivindicación 14, donde R3 es seleccionado del grupo que consiste en 4-metilumbeliferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, y 6-bromo-2-naftilo .
16. 16. Un método para detectar virus de influenza tipo A y B en una muestra clínica de un individuo de quien se sospecha tener una infección respiratoria viral, dicho método comprendiendo: (1) dividir la muestra clínica en una primera porción y una segunda porción; (2) incubar la primera porción como un primer sustrato de ácido 4 , 7-dialcoxi-N-acetilneuramínico cromogénico o fluorogénico de la fórmula general: donde R? y R2 son radicales alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R3 es un primer grupo cromogénico o fluorogénico que exhibe un primer color distintivo y característico cuando se corta del primer sustrato o una sal del primer sustrato; (3) observar la primera porción incubada para determinar si se forma el primer color distintivo y característico, donde la formación del primer color distintivo y característico indica la presencia de virus de influenza tipo A o B en la muestra clínica; (4) incubar la segunda porción com un segundo sustrato de ácido 4-alcoxi-N-acetilneuramínico cromogénico o fluorogénico de la fórmula general : donde R4 es un radical alquilo conteniendo 1 a 4 átomos de carbono y R5 es un segundo grupo cromogénico o fluorogénico que exhibe un segundo color distintivo y característico cuando se exhibe un segundo color distintivo y característico cuando se corta del segundo sustrato o una sal del segundo sustrato; y (5) observar la segunda porción incubada para determinar si se forma el segundo color distintivo y característico, donde la formación del segundo color distintivo y característico indica la presencia de virus reactivos a neuraminidasa en la muestra clínica; donde la presencia de los colores primero y segundo indica la presencia de los virus de influenza tipo A o B solos o en combinación con virus reactivos a neuraminidasa distintos de los virus de influenza tipo A y B en la muestra clínica; donde la presencia del segundo color y la ausencia del primer color indica virus reactivos a neuraminidasa distintos de los virus de influenza tipo A y B en la muestra clínica; y donde la ausencia de los colores primero y segundo indica la ausencia de virus reactivos a neuraminidasa en la muestra clínica.
17. 17. Un método como se' define en la reivindicación 16, donde tanto R1 como R2 son grupos metilo y R3 es un primer grupo cromogénico.
18. 18. Un método como se define en la reivindicación 17, donde R4 es un grupo metilo y R5 es un segundo grupo cromogénico.
19. 19. Un método como se define en la reivindicación 17, donde R3 y R4 son seleccionados independientemente del grupo que consiste en 4-metilumbeliferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, y ß-bromo-2-naftilo .
20. 20. Un método como se define en la reivindicación 19, donde R3 es 5-bromo-3-indolilo .
21. 21. Un método como se define en la reivindicación 8, donde R3 y R4 son seleccionados independientemente del grupo que consiste en 4-metilumbeliferilo, 3-cianoumbeliferilo, 2-nitrofenilo, 4-nitrofenilo, 3-resorufina, 5-bromo-4-cloro-3-indolilo, 5-bromo-3-indolilo, 3-indolilo, nitrofenilazofenilo, nitrofenilazoresorcinilo, 3-metoxifenilo, 3-dimetilaminofenilo, 4-cloro-l-naftilo, y 6-bromo-2-naftilo .