MX2013010168A - Dispositivo para extraccion de sangre que contiene inhibidor de lisofosfolipasa. - Google Patents

Abstract

Se describen dispositivos de extracción para extraer y estabilizar sangre completa o un componente de la misma, que incluye un primer extremo y un segundo extremo y al menos una pared interior que define un depósito, donde el depósito contiene un agente de estabilización que incluye un inhibidor de la lisofosfolipasa (LysoPLA). También se describen métodos para preparar y usar los dispositivos.

Description

DISPOSITIVO PARA EXTRACCIÓN DE SANGRE QUE CONTIENE INHIBIDOR DE LISOFOSFOLIPASA REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud de Patente provisional de los Estados Unidos con n° 61/449.337 presentada el 4 de marzo de 2011 , cuya memoria descriptiva se incorpora por la presente en el presente documento por referencia.

ANTECEDENTE DE LA INVENCIÓN La diabetes es un síndrome de metabolismo trastornado, debido habitualmente a una combinación de causas hereditarias y ambientales, que da como resultado niveles de azúcar en sangre anormalmente elevados (hiperglucemia). Los niveles de glucosa en sangre están controlados por una compleja interacción de múltiples sustancias químicas y hormonas del cuerpo, incluyendo la hormona insulina fabricada por las células beta del páncreas. La diabetes mellitus se refiere al grupo de enfermedades que conduce a niveles de azúcar en sangre anormalmente elevados debido a defectos tanto en la secreción de la insulina como en la acción de la insulina en el cuerpo.

La diabetes se desarrolla debido a una disminución en la producción de insulina (en el tipo 1 ) o por resistencia a sus efectos (en el tipo 2). En ambos casos se llega a la hiperglucemia, que en gran medida es la causa de los signos agudos de la diabetes, concretamente la excesiva producción de orina, dando como resultado la sed y aumento de la ingesta de líquido para compensar, visión borrosa, pérdida de peso inexplicable, letargía, y cambios en el metabolismo energético.

Las inyecciones mediante jeringa, bomba de insulina, o pluma de insulina suministran la insulina, que es un tratamiento básico en la diabetes de tipo 1. La diabetes de tipo 2 se gestiona con una combinación de dieta, ejercicio, medicamentos y suplementos de insulina. Todas las formas de la diabetes se han convertido en tratables desde que la insulina estuvo médicamente disponible, pero sigue sin tener cura.

De acuerdo con un informe de la Organización Mundial de la Salud de 2000, al menos 171 millones de personas padecen diabetes en todo el mundo, que representa el 2,8 % de la población. Su incidencia está aumentando rápidamente, sin embargo, y se estima que para el año 2030, su número será prácticamente el doble. La diabetes mellitus se produce en todo el mundo, pero es más frecuente (especialmente el tipo 2) en los países más desarrollados. El mayor aumento de la prevalencia, sin embargo, se espera que se produzca en Asia y en África, donde es más probable que se encuentre la mayoría de pacientes para el año 2030.

Se ha informado de que péptido análogo al glucagón (GLP-1 ), el péptido inhibitorio gástrico (GIP), el glucagón y la ghrelina son péptidos biomarcadores de enfermedades metabólicas tales como la diabetes. La principal fuente de GLP-1 en el cuerpo se encuentra en el intestino. La concentración típica normal en sangre de GLP-1 en circulación está en un intervalo de 3,85 picomolar. GLP-1 posee varias propiedades fisiológicas que lo convierten en sujeto de importantes investigaciones como tratamiento potencial de la diabetes. Gautier, y col., Diabetes Met. 31 :233-42 (2005). Se sabe que GLP-1 aumenta la secreción de insulina desde el páncreas, disminuye la secreción de glucagón desde el páncreas, aumenta la masa de células beta y la expresión génica de la insulina, inhibe la secreción de ácido y el vaciado gástrico del estómago, y disminuye la ingesta de alimento al aumentar la sensación de saciedad. Baggio, y col., J. Gastroenterol. 132:2131-57 (2007). Una vez en circulación, sin embargo, se ha notificado que GLP-1 muestra una semivida biológica corta de aproximadamente 1 ,5-5 minutos (Hui, y col., Eur. J. Endocrinol. 146:863-9 (2002)), debido a la degradación proteolítica causada por las proteasas incluyendo dipeptidil peptidasa (DPP) IV.

La forma activa de GIP es un polipéptido de 42 aminoácidos representado por la secuencia: YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDKHNITGQ ("GIP(i-42)"). GIP(i-42) se sintetiza por las células K que se encuentran en la mucosa del duodeno y del yeyuno del tracto gastrointestinal. Se cree que GIP( 42) induce la secreción de insulina mediante un mecanismo que implica la interacción entre GIP y receptores 7 transmembrana de GIP(i 42) en las células beta pancreáticas. La concentración normal en ayunas de GIP(i 42) en plasma es de aproximadamente 6-12 pmol/l, mientras que la concentración normal no en ayunas es de aproximadamente 80-300 pmol/l. Se ha informado de que GIP(i 42) presenta una semivida en circulación de aproximadamente 5 minutos.

El glucagón, un péptido de 29 aminoácidos, está implicado en el metabolismo de los hidratos de carbono. Producido por el páncreas, se libera cuando el nivel de glucosa en sangre es bajo (hipoglucemia). Se une a los receptores de las células hepáticas (hepatocitos), lo que hace que el hígado convierta el glicógeno almacenado en glucosa y libere a continuación la glucosa en el torrente sanguíneo. Cuando estos almacenes se agotan, el glucagón estimula a continuación la síntesis de glucosa adicional en el hígado. La acción del glucagón es, por tanto, opuesta a la de la insulina, que instruye a las células del cuerpo a capturar la glucosa de la sangre. El glucagón también regula la tasa de producción de glucosa mediante un proceso conocido como lipolisis. La concentración normal típica del glucagón en circulación es 11-17 picomolar. Una vez en circulación, el glucagón tiene una semivida de aproximadamente 8-18 minutos.

Ghrelina es una hormona producida principalmente por las células P/D1 que recubren el estómago humano y las células épsilon del páncreas que estimulan el apetito. La concentración normal típica está también en el intervalo picomolar. Ghrelina es un péptido de 28 aminoácidos que tienen la secuencia NH2 GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR COOH. Una de las formas biológicamente activas de este péptido, conocida como ghrelina adiada, contienen un grupo octanoílo en la Ser3 (es decir, CH3(CH2)6COO ). Este péptido ejerce acciones endocrinas tales como la estimulación de la liberación de la hormona del crecimiento (GH) desde la glándula pituitaria, así como varios efectos fisiológicos tales como la inducción de la adipositis (aumento de tejido graso) y aumento del peso corporal debido a los efectos estimulantes del apetito y aumento de la ingesta de alimento, y estimulación de la secreción de ácido y motilidad gástrica. Kojima, y col., Trends Endocrinol. Metab. 12:118-122 (2001 ); Kojima, y col., Physiol. Rev. 85:495-532 (2005). De esta manera, además de la diabetes, la ghrelina adiada es un biomarcador metabólico conocido para enfermedades relacionadas tales como la pérdida de peso inducida por dieta y el ayuno. Otra forma del péptido ghrelina se conoce como la des-acil-ghrelina, que es una forma metabólicamente inactiva que tiene sus propias funciones incluyendo la modulación de la proliferación celular (Baldanzi, y col., J. Cell Biol. 159:1029-122 (2002); Ariyasu, y col., Endocrinol. 2005:355-4 (2005)) y la adipogénesis (Muccioli, y col., Eur. J. Pharmacol. 498:27-35 (2004)). La concentración plasmática normar de la ghrelina, incluyendo las formas tanto activa como inactiva, oscila de aproximadamente 300 a aproximadamente 700 pg/ml (o de aproximadamente 0,08 a aproximadamente 0, 9 nM o de aproximadamente 0,09 a aproximadamente 0,19 fmol/µ?), y fluctúa con el tiempo. La principal forma en circulación de ghrelina es la des-acil-ghrelina, [Hosoda, y col., Biochim. Biophys. Res. Comm. 279:909-13:2000. y por tanto, la mayoría de esta cantidad no está en la forma del biomarcador metabólico más preciso. Una vez en circulación, la ghrelina tiene una semivida de aproximadamente 30 minutos.

Yi, y col., J. Proteome Res. 6(5):1768-81 (2007), por ejemplo, informa de que la degradación proteolítica de las proteínas séricas y plasmáticas producida por las proteasas intrínsecas tiene durante los primeros minutos de la extracción y manipulación de la muestra (lo que sugiere una rápida degradación proteolítica ex vivo). En una publicación posterior, Yi y col., J. Proteome Res. 7(12):5112-8 (2008), notifican que aunque el descubrimiento de estos marcadores de la enfermedad en el fluido sanguíneo continúa acelerando a medida que la tecnología de la proteómica se haga más potente y tenga una distribución más amplia, se ha conseguido un éxito mucho menos importante en la transferencia de estos descubrimientos a algo de utilidad clínica, alentando un creciente interés para comprender las barreras de esta transición. Además de las cortas semividas y las concentraciones bastante pequeñas de GLP-1 , GIP, glucagón y ghrelina (y en particular sus formas biológicamente activas) en el plasma, surgen complicaciones debidas a la variabilidad preanalítica, especialmente durante la extracción de la sangre y la manipulación temprana de la muestra. Yi (2008) también notifica que en el caso de algunos péptidos biomarcadores, la degradación proteolítica se produce en unos pocos segundos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Ghrelina contiene una estructura principal de péptido y una cadena secundaria que contiene un grupo éster de 8 átomos de carbono, que son susceptibles respectivamente a las proteasas y esterasas endógenas, que están presentes en el plasma humano. Como se muestra en los ejemplos de trabajo, los solicitantes han descubierto que la ghrelina puede estabilizarse de forma más eficaz en muestras de sangre extraída o componente fluido (por ejemplo, suero o plasma) mediante la inclusión de un inhibidor de la lisofosfolipasa (LysoPLA), en oposición a un inhibidor de proteasa o de esterasa. De hecho, los datos de los solicitantes muestran que la presencia adicional de un inhibidor de la esterasa perjudica o disminuye la estabilidad de la ghrelina in vitro. Además del hecho de que la cadena secundaria de la ghrelina es un grupo "éster", estos descubrimientos son sorprendentes e inesperados, especialmente a la vista de informes de que la actividad de LysoPLA se detecta en el estómago y el intestino, pero no en el plasma. De esta manera, la presente invención aborda una estabilidad durante el almacenamiento relativamente más prolongada de la sangre o de un componente de la misma con el fin de llevar a cabo ensayos clínicos fiables tales como la medición de biomarcadores tales como la ghrelina.

De acuerdo con ello, un primer aspecto de la presente invención se dirige a un dispositivo de extracción para extraer y estabilidad sangre completa o un componente de la misma, que incluye un primer extremo y un segundo extremo y al menos una pared interior que define un depósito, donde el depósito contiene un agente de estabilización que incluye un inhibidor de la lisofosfolipasa (LysoPLA). En algunas realizaciones, el agente de estabilización también incluye al menos un inhibidor de otro tipo de enzima que se encuentre normalmente presente en la sangre y degrade marcadores diagnósticos de enfermedades metabólicas. Estas enzimas incluyen esterasas y proteasas. De esta manera, en otras realizaciones, el dispositivo para recogida de sangre también puede incluir un inhibidor de una esterasa, tal como butilcolinesterasa (BChE) o un inhibidor de una acetilcolinesterasa (AChE), y/o un inhibidor de una proteasa {por ejemplo, un inhibidor de una serina proteasa, un inhibidor de una exopeptidasa, un inhibidor de una dipeptidil peptidasa, y combinaciones de dos o más de las anteriores).

Los métodos de fabricar y utilizar los dispositivos para los fines de extraer y almacenar sangre completa o componente(s) de la misma también se proporcionan.

Un aspecto adicional de la presente invención se dirige a un método para diagnosticar una enfermedad o realizar un seguimiento de un tratamiento en un individuo con una enfermedad tal como una enfermedad metabólica (por ejemplo, la diabetes), que comprende medir en el tiempo (o al menos a un tiempo o intervalo de tiempo predeterminado) la presencia o cantidad de uno o más marcadores de la enfermedad, incluyendo la ghrelina biológicamente (metabólicamente) activa, en una muestra de sangre o componente de la misma recogida del paciente mediante el dispositivo de extracción de sangre de la invención. En algunas realizaciones, el método incluye también medir al menos un marcador adicional de la enfermedad metabólica seleccionado entre glucagón, GIP, ghrelina y GLP-1 (que incluye GLP-1 (7-36)NH2 y GLP-1 (7-37)), y combinaciones de dos o más de los anteriores.

También otro aspecto de la presente invención se dirige a un método para realizar un seguimiento de los niveles en sangre de un profármaco que contiene un grupo lateral de éster alifático (por ejemplo, grupo acilo) en un individuo al que se le ha administrado el profármaco, que incluye extraer una mezcla de sangre del paciente usando el dispositivo de extracción de sangre de la invención, y medir la presencia o la cantidad del profármaco y/o un metabolito activo del mismo, en la muestra o componente de la misma. Se pueden medir la presencia o la cantidad del profármaco y un metabolito activo del profármaco. La medida de los niveles en sangre del profármaco y/o del metabolito se puede llevar a cabo más de una vez tal como a intervalos predeterminados.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 es una vista en perspectiva de un dispositivo de extracción de sangre típico de la presente invención.

La Fig. 2 es un gráfico que muestra una comparación de la estabilidad de la acil-ghrelina durante 30 horas en cuatro tubos de extracción de sangre diferentes que contienen: 1 ) el inhibidor de LysoPLA, metil araquidonil fluofosfonato (MAFP), EDTA, el inhibidor de esterasa, tacrina, y los inhibidores de proteasa L-treo-isoleucil-tiazolidida, bestatina y leupeptina (un agente de estabilización de la invención "ISA", designado en la figura como A ); 2) otro agente de estabilización de la invención que incluyó el anticoagulante EDTA y MAFP (designado en la figura como x); 3) EDTA y el inhibidor de esterasa y los inhibidores de proteasa (el agente de estabilización comparativo "CSA" designado en la figura como?); y 4) EDTA solo (designado en la figura como¦), seguido por enriquecimiento con 1 pg/ul de acil-ghrelina.

La Fig. 3 es un gráfico que muestra la estabilidad de la ghrelina con el tiempo en una muestra de sangre extraída de un sujeto humano en ayunas, y extraída y almacenada en tubos enriquecidos (?) y no enriquecidos (¦) con EDTA y en tubos de extracción que contenían un agente de estabilización representativo (incluyendo MAFP como el inhibidor de LysoPLA) de la presente invención (tanto enriquecido ( A ) como no enriquecido (x)).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los dispositivos de extracción de la presente invención se utilizan para extraer y estabiliza sangre completa o un componente de la misma, tales como concentrados de eritrocitos, concentrados de plaquetas, concentrados de leucocitos, y componentes fluidos de la sangre incluyendo plasma y suero.

En sentido amplio, los dispositivos de extracción de muestras de sangre de la presente invención pueden abarcar cualquier dispositivo de extracción incluyendo tubos tales como tubos de ensayo y tubos de centrífuga; dispositivos de extracción de sangre en circuito cerrado, tales como bolsas de extracción; jeringas, especialmente jeringas precargadas; catéteres; microtituladores y otras placas multipocillos; matrices; conducciones; recipientes de laboratorio tales como matraces, matraces giratorios, frascos de giro horizontal, viales, portaobjetos de laboratorio, conjuntos de portaobjetos de laboratorio, cubreobjetos, películas y sustratos porosos y conjuntos; pipetas y puntas de pipeta; recipientes para recoger tejidos y otras muestras bilógicas; y cualquier otro recipiente adecuado para contener una muestra biológica, así como recipientes y elementos implicados en la transferencia de muestras. Los ejemplos y las ilustraciones de algunos de estos dispositivos se han descrito en la patente de los Estados Unidos 7.309.468 concedida a Stevens y col. de titularidad compartida.

La Fig. 1 , que también se ilustra en la patente de los Estados Unidos n° 7.309.468, muestra un dispositivo de extracción de sangre 10 típico, útil en la presente invención, que incluye un recipiente 12 que define una cámara interna o depósito 14. En la realización ilustrada, el recipiente 12 es un tubo hueco que tiene una pared lateral 16, un extremo inferior cerrado 18 y un extremo superior abierto 20. De manera opcional, se proporciona un elemento separador 13 en el interior de la cámara 14 del recipiente. El elemento separador 13 sirve para ayudar a separar los componentes de la muestra de sangre, por ejemplo, mediante centrifugación. El recipiente 12 está dimensionado para recoger un volumen adecuado de sangre. Se necesita un elemento de cierre 22 para cubrir el extremo abierto 20 para cerrar el recipiente 12 cuando se exige un producto estéril. En algunas realizaciones, el tubo está configurado para un tapón roscado. En las realizaciones en las que se realiza el vacío en el tubo, sin embargo, como en el caso en el que el depósito contiene un inhibidor de BChE pero no un inhibidor de proteasa, se utiliza por regla general un accesorio hermético, un tapón de elastómero para contener el vacío durante los periodos de almacenamiento necesarios. Preferentemente, el cierre 22 conforma un sello capaz de cerrar eficazmente el depósito 12 y retener una muestra biológica en la cámara 14. El cierre 22 puede tener una variedad de formas que incluyen, pero sin limitación, cierres de caucho, cierres HEMOGUARD™, juntas metálicas, juntas metálicas con arandela de caucho y juntas de diferentes polímeros y diseños. Una placa protectora 24 puede proteger el cierre 22.

El recipiente 12 puede estar fabricado de cualquier material adecuado para recipientes de laboratorio, incluyendo, por ejemplo plásticos (por ejemplo, poliolefinas, poliamidas, poliésteres, siliconas, poliuretanos, epóxidos, acrílicos, poliacrilatos, poliésteres, polisulfonas, polimetacrilatos, PEEK, poliimida y fluoropolímeros) y productos de vidrio incluyendo vidrio de sílice. Preferentemente, el recipiente 12 es transparente. Los ejemplos de los materiales termoplásticos transparentes adecuados para el recipiente 12 incluyen policarbonatos, polietileno, polipropileno y polietilentereftalato. Los materiales plásticos pueden ser materiales impermeables al oxígeno o pueden contener una capa impermeable o semiimpermeable al oxígeno. Alternativamente, el recipiente 12 puede estar hecho de un material plástico permeable al agua y al aire.

La presión en la cámara 14 se selecciona para extraer un volumen predeterminado de muestra biológica al interior de la cámara 14. Preferentemente, el cierre 22 está hecho de un material resiliente capaz de mantener el diferencial de presión interna entre la presión atmosférica y una presión inferior a la atmosférica. El cierre 22 es uno tal que se puede perforar mediante una aguja 26 u otra cánula para introducir una muestra biológica en el interior del depósito 12 como es conocido en la materia. Preferentemente, el cierre 22 se puede volver a precintar. Los materiales adecuados para el cierre 22 incluyen, por ejemplo, caucho de silicona, caucho natural, caucho de estireno butadieno, copolímeros de etileno/propileno y policloropreno.

Los ejemplos adecuados del recipiente 12 incluyen tubos de pared simple y multicapa. Un ejemplo más específico de un recipiente 12 adecuado se ha descrito en la patente de los Estados Unidos 5.860.937.

El recipiente 12 puede también contener un separador tal como un gel, un separador mecánico u otro tipo de elemento de separación (por ejemplo, papel de filtro o similar). Los separadores son útiles para la preparación del plasma sanguíneo, específicamente para separar el plasma de la sangre completa de un ser humano o animal. Deseablemente, el gel es una formulación de gel polimérico tixotrópico. El gel puede ser un homopolímero o un copolímero y puede incluir geles basados en silicona tales como, por ejemplo, polisiloxanos, o geles basados en hidrocarburos orgánicos tales como, por ejemplo, poliacrílicos, poliésteres, poliolefinas, cis-polibutadienos oxidados, polibutenos, mezcla de aceite de soja epoxidizado e hidrocarburos clorados, copolímeros de diácidos y pronodioles, ciclopentadienos hidrogenados y copolímeros de alfa olefinas con dialquilmaleatos. Los ejemplos de separadores mecánicos que se pueden utilizar en la presente invención se han descrito en las patentes de los Estados Unidos n° 6.516.953; 6.406.671 ; 6.409.528; y 6.497.325.

El recipiente 12 también puede adaptarse para separar por centrifugación los linfocitos y monocitos de fases más pesadas de una muestra de sangre completa. En dichas realizaciones, los dispositivos puede también contener un medio líquido con gradiente de densidades y un elemento para evitar la mezcla del medio líquido con gradiente de densidades con una muestra se sangre antes de la centrifugación. Un ejemplo de un tubo de extracción de linfocitos/monocitos adecuados se ha descrito en la patente de los Estados Unidos con n° 5.053.134.

Además de la realización ilustrada en la Fig. 1 , otros tubos de extracción de sangre comerciales adecuados para su uso en la presente invención incluyen los siguientes, todos ellos comercializados por Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, N.J., donde todos los registros y marcas registradas pertenecen a Becton, Dickinson and Company: tubos para hematología VACUTAINER® (por ejemplo, los números de catálogo 367650-1 367661 , 6405, 6385, 6564, 367653, 367665, 367658, 367669, 6450-8 6535-37 y 367662); tubos VACUTAINER® K2EDTA (por ejemplo, los números de catálogo 367841-2 367856 y 367861 ); tubos VACUTAINER® PST {por ejemplo, los números de catálogo 367793-4 6698, 6595 y 6672); tubos VACUTAINER® CPT (por ejemplo, los números de catálogo 362753 y 362760-1 ); tubos VACUTAINER® SST (por ejemplo, los números de catálogo 367782-89 6509-17 y 6590-92); y tubos VACUTAINER® ACD (por ejemplo, los números de catálogo 367756, 364012 y 4816), y los tubos sin vacío BD Microtainer® Tubes con cierre BD Microgard™ Closure (por ejemplo, 365987, 365965, y 365974) o los tubos convencionales BD Microtainer® (por ejemplo, 365956, 365957, 365958, 365959, 365971 , y 365973). Muchos tubos de extracción de sangre comerciales tienen volúmenes normalizados comprendidos de forma típica entre 250 microlitros hasta, e incluyendo aproximadamente 10,0 mi, y en algunos casos hasta 16 mi. Los volúmenes típicos incluyen 250, 400, y 500 microlitros, así como 2,0 mi, 3,5 mi 4,0 mi 5,0 mi 8,0 mi 8,5 mi y 0,0 mi.

En otras realizaciones, el dispositivo puede comprender un depósito integrado en el interior de un cartucho de ensayo, siendo el depósito capaz de contener un volumen de sangre completa comprendido entre 2 y 200 microlitros, más preferentemente 10-150 microlitros. Dichos cartuchos se comercializan por ejemplo con el nombre comercial i-STAT Point of Care System por Abbott Laboratories (Abbott Park, Illinois), y se pueden utilizar con un analizador manual que puede interactuar con el cartucho. Los ejemplos de dichos cartuchos y analizadores manuales útiles con la presente invención incluyen el cartucho i-STAT CHEM8+ y el analizador manual i-STAT® 1 , respectivamente. Dichos dispositivos se enseñan en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n° 5.096.669, 5.112.455, 5.821.399, 5.628.961 , 7.419.821 , 6.750.053, y US D337.164.

Las lisofosfolipasas (LysoPLA) son enzimas que hidrolizan los lisofosfolípidos (LysoPL) y específicamente en los enlaces éster del ácido carboxílico, que son intermedios de tipo detergente en el metabolismo de los fosfolípidos y desempeñan papeles fundamentales en muchos procesos fisiológicos y patológicos. La lisofosfatidilcolina (LysoPC), un constituyente normal de las membranas celulares y que se considera que actúa como mensajero lípido, transduciendo las señales iniciadas en los receptores de la membrana, es un sustrato endógeno para LysoPLA. Las secuencias de aminoácidos y los correspondientes ácidos nucleicos de las LysoPLA humanas se conocen en la materia. Consulte, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n° 5.858.756; 6.004.792 y 7.294.496. De acuerdo con una evidencia presentada en la patente de los Estados Unidos 7.294.496, el ARNm de LysoPLA está ampliamente distribuido en muchos tejidos, siendo el corazón, la placenta y el músculo esquelético los más abundantes, seguido por el hígado, páncreas, riñon, cerebro y pulmón, y en otra pieza de evidencia (que contiene mensajeros de más tejidos), se observaron modelos similares para la intensidad relativa aunque, con variaciones en unos pocos tejidos, siendo la placenta y los testículos las fuentes más abundantes de hLysoPLA, seguido por las glándulas suprarrenales y las glándulas salivares, hígado, corazón, músculo esquelético, y tráquea colon. También se ha notificado que las lisofosfolipasas también se encuentran en numerosas isoformas.

Los ejemplos representativos de inhibidores de LysoPLA que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención incluyen octilfosfonofluoridato de etilo, dodecilfosfonofluoridato de isopropilo, 2-óxido de n-dodecil benzodioxafosforina, palmitoil carnitina, bromoenol lactona, palmitil trifluorometil cetona, y metil araquidonil fluorofosfonato (MAFP). Se pueden identificar otros inhibidores usando métodos de ensayo conocidos en la materia. Consulte, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 7.294.496.

El inhibidor de LysoPLA está presente en el dispositivo de extracción en una cantidad eficaz para estabilizar diferentes proteínas endógenas que pueden estar presentes en la muestra biológica, por ejemplo, ghrelina, y otras proteínas y ésteres que requieren un grupo éster alifático para su actividad biológica. De esta manera, además de la ghrelina, que es un marcador de enfermedades metabólicas tales como la diabetes, los dispositivos de extracción proporcionan la estabilización de otros neuropéptidos. Los inhibidores de LysoPLA actúan inhibiendo la escisión del grupo éster alifático. La determinación de la cantidad del inhibidor de LysoPLA a incluir en el dispositivo de extracción de sangre depende de farios factores entre los que se incluyen la potencia, solubilidad en agua, el volumen del dispositivo de extracción de sangre, y la naturaleza y extensión de las interacciones no específicas (por ejemplo, debidas a la presencia de otras proteínas en la sangre tales como la albúmina sérica). De acuerdo con ello, para los fines de la presente invención, la cantidad del inhibidor de LysoPLA (y las cantidades de agentes estabilizadores adicionales que puedan estar presente) se expresa de forma más cómoda en términos de un intervalo de concentración (a partir del cual se puede calcular con facilidad la cantidad real del inhibidor). La concentración del inhibidor de LysoPLA está comprendida por lo general de aproximadamente 0,1 µ? a aproximadamente 10 mM, y en algunas realizaciones de aproximadamente 10 uM a aproximadamente 1 mM, y en algunas realizaciones de aproximadamente 100 uM a aproximadamente 1 mM (es decir, 10.000.000 nM). Todos los subintervalos incluidos en dichos intervalos también se contemplan. El término "aproximadamente" tal como se usa en relación a todos los valores de concentración divulgados en el presente documento se refiere a una variabilidad (valor más/menos) 50 %.

Aunque sin pretensión de quedar vinculado por teoría alguna, los presentes inventores consideran que el inhibidor de LysoPLA puede proporcionar un beneficio doble, ya que al proteger el grupo éster alifático de la escisión mediante LysoPLÁ, las proteasas intrínsecas normalmente encontradas en la sangre tendrían un impedimento estérico para degradar la cadena de aminoácidos del péptido. Dependiendo de factores tales como la naturaleza del analito, el formato de ensayo y el flujo de trabajo (es decir, manipulación y almacenamiento de la muestra de sangre extraída antes del análisis), los dispositivos de extracción de sangre de la presente invención pueden proporcionar estabilidad a marcadores bioquímicos tales como ghrelina durante horas e incluso uno o más días más que los dispositivos similares que no contienen el inhibidor de LysoPLA.

En algunas realizaciones, el recipiente extractor de sangre de la invención puede incluir al menos un agente de estabilización adicional, tal como un inhibidor de una esterasa, por ejemplo, carboxiesterasas tales como butilcolinesterasa y acetilcolinesterasa. Estos agentes de estabilización pueden proporcionar protección contra la degradación ex vivo de proteínas y péptidos que requieren un grupo éster alifático para su actividad biológica. De esta manera, además de la ghrelina, que es un marcador de enfermedades metabólicas tales como la diabetes, los inhibidores de la esterasa pueden proporcionar una mejora en la estabilización de otros neuropéptidos. En algunas realizaciones, sin embargo, el agente estabilizante (y el dispositivo en su conjunto), no incluyen un inhibidor de la esterasa.

Se cree que la butilcolinesterasa (BChE)(E.C. 3.1.1.8), también conocida como colinesterasa sérica o plasmática, desempeña un papel en la capacidad del cuerpo para metabolizar la cocaína y otros fármacos tales como succinilcolina y aspirina. Consulte, Lockridge, "Genetic Variants of Human Serum Butyrylcholinesterase influence the metabolism of the muscle relaxant succinylcholine." En, Kalow (ed.) Pharmacogenetics of Drug Metabolism New York: Pergamon Press, Inc, en las pp. 15-50. BChE suele estar presente en el plasma humano en una cantidad de aproximadamente 5 mg/l (o aproximadamente 5 U/ml). Los inhibidores de BChE útiles en la presente invención tienen un valor de Ki no superior a aproximadamente 0,5 µ? (500 nM), o en algunas realizaciones un Ki no superior a aproximadamente 0,05 µ? (50 nM), o incluso en otras realizaciones, un Ki no superior a aproximadamente 0,010 µ? (10 nM) (e incluyendo en el anterior todos los subintervalos). Los Ki son variables cinéticas (opuestas a las propiedades físicas como el peso molecular, puntos de fusión y ebullición, etc.) y, como tales, pueden estar sometidos a una variación relativamente amplia, especialmente dependiendo de la metodología utilizada para determinar este valor. De esta manera, el término "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento relacionado con los valores de Ki se refiere a la variabilidad (es decir, un valor más/menos) el 50 %.

Un inhibidor de BChE útil en la presente invención es el compuesto 9- amino-1 ,2,3,4 tetrahidroacridina, también conocida como tacrina (y los derivados de la misma). Consulte, la patente de los Estados Unidos n° 4.816.456. La tacrina es un inhibidor de la colinesterasa de acción central autorizado por el organismo estadounidense responsable de fármacos y alimentos (FDA) para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Está comercializado por Sciele Pharma con el nombre comercializado de COGNEX. Los ejemplos representativos de derivados de tacrina que pueden ser adecuados para su uso en la presente invención se han enseñado en la patente de los Estados Unidos n° 4.754.050, como se muestra en la siguiente fórmula, donde n es 1 , 2 o 3; X es hidrógeno, alquilo inferior, alcoxi inferior, halógeno, hidroxi, nitro, trifluorometilo, NHCOR2 donde R2 es alquilo inferior, o NR3R4 donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo inferior; R es hidrógeno o alquilo inferior; R1 es hidrógeno, alquilo inferior, di-alquilo inferior-aminoalquilo inferior, arilalquilo inferior, diarialalquilo inferior alquilo, furilalquilo inferior, tienilalquilo inferior, arilalquilo inferior con puente de oxígeno, diarilalquilo inferior con puente de oxígeno, furilalquilo inferior con puente de oxígeno o ienilalquilo inferior con puente de oxígeno; Y es C=0 o CR5OH donde R5 es hidrógeno o alquilo inferior; Z es CH2 o C=CR6R7 donde R6 y R7 son independientemente hidrógeno o alquilo inferior; o Y y Z tomados conjuntamente son CR5=CH donde CR5 y CH corresponden a Y y Z respectivamente; un antípoda óptico del mismo, o una de sus sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables.

Los derivados de tacrina específicamente abarcados por esta fórmula incluyen los siguientes: 9-Amino-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-metilacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dih¡dro-6-metoxiacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-6-fluoroacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino-6-cloro-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino-7-cloro-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-d¡h¡dro-6-trifluorometilacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino-3,4-dihidro-7-nitroacridin-1 (2H)-ona; 7,9-Diamino-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; N-[9-Amino-3,4-dihidro-1 (2H)-oxoacr¡din-7-il]acetamida; 3,4-Dihidro-9-metilaminoacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-metilamino-7-nitroacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-propilam¡noacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[2-(dimetilamino)etil]aminoacridin-1 (2H)-ona; 9-bencilamino-3,4-dihidroacr¡din-1 (2H)-ona; 9-bencilamino-3,4-d¡hidro-6-metilacridin-1 (2H)-ona; 9-bencilamino-3,4-dihidro-6-fluoroacridin-1(2H)-ona; 9-bencilamino-6-cloro-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-bencilamino-3,4-dihidro-6-trifluorometilacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-metilbencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-D¡hidro-9-(3-metilbencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-metilbencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-metoxibencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-metoxibencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-D¡h¡dro-9-(4-metox¡bencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-fluorobencilam¡no)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-fluorobenc¡lamino)acridin- 1 (2H)-ona; 3,4-D¡h¡dro-9-(4-f luorobencilamino)acridin-1 (2H)-ona; 6-cloro-3,4-dihidro-9-(4-fluorobencilamino)acridin-1(2H)-ona; 9-(2-clorobencilamino)-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; 9-(3-clorobencilamino)-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; 9-(4-clorobencilamino)-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[(2,3,4,5,6-pentafluorobencil)amino]acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(2-trifluorometilbencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-6-fluoro-9-(2-trifluorometilbencilamino)acridin-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-trifluorometilbencilamino)acridin-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4-trifluorometilbencilamino)acridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-fenetilaminoacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4,4-difenilbutil)aminoacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(4,4-difenilbutilamino)-6-trifluorometilacridin-1(2H)-ona; 9-[4,4-Bis(3-fluorofenil)butilamino]-3,4-dihidroacridin-1(2H)-ona; 9-[4,4-bis(4-fluorofenil)butilamino]-3,4-Dihidroacridin-1(2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-(3-fenoxipropilamino)acridin-1(2H)-ona; 9-[2-[Bis(4-fluorofenil)metoxi]etilamino-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; 9-[4-(benciloxi)bencilamino]-3,4-dihidroacridin-1 (2H)-ona; 3,4-Dihidro-9-[(2-tienil)metilamino]acridin-1(2H)-ona; 9-Amino-2,3-dihidro-ciclopenta[b]quinolin-1-ona; 9-Amino-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-6-cloro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-Amino-7-cloro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1 -ol; 9-Amino-6-metoxi-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-Amino-6-fluoro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; g-Amino-I ^.S^-tetrahidro-B-trifluorometilacridin-l-ol; 9-Metilamino-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-Propilam¡no-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-[2-(Dimetilamino)etil]amino-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -o; 9-bencilamino- ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-bencilamino-6-metil-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-bencilam¡no-6-fluoro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-benc¡lamino-6-cloro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-bencilam¡no-1 ,2,3,4-tetrah¡dro-6-trifluorometilacrid¡n-1-o; 9-(2- etilbenc¡lamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-(3-Metilbencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(4-Metilbencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(2-Metoxibencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(3-Metoxibencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(4-Metoxibencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(2-Fluorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(3-Fluorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(4-Fluorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 6-cloro-9-(4-fluorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(2-clorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-(3-clorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(4-clorobencilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 1 ,2,3,4-Tetrahidro-9-(2-trifluorometilbencil)aminoacridin-1 -ol; 6-Fluoro-1 ,2,3,4-tetrahidro-9-(2-trifluorometilbencilamino)acridin-1 -ol; 1 ,2,3,4-Tetrahidro-9-(3-tr¡fluoromet¡lbencilamino)acridin-1 -ol; 1 ,2,3,4-Tetrahidro-9-(4-trifluorometilbencilamino)acridin-1-ol; 9-[(2, 3,4,5, 6-Pentafluorobencil)amino]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-Phenetilamino-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(4,4-difenilbutil)amino-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1 -ol; 9-[4,4-Bis(3-fluorofenil)butilamino]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-[4,4-Bis(4-fluorofen¡l)butilamino]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-(3-fenoxipropilamino)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-[[2-[Bis(4-fluorofenil)metoxi]etil]amino]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-[4-(benciloxi)bencilamino]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l -ol; 9-[(2-Tienil)metilamino]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-1-ol; 9-Amino-3,4-dihidroacridina; 9-Amino-1-metil-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-l-ol; 9-Amino-3,4-dihidro-2-metileneacridin-1 (2H)-ona; 9-Amino- 1 ,2,3,4-tetrahidro-ciclopenta[b]quinol¡n-1 -ol; 2-(3-Oxoclohexen-1 -il)am¡nobenzonitrilo; y 4-cloro-2-(3-oxoc¡clohexen-1 -il)aminobenzon¡trilo.

Otros inhibidores de la butirilcolinesterasa que puede ser adecuado para su uso en la presente invención incluyen los dímeros de tacrina tales como etopropazina (es decir, ?,?,? dietil-a-metil-10H-fenotiazina-10-etanamina; 10-(2 dietilamino-2-metiletil)fenotiazina; o fenopropazina), y derivados de los mismos. Consulte, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos n° 2.607.773 y 4.833.138. Etopropazina, sal de clorhidrato, ha sido autorizada por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.

Otros inhibidores de la butirilcolinesterasa incluyen híbridos de tacrina y (-)-huperzina A (que es un alcaloide enantiomérico de licodina aislado a partir del pie de lobo Huperzia serrata de la especie Lycopodium, Huperziaceae). Los ejemplos de los híbridos de tacrina Huperzina A se conocen en la materia como los Compuestos 5a, 5b y 5c, y Huprina X. Sus correspondientes nombres químicos son los siguientes: ((9E)-N1-(7-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil)-9-etilideno-4,4,7-trimetilbiciclo[3.3.1]non-6-en-1 ,3-diamina)(5a); ((9E)-N1-(7-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil)-9-etilideno-47-metilbiciclo[3.3.1]non-6-en-1 ,3-diamina)(5b); Ester metílico del ácido ((9E)-N1-(7-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptilamino)-9-etilideno-3-metilbiciclo[3.3.1]non-3-en-1-carboxílico)(5c); y (1S)-7-cloro-15-etil-10-azatetraciclo[11.3.1.0?{2,11}.0A{4,9}]heptadeca-2(1 1),3,5,7,9,14-hexaen-3-amina) (Huprina X). Los métodos para sintetizar estos compuestos se han descrito en Gemma, y col., J. Med. Chem. 49(11 ), 3421-25 (2006) (5a, 5b y 5c), y Camps, y col., Mol. Pharmacol. 57:409-17 (2000) (Huprina X).

La concentración de BChE está comprendida por lo general de aproximadamente 5 µ? a aproximadamente 500 mM (es decir, 5 x 108 nM), y en algunas realizaciones de aproximadamente 0,5 uM a aproximadamente 50 mM, e incluso en otras realizaciones, de aproximadamente 0,1 µ? a aproximadamente 10 mM. Todos los subintervalos incluidos en dichos intervalos también se contemplan. Como en el caso de los valores de Ki, el término "aproximadamente" tal como se usa en relación a todos los valores de concentración divulgados en el presente documento se refiere a una variabilidad (valor más/menos) 50 %.

El agente de estabilización también puede incluir un inhibidor de otro tipo de esterasa sérica, y especialmente un inhibidor de otra B-esterasa (de la que BChE es un miembro). Estas esterasas incluyen la acetilcolinesterasa (AChE)(EC 3.1.1.7) y la carboxiesterasa no específica (EC 3.1.1.1 ). Los inhibidores de la AChE actúan sobre la colinesterasa e inhiben la descomposición de la acetilcolina que actúa en el cuerpo como neurotransmisor. Algunos inhibidores de BChE tales como tacrina y huperazina A son conocidos por inhibir también la acetilcolinesterasa. Se ha notificado que tacrina tiene una Ki para AChE de 6,9 nm (Bencharit, y col., Chem. Biol. 10:341-9 (2003)). Se ha notificado que huperzina A tiene una Ki para AChE de 47 nm (Gemma, y col., J. Med. Chem. 49:3421-5 (2006)). Dado que BChE constituye una parte significativa de la actividad esterasa total en el suero humano (es decir, aproximadamente 5 mg/l de BChE comparada con 0,008 mg/l para AChE), la inclusión de sus inhibidores en el tubo de extracción de sangre es opcional.

Los Ki de los inhibidores de la AChE adecuados para su uso en la presente invención son normalmente de aproximadamente 500 nm o inferiores; y en otras realizaciones, inferiores a aproximadamente 400 nm, 300 nm, 200 nm, 100, nm, 50 nm o 10 nm. Tal como se divulga en el presente documento, los valores de Ki para un inhibidor de AChE dado se pueden determinar de acuerdo con técnicas de ensayo normalizadas.

De esta manera, otros inhibidores de AChe que pueden ser útiles en la presente invención incluyen los siguientes: Huprina X ((1S)-7-cloro-15-etil-10-azatetraciclo[11.3. .0?{2,11}.0A{4,9}]heptadeca-2(11),3,5,7,9,14-hexa-en-3-amina)(Ki de 0,026 nm); Dímero de tacrina 4a (met¡lbis[3-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amina) (Ki de 0,06 nm); Dímero de tacrina 4d (2-{bis[3-(1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amino}etan-1-ol | N,N-Bis[3-[(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]propil]-N-hidroxietilamina) (Ki de 0,65 nm); Derivado de tacrina 2 (6,8-dicloro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 1.0 nm); Dímero de tacrina 3b (Análogo homodimérico de tacrina 3b | N-[7-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina | Compuesto de tacrina homobivalente 3a) (Ki de 1 ,3 nm); Dímero de tacrina 4c (N,N-Bis[3-[(1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]propil]-N-alilam¡na| prop-2-en-1-ilbis[3-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amina) (Ki de 1 ,6 nm); Dímero de tacrina 3c (Análogo homodimérico de tacrina 3c | N-[8-(1 ,2,3,4-tetrah¡droacridin-9-ilamino)octil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 1 ,9 nm); Dímero de tacrina 4b (N.N-BistS-KI ^.S^-tetrahidroacridin-g-i aminoJpropilJ-N-etilamina | etilbis[3-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]amina) (Ki de 2,8 nm); Compuesto de tacrina heterobivalente 3c (N-{7-[(6,8-dicloro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]heptil}-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 6,0 nm); huperzina A-híbrido de tacrina 5c (Ester metílico del ácido (9E)-7-(7-(1 ,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)heptilamino)-9-etilideno-3-metilbiciclo[3.3.1]non-3-en-1-carboxílico| (1S)-9-et¡lideno-3-metil-7-{[7-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil]amino}biciclo[3.3.1]non-3-en-1-carboxilato de metilo) (Ki de 6,4 nm); Dímero de tacrina 4j (N-Metil-N-(1 ,2,3,4-tetrahidroacr¡din-9-il)-N-[3-(1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)propil]-1 ,3-propanediamina | metil[3-(1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)propil][3-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)propil]amina) (Ki de 9,1 nm); huperzina A-híbrido de tacrina 5b ((9E)-N1-(7-(1 ,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil)-9-etilideno-7-metilbiciclo[3.3.1]non-6-en-1 ,3-diamina | N-(7-{[(1 S)-1 -amino-9-etilideno-7-metilbiciclo[3.3.1 ]non-6-en-3-il]amino}heptil)-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-am¡na) (Ki de 15,70 nm); huperzina A-híbrido de tacrina 5a (9E)-N1-(7-(1 ,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)heptil)-9-etilideno-4,4,7-trimetilbiciclo[3.3.1]non-6-en-1 ,3-diamina | N-(7-{[(1S)-1-amino-9-etilideno-4,4,7-trimetilbiciclo[3.3.1 ]non-6-en-3-il]amino}heptil)-1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 16,50 nm); AP2238 3-(4-{[bencil(metil)amino]metil}-fenil)-6,7-dimetoxi-2H-2-cromenona | 3-(4- {[bencil(metil)amino]metil}fenil)-6,7-dimetoxi-2H-cromen-2-ona) (Ki de 21 ,70 nm); Dímero de tacrina 4i (N-(1 ,2,3,4-Tetrahidroacridin-9-il)-N-[8-(1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)oct-1-il]amina | N-[8-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)octil]- 1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 30 nm); Compuesto de tacrina heterobivalente 3g (6,8-dicloro-N-[7-(1 ,2,3,4-tetrahidroacr¡din-9-ilsulfanil)heptil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacrid¡n-9-amina) (Ki de 41 nm); Dímero de tacrina 4m (N-[3-(I ^.S^-Tetrahidroacridin-g-ilaminoJpropill-N-^-ÍI ^.S^-tetrahidroacridin-Q-ilsulfanil)butil]acetamida) (Ki de 47 nm); 9-Amino-6-cloro-2-Metoxiacridina (6-cloro-2-metoxiacridin-9-amina) (Ki de 49 nm); Dímero de tacrina 4k (N-[3-(1 , 2,3,4-Tetrahidroacridin-9-ilamino)propil]-N-[3-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)propil]acetamida) (Ki de 50 nm); Compuesto de tacrina heterobivalente 3¡ (N-[6-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfan¡l)hexil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 100 nm); Compuesto de tacrina homobivalente 3b (6,8-dicloro-N-{7-[(6,8-dicloro-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-il)amino]heptil}-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-am¡na) (Ki de 150 nm); Dímero de tacrina 3a (N-[5-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilamino)pentil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 210 nm); Dímero de tacrina 4g (N-[8-(1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)octil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina) (Ki de 250 nm); Compuesto de tacrina heterobivalente 3f (N-{7-[(6,8-dicloro-I ^.S^-tetrahidroacridin-g-i sulfanillhepti^-I ^.S^-tetrahidroacridin-g-amina) (Ki de 290 nm); Compuesto basado en 1 ,2-Diona, 8 (1 ,2-dihidronaftaleno-1 ,2-diona | 1 ,2-naftoquinina) (Ki de 320 nM); Dímero de tacrina 4f (N-[7-(1 , 2,3,4-tetrahidroacridin-9-ilsulfanil)heptil]-1 ,2,3,4-tetrahidroacridin-9-amina | Compuesto de tacrina heterobivalente 3e) (Ki de 340 nm); y 6,9-Diamino-2-etoxiacridina (7-etoxiacridina-3,9-diamina) (Ki de 490 nm). Los valores de Ki divulgados en el presente documento para los inhibidores de AchE anteriormente mencionados se han notificado en Gemma, y col., J. Med. Chem. 49:3421-5:2006; Campiani, y col., J. Med. Chem. 48:1919-29:2005; Wong, y col., J. Am. Chem. Soc. 125:363-73:2003; Savini, y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 11 :1779-82:2001 ; Piazzi, y col., J. Med. Chem. 46:2279-82:2003; Bencharit, supra.; e Hyatt, y col., J. Med. Chem. 50:5727-34(2007).

Otros ejemplos adicionales de inhibidores de AChe que pueden ser útiles en la presente invención incluyen los siguientes: organofosfatos (por ejemplo, metrifonato, ecotiofato, fluorofosfatos de diisopropilo, ciclosarina, dimetoato, sarina, soman, tabun, VX, VE, VG, VM, diazinona malatión y paratión); carbamatos (por ejemplo, fisostigmina, neostigmina, piridostigmina, ambenonium, demarcarium, rivastigmina, aldicarb, bendiocarb, bufencarb, carbarilo, carbendazim, carbetamida, carbofurano, clorbufam, cloroprofam, etiofencarb, formetanato, metiocarb, metomilo, oxamilo, fenmedifam, pinmicarb, pirimicarb, propamocarb, profamo y propoxur); derivados de fenantreno (por ejemplo, galantamina); piperidinas (por ejemplo, donepezilo (E2020) (Li de 2,9 nm)); edrofonio; y compuestos naturales (por ejemplo, galantamina y Onchidal).

Puesto que algunos inhibidores de BChE también muestran una potente actividad inhibidora de AChE, las realizaciones de la presente invención pueden incluir un único inhibidor de esterasa que posea actividad inhibidora tanto de BChE como de AChE.

La concentración del inhibidor de esterasa sérica adicional que puede estar presente en el dispositivo de extracción de sangre está comprendido por lo general de aproximadamente 0,1 µ? a aproximadamente 70 mM, y en algunas realizaciones, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 7 mM.

El agente de estabilización también puede incluir un inhibidor de la proteasa. Los inhibidores de la proteasa útiles en la presente invención pueden mostrar actividad inhibitoria frente a una o más clases de proteasas, entre las que se incluyen, por ejemplo, serina proteasas, exopeptidasas y dipeptidil peptidasas. De esta manera, el dispositivo puede contener un combinado de dos o más de estos inhibidores, incluyendo por ejemplo, un inhibidor de una serina proteasa y un inhibidor de una exopeptidasa, un inhibidor de una serina proteasa y un inhibidor de una dipeptidil peptidasa, un inhibidor de una exopeptidasa y un inhibidor de una dipeptidil peptidasa, y un inhibidor de una serina proteasa, un inhibidor de una exopeptidasa y un inhibidor de una dipeptidil peptidasa. Consulte, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n° 7.309.468, concedida a Stevens, y col., Los ejemplos representativos de inhibidores de la serina proteasa incluyen analgésicos, aprotinina, antitrombina, quimostatina, DFP, elastatinal, APMSF, fluoruro de fenilmetiisulfonilo (PMSF), AEBSF, TLCK, TPCK, leupeptina, tripsina e inhibidor de la tripsina de soja. Las concentraciones del inhibidor de la serina proteasa están comprendida por lo general de aproximadamente 0,1 µ? a aproximadamente 100 µ?, Los ejemplos representativos de inhibidores de exopeptidasa que pueden ser útiles en la presente invención incluyen amastatina, bestatina, diprotina A y diprotina B. Las concentraciones del inhibidor de exopeptidasa están comprendida por lo general de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM.

La actividad de la dipeptidil peptidasa (que incluye actividades de tipo DPP IV y DPP IV) presentes en la circulación es fuertemente específica para liberar dipéptidos desde el extremo N de péptidos biológicamente activos que tienen prolina o alanina en la penúltima posición de la secuencia del extremo N del péptido sustrato. Los polipéptidos insulinotrópicos dependientes de glucosa GIP-i-42 y GLP 17-36 potencian la secreción de insulina inducida por glucosa desde el páncreas (incretinas), son sustratos de DPP IV. La enzima DPP IV libera los dipéptidos tirosinil alanina e histidil alanina, respectivamente, desde los extremos N de dichos péptidos tanto in vitro como in vivo. Mentlein, y col., Eur. J. Biochem. 214, 829 (1993). Los ejemplos representativos de inhibidores de la dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) que pueden ser útiles en la presente invención incluyen vildagliptina, sitagliptina, saxagliptina, linagliptina y alogliptina. Otros inhibidores de DPP IV incluyen compuestos de dipéptido formados a partir de un aminoácido tal como isoleucina, Asn, Asp, Glu, His, Pro, y Val, y un grupo tiazolinida o pirrolidina, y sus estereoisómeros, por ejemplo, las formas L-treo y L-alo de los mismos, y sales orgánicas e inorgánicas de los mismos (por ejemplo, fosfato, sulfato, acetato, tartrato, succinato y fumarato). Los ejemplos específicos de compuestos de dipéptido incluyen L-treo-isoleucil-tiazolidida, L-alo-isoleucil-tiazolidida, L-treo-isoleucil-pirrolidida, y L-alo-isoleucil-pirrolidida. Las concentraciones del inhibidor de dipeptidil peptidasa están comprendidas por lo general de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 1 mM.

El agente de estabilización puede contener inhibidores adicionales de otras clases de proteasas. De esta manera, en otras realizaciones, los dispositivos de extracción de sangre pueden también contener un inhibidor de una cisteína proteasa (por ejemplo, IAA (ácido indoleacético ) y E-64), una serina/cisteína proteasa (por ejemplo, leupeptina, TPCK, PLCK HCL, 2-heptanona HCL, y analgésico HCI), una aspártico proteasa {por ejemplo, pepstatina, y VdLPFFVdL), una metaloproteasa (por ejemplo, EDTA, bestatina, 1 ,10-fenantrolina y fosforamodon), una tiolproteasa, una aspártico/calpaína proteasa (por ejemplo, pepstatina, N acetil-leu-leu-norleucinal y N-acetil-leu-leu-metioninal), una caspasa, una endopeptidasa (por ejemplo, a2-macroglobulina (considerada como un inhibidor universal de endopeptidasas), a1-anti-tripsina y tiorfano), y combinaciones de dos o más de los anteriores. Los ejemplos adicionales de inhibidores de la proteasa incluyen inhibidor de tripsina de soja o haba de Lima, inhibidor de proteasa pancreática, ovostatina de clara de huevo y cistatina de clara de huevo. Las personas expertas en el campo de la proteómica apreciarán que un inhibidor dado puede mostrar actividad inhibidora contra una o más proteasas del mismo tipo de proteasas, así como actividad inhibidora contra una o más proteasas de diferente tipo de proteasas. Bestatina y amastatina, por ejemplo, muestran actividad inhibidora contra metaloproteasas y contra exopeptidasas a la vez.

Las realizaciones de la presente invención que emplean una pluralidad de agentes de estabilización, por ejemplo, además del inhibidor LusoPLA un inhibidor de proteasa, o un inhibidor de BChE y un inhibidor de proteasa), también se van a denominar en el presente documento como una combinación de agentes estabilizantes.

El agente estabilizante puede estar presente en cualquier forma adecuada, incluyendo líquidos (por ejemplo, disoluciones y suspensiones) y sólidos (por ejemplo, aglomerados, comprimidos, cápsula, material secado por pulverización, material secado por criodesecación, polvo, partículas, cristales y material liofilizado) y semisólidos (por ejemplo, gel). La liofilización puede ser particularmente útil ya que proporciona una buena estabilidad (por ejemplo, en términos de maximizar la vida en almacenamiento del agente de estabilización) y también permite la posterior esterilización. Por ejemplo, el agente estabilizante se puede introducir en el recipiente del dispositivo en forma de una composición líquida, y a continuación liofilizarse por técnicas normalizadas. La criodesecación, por ejemplo, conlleva congelar la composición líquida y a continuación calentarla lentamente tras la congelación, aplicando simultáneamente vacío, de forma que el polvo criodesecado permanece en el dispositivo de recogida. Se pueden utilizar aditivos como PVP o trehalosa a la composición líquida antes del criodesecado para facilitar la aglomeración del agente de estabilización y la reconstitución de los agentes liofilizados tras entrar en contacto con la sangre. El secado a vacío también se puede usar tras añadir la composición líquida. En otras realizaciones, el agente de estabilización se conforma en un líquido o aerosol sólido y se pulveriza sobre una o más superficies en el interior del recipiente. El encapsulamiento o formulación del agente de estabilización en forma de un comprimido le protege de la exposición a la luz y evita otras interacciones indeseables entre los inhibidores y otros elementos del recipiente. Los materiales de encapsulación y los excipientes útiles en la fabricación de comprimidos y cápsulas que se disuelven tras la extracción de la muestra son bien conocidos en la materia.

Además de colocarse en el depósito, el agente de estabilización puede ubicarse en cualquier superficie del dispositivo de extracción que entre en contacto con la sangre extraída. Por ejemplo, el agente de estabilización también puede colocarse en tapones y juntas para cerrar el dispositivo, o bien sobre las piezas mecánicas, u otras inserciones colocadas en el interior del dispositivo.

Además del agente de estabilización, el dispositivo de la presente invención puede contener también medios portadores {por ejemplo, agua o alcohol), medios de estabilización o reconstitución (por ejemplo, polivinilpirrolidona, trehalosa, manitol, etc.) y/o uno o más aditivos adicionales para tratar la muestra biológica. Los aditivos típicos incluyen fenol, mezclas de fenol y cloroformo, alcoholes, aldehidos, cetonas, ácidos orgánicos, sales de ácidos orgánicos, sales de haluros de metales alcalinos, agentes quelantes orgánicos, colorantes fluorescentes, anticuerpos, agentes aglutinantes, anticoagulantes como citrato de sodio, heparina, EDTA y sus sales (por ejemplo, EDTA potasio), antioxidantes, agentes reductores y agentes tamponantes. Preferentemente, el portador y los aditivos no degradan las proteínas. Cuando los inhibidores están en forma de comprimido, materiales desintegrantes de comprimidos farmacéuticos, conocidos de los expertos en la materia, se pueden incluir, si se desea.

Un procedimiento de fabricación útil para un dispositivo de la presente invención implica obtener un dispositivo de extracción, como un tubo; añadir un agente de estabilización (por ejemplo, un inhibidor de LysoPLA y un inhibidor de proteasa) al recipiente; liofilizar los inhibidores; hacer el vacío en el recipiente; y esterilizar el recipiente. Se puede añadir al recipiente un elemento de separación, si se desea. Un ejemplo de un procedimiento adecuado de liofilización/aplicación de vacío es el siguiente: el recipiente se congela a una temperatura de aproximadamente -40°C a una presión de aproximadamente 760 mm (101 kPa) durante aproximadamente de 6 a 8 horas; el recipiente se seca a medida que la temperatura aumenta de -40°C a aproximadamente 25°C, a una presión de aproximadamente 0,05 mm (7 Pa), durante aproximadamente de 8 a 10 horas; y se hace a continuación el vacío a una temperatura de aproximadamente 25°C y una presión de aproximadamente 120 mm (16 kPa) durante aproximadamente 0,1 horas. Preferentemente, la técnica de esterilización es radiación con cobalto 60.

La sangre completa o componente(s) de la misma se pueden extraer directamente del paciente al interior del dispositivo de extracción de sangre sin ninguna etapa de proceso entre medias. Se ha descubierto que si se extrae directamente la sangre completa del paciente, y se introduce la muestra directamente en el interior del dispositivo que contiene el agente de estabilización se evita sustancialmente la degradación y/o fragmentación de las proteínas que de otra forma ocurriría si la muestra se almacena antes de combinarla con el agente de estabilización. El método de la presente invención es útil en dispositivos de extracción tanto abiertos como cerrados cuyas aperturas estén cerradas con un medio de cierre.

En una realización preferida, el dispositivo de extracción es un tubo que se utiliza para extraer la muestra de sangre directamente de un paciente para estabilizar las proteínas inmediatamente en el punto de extracción. El tubo de extracción puede ser un sistema en el que se ha hecho el vacío para la extracción de la sangre. Alternativamente, el tubo puede tener un sistema con un vacío parcial o sin vacío para extraer la sangre. Un ejemplo adecuado de un sistema con vacío es un tubo cerrado. Una jeringa manual de extracción es un ejemplo adecuado tanto de un sistema con vacío parcial como un sistema sin vacío. Los sitemas sin vacío también pueden incluir sistemas automatizados de extracción. Se prefieren particularmente los sistemas en los que se ha practicado vacío.

Los sitemas de extracción de sangre de la presente invención están especialmente adecuados para estabilizar proteínas que contienen cadenas secundarias de ésteres alifátícos, tales como ghrelina, y en las realizaciones que incluyen un inhibidor de proteasa, proteínas biomarcadoras de enfermedad adicionales, por ejemplo, GLP-1 , GIP y glucagón, que son también marcadores de enfermedades metabólicas tales como la diabetes. De esta manera, los dispositivos de extracción se pueden usar para proporcionar patrones fiables en los que facilitar el diseño de ensayos tales como ELISA que permitan la detección de estos problemas en el intervalo de 10"9-10"1 M, que incluyen los niveles en circulación de estas proteínas in individuos sanos, así como los niveles terapéuticos. De esta manera, además de los métodos para diagnosticar una enfermedad como un trastorno metabólico (donde los niveles elevados del marcador comparado con un control (tal como el criterio médico establecido y/o un intervalo de concentraciones derivado de una población estadísticamente significativa de donantes no patológicos) sea indicativa de la presencia de enfermedad), pueden permitir métodos para realizar el seguimiento de un tratamiento en un paciente que padece enfermedades tales como trastornos metabólicos, donde la normalización (o la tendencia hacia la normalización) de las cantidades de dichas proteínas es un indicador del éxito de la terapia.

Los dispositivos de extracción de sangre de la presente invención también se pueden utilizar para los fines de recoger y almacenar sangre de pacientes que han ingerido profármacos que estén acilados (también denominados en el presente documento como profármacos que soportan cadenas secundarias de ésteres alifáticos), con fines terapéuticos, por ejemplo, como parte de una pauta terapéutica para una enfermedad o dolencia inflamatoria. Se entiende por lo general que un profármaco significa un agente farmacéutico activo que realmente es una forma precursora de un fármaco que es terapéuticamente inactivo o significativamente menos activo que el resto activo del agente (que puede ser un metabolito). Tras su administración tal como mediante ingestión oral, muchos profármacos se convierten en el fármaco o metabolito activo mediante la escisión de un enlace éster mediante lisofosfolipasas intrínsecas. Por ejemplo, enalaprilo se convierte en el metabolito activo enalaprilato, y el profármaco valaciclorvir se convierte en el metabolito/fármaco activo aciclovir. La heroína se desacetila al metabolito/fármaco activo morfina. En un escenario clínico, y en particular en ensayos clínicos, es ventajoso realizar un seguimiento de los niveles sanguíneos del profármaco, así como del metabolito activo en pacientes, durante el tiempo, por ejemplo, desde uno o más de los puntos de vista de seguridad, eficacia, bioactividad y bioequivalencia.

Por ejemplo, en los estudios de bioactividad, que miden la velocidad y extensión en la que el principio activo o resto activo se absorbe a partir de un fármaco y queda disponible en el punto de acción, se recomienda determinar la concentración y la actividad tanto del fármaco progenitor como del metabolito. En los estudios de bioequivalencia (que estudian la diferencia en la velocidad y extensión a la cual el principio o resto activo en productos farmacéuticamente equivalentes o alternativos queda disponible en el punto de acción del fármaco cuando se administra a la misma dosis molar en similares condiciones), la medida de la forma progenitora (profármaco) se recomienda de forma general (salvo en situaciones donde los niveles de fármaco progenitor son demasiado bajos para permitir una medida analítica fiable en sangre, suero o plasma durante un plazo de tiempo adecuado, o cuando el metabolito contribuye significativamente a la seguridad y7o eficacia, en cuyo caso, se miden la concentración y la actividad tanto del profármaco como del metabolito).

Al análisis cualitativo o cuantitativo de la sangre extraída de pacientes tratados con dicho tratamiento (que incluye pacientes que están actualmente con dicho tratamiento) mediante el dispositivo de extracción de sangre de la presente invención potencia la precisión de cualquiera de estos análisis porque la esterasa ex vivo que cataliza la degradación del profármaco en la sangre extraída queda inhibida durante el almacenamiento. El procesamiento de las muestras de sangre, por ejemplo, la extracción de plasma de la sangre extraída, y la separación del profármaco y el metabolito activo, y la posterior medición de estas entidades se puede llevar a cabo de acuerdo con las técnicas normalizadas. Por ejemplo, el profármaco y el metabolito activo se pueden separar mediante HPLC en fase invertida. La detección de la presencia de cantidades relativas del profármaco y del metabolito activo se puede realizar de acuerdo con técnicas normalizadas como la espectrometría de masas, seguido por análisis de los resultados, por ejemplo, mediante regresión cuadrática ponderada o regresión lineal. Consulte, por ejemplo, Wiltshire, y col., J. Chromatogr. B745:373-88 (2000) (y las referencias citadas en dicho documento). Los controles con los que se pueden comparar los valores medidos incluyen muestras de calibración y de control de calidad (denominadas en Wiltshire, supra, como curvas de calibración).

La presente invención se va a describir ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Salvo que se indique de otra forma, todas las partes y los porcentajes están basados en el peso.

EJEMPLO 1 - COMPARACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE LA GHRELINA EN MUESTRAS DE PLASMA La sangre se recogió en 4 tubos independientes que contenían 1 ) el inhibidor de LysoPLA metil araquinodil fluorofosfonato (MAFP), EDTA, el inhibidor de esterasa, tacrina, y los inhibidores de proteasa L-treo-isoleucil-tiazolidida, bestatina y leupeptina (un agente de estabilización de la invención "ISA", designados en la figura como Á), 2) otro agente de estabilización de la invención que incluye el anticoagulante EDTA y MAFP (designado en la figura como x), 3) EDTA y el inhibidor de esterasa y los inhibidores de proteasa (el agente de estabilización comparativo "CSA" designado en la figura como?), y 4) EDTA solo (designado en la figura como¦), seguido por enriquecimiento con 1 pg/ul de acil-ghrelina. Los cuatro tubos se extrajeron indirectamente del mismo sujeto para este experimento y se procesaron de forma idéntica. Los datos ilustrados en la Fig. 2 indican claramente que en los tubos 3 y 4 la acil-ghrelina se degradaba con el tiempo. Sin embargo, los dos tubos (números 1 y 2) que contenían MAFP mostraron estabilización durante las 30 h de incubación del plasma. El tubo 2, que contenía MAFP y EDTA, se comportaron mejor que el tubo 1 que contenía el inhibidor de esterasa y los inhibidores de proteasa.

En un experimento independiente, la sangre se extrajo de un sujeto en ayunas en EDTA y EDTA + MAFP. La concentración final de MAFP en el tubo en este experimento fue de 0,1 mM. El plasma se separó de cada tubo en dos viales independientes. Un vial se enriqueció con 1 pg/ul de ghrelina mientras que el otro no se enriqueció. El plasma enriquecido y no enriquecido tanto con EDTA como con EDTA + MAFP se incubó a temperatura ambiente durante 30 horas. La Figura 3 muestra los niveles de ghrelina medios en los intervalos de tiempo específicos. Los datos demuestran claramente la estabilidad mayor de la acil-ghrelina en los tubos que contienen MAFP.

Todas las publicaciones de patente y no de patente son indicativas del nivel de conocimientos de los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. Todas estas publicaciones se han incorporado al presente documento por referencia en la misma medida que si cada publicación individual se citara como incorporada de manera individual pro referencia.

Aunque la invención del presente documento se ha descrito con referencia a realizaciones particulares, se debe entender que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y solicitudes de la presente invención. Por tanto se entenderá que se pueden realizar numerosas modificaciones a las realizaciones ilustrativas y que se pueden diseñar otras disposiciones sin separarse del espíritu y el alcance de la presente invención definida por las reivindicaciones adjuntas.

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de extracción para extraer y estabilizar sangre completa o un componente de la misma, que comprende un primer extremo y un segundo extremo y al menos una pared interior que define un depósito, donde el depósito comprende un agente de estabilización que comprende un inhibidor de la lisofosfolipasa (LysoPLA).

2. El dispositivo de la reivindicación , que es un tubo.

3. El dispositivo de la reivindicación 2, donde el tubo comprende además un cierre perforable por una aguja para suministrar sangre al depósito.

4. El dispositivo de la reivindicación 3, donde el tubo es un tubo en el que se ha hecho un vacío parcial.

5. El dispositivo de la reivindicación 4, donde el tubo es estéril.

6. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde la pared interior comprende plástico o vidrio.

7. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde el depósito comprende un elemento separador.

8. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el inhibidor de LysoPLA es metil araquidonil fluofosfonato (MAFP),

9. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el inhibidor de LysoPLA se ha seleccionado del grupo que consiste en bromoenol lactona, octilfosfonofluoridato de etilo, dodecilfosfonofluoridato de isopropilo, 2-óxido de n-dodecil benzodioxafosforina, bromoenol lactona, palmitil trifluorometil cetona y palmitoil carnitina.

10. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde el agente de estabilización comprende además un inhibidor de la butilcolinesterasa (BChE), un inhibidor de la acetilcolinesterasa (AChE), o una combinación de los mismos.

11. El dispositivo de la reivindicación 10, donde el inhibidor de BChE es tacrina, o un derivado de la misma.

12. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 , en el que el agente de estabilización comprende además un inhibidor de la proteasa.

13. El dispositivo de la reivindicación 12, donde el inhibidor de la proteasa es un inhibidor de una serina proteasa, un inhibidor de una endopeptidasa, un inhibidor de una exopeptidasa, un inhibidor de una dipeptidil peptidasa, o una combinación de dos o más de los anteriores.

14. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, donde el agente de estabilización está liofilizado.

15. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende además un anticoagulante.

16. El dispositivo de la reivindicación 15, donde el anticoagulante es EDTA o una sal del mismo, o heparina.

17. El dispositivo de la reivindicación 16, donde el anticoagulante está revestido o se ha secado por pulverización sobre al menos una parte de la pared interior.

18. El dispositivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, donde el agente de estabilización excluye un inhibidor de la esterasa.

19. Un método para extraer y estabilizar sangre completa o un componente de la misma, que comprende extraer sangre de un paciente al interior del dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones 1-18.

20. El procedimiento de reivindicación 19, en el que la sangre o componente de la misma se obtiene de un paciente de diabetes y el componente es ghrelina, glucagón, GIP(i-42), GLP-1-(7-36)NH2, GLP-1-(7-37), y combinaciones de dos o más de los anteriores.

21. El procedimiento de reivindicación 19 o 20, donde el componente de la sangre es plasma

22. Un método para diagnosticar una enfermedad metabólica o realizar el seguimiento de un tratamiento de un paciente con una enfermedad metabólica, que comprende medir a al menos un tiempo predeterminado la presencia o cantidad de ghrelina en una muestra de sangre o componente de la misma, donde la muestra se extrae del paciente en un dispositivo de extracción de sangre de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde una cantidad medida que supera un control es indicativa de la presencia de una enfermedad metabólica, o de la eficacia del tratamiento.

23. Un método para detectar la presencia o la cantidad de un profármaco y/o de un metabolito activo del mismo en la sangre o un componente de la misma, que comprende detectar la presencia o medir la cantidad de un profármaco que soporta un grupo éster alifático en una muestra de sangre o fluido componente de la misma, procedente de un paciente al que se le ha administrado el profármaco, donde la sangre o fluido componente de la misma se extrae en un dispositivo de extracción de sangre de cualquiera de las reivindicaciones 1-18, y comparar la presencia detectada o la cantidad medida con un control.