MX2011005672A - Composiciones de anticuerpo estables y metodos para estabilizar a las mismas. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona composiciones y métodos para inhibir el fraccionamiento de las inmunoglobulinas que comprenden una cadena ligera lambda basado en la observación que el hierro, en presencia de histidina, da lugar al fraccionamiento creciente de una molécula de lgG completamente humana recombinante que contiene una cadena ligera lambda debido a la segmentación en la región bisagra. La invención además proporciona una formulación farmacéutica acuosa que comprende un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que une la subunidad p40 de IL-12/IL-23 y un sistema amortiguador que comprende histidina, en donde la formulación tiene una estabilidad mejorada, que incluye resistencia mejorada a la fragmentación.

Description

COMPOSICIONES DE ANTICUERPO ESTABLES Y METODOS PARA ESTABILIZAR A LAS MISMAS Referencia Cruzada a la Solicitud Relacionada Esta solicitud reivindica la prioridad para la Solicitud Provisional Norteamericana Número de Serie 61/118,528 presentada el 28 de noviembre de 2008, cuyo contenido se incorpora en la presente.

Antecedentes de la Invención La interleucina-12 (IL-12) y la citocina IL-23 relacionada son miembros de la superfamilia IL-12 de las citocinas que comparten una subunidad común p40 (Anderson y colaboradores (2006) Springer Semin. Immunopathol. 27:425-42). IL-12 estimula principalmente la diferenciación de las células Th1 y la secreción subsecuente del interferón gamma, mientras que IL-23 estimula preferiblemente la diferenciación de las células T sin tratar en las células T auxiliares efectoras (Th17) que secretan IL-17, un mediador proinflamatorio (Rosmarin and Strober (2005) J. Drugs Dermatol. 4:318-25; Harrington, y colaboradores (2005) Nature Immunol. 6:1123-32; Park y colaboradores (2005) Nature Immunol. 6:1132-41).

La interleucina humana 12 (IL-12) es una citocina con una estructura única y efectos pleiotrópicos (Kobayashi, y colaboradores (1989) J. Exp. Med. 170: 827-845; Seder, y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:10188-92; Ling, y colaboradores (1995) J. Exp. Med. 154:116-127; Podlaski, y colaboradores (1992) Arch. Biochem. Biophys. 294:230-237), IL-12 es una proteína heterodimérica que comprende una subunidad de 35 kDa (p35) y una subunidad de 40 kDa (p40) que ambas están ligadas juntas por un enlace de disulfuro (referido como "subunidad p70"). La proteína heterodimérica es producida principalmente por las células de presentación de antigeno tal como monocitos, macrófagos y células dendríticas. Estos tipos de células también secretan un exceso de subunidad p40 con relación a la subunidad p70. Las subunidades p40 y p35 no están relacionadas genéticamente y ninguna se ha reportado como poseedora de actividad biológica, aunque el homodímero p40 puede funcionar como un antagonista de IL-12. IL-12 desempeña una función esencial en la patología asociada a varias enfermedades que implican respuestas inmunes e inflamatorias. Una revisión de IL-12, sus actividades biológicas, y su función en la enfermedad se puede encontrar en Gately y colaboradores (1998) Ann. Rev. Immunol. 16: 495-521.

Funcionalmente, IL-12 desempeña una función fundamental en la regulación del equilibrio entre los linfocitos de auxiliar T específico al antígeno tipo 1 (Th1) y tipo 2 (Th2), que controlan la iniciación y progresión de los trastornos autoinmunes, y es esencial en la regulación de la diferenciación y maduración del linfocito de Th1. Las citocinas liberadas por las células Th1 son inflamatorias e incluyen el interferón ? (IFN y), IL-2 y linfotoxina Las células Th2 secretan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 para facilitar la inmunidad humoral, reacciones alérgicas, e inmunosupresión.

La interleucina humana 23 (IL-23) es una proteína heterodimérica que comprende una subunidad de 19 kDa (p19) y la subunidad común de 40 kDa (p40), que son ligadas juntas por un enlace de disulfuro. IL-23, similarmente a IL 12, es producida principalmente por las células de presentación de antígeno tal como monocitos, macrófagos y células dendríticas. La función dominante de IL-23 implica el estímulo de un subconjunto de células T CD4+ (también referidas como células T de IL-17 o Th17) para producir la citocina IL-17. IL-17, a su vez, es un componente esencial en el establecimiento y perpetuación de la inflamación autoinmune, ya que induce la producción de citocinas proinflamatorias por las células y macrófagos endoteliales (Kastelein y colaboradores (2007) Annu. Rev. Immunol. 25:221-42).

De acuerdo con la preponderancia de las respuestas de Th1 en las enfermedades autoinmunes y actividades proinflamatorias de IFN y e IL-17, IL-12 e IL-23 desempeñan una función principal en la patología asociada a muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias tal como, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por su abreviatura en inglés), esclerosis múltiple (MS, por su abreviatura en inglés), psoriasis, diabetes mellitus dependiente de insulina, y enfermedad de Crohn (CD, por su abreviatura en inglés).

Los niveles elevados de p70 de IL-12 se han detectado en el sinovio de los pacientes con RA en comparación con los controles sanos (Morita y colaboradores (1998) Arthritis and Rheumatism 41:306-314). El perfil de expresión de ácido ribonucleico mensajero (mRNA) de citocina en el sinovio de pacientes con RA identificó predominantemente las citocinas de Th1. (Bucht y colaboradores (1996) Clin. Exp. Immunol. 103:347-367). Usando ratones sometidos a direccionamiento genético que carecieron de la subunidad p19 de IL-23 o la subunidad p40 de IL-12/23, IL-23 mostró ser esencial para el desarrollo de la artritis inducida por colágeno (Murphy y colaboradores (2003) J. Exp. Med. 198(12):1951-1957).

Los pacientes humanos con MS han demostrado un aumento en la expresión de IL-12/IL-23 según lo documentado por los niveles de mRNA de p40 en las placas de MS aguda, (ver, por ejemplo, Windhagen y colaboradores (1995) J. Exp. Med. 182:1985-96). Además, el estímulo ex vivo de las células de presentación de antígeno con las células T de expresión de CD40L de los pacientes con MS dio lugar a la producción creciente de IL-12 en comparación con las células T de control, de acuerdo con la observación que las interacciones de CD40/CD40L son inductores potentes de IL-12. Usando los ratones sometidos a direccionamiento genético que carecieron de IL-23, IL-23 demostró ser esencial para la inflamación autoinmune del cerebro (Cua y colaboradores (2003) Nature 421:7440748).

La expresión creciente de IFN ? y IL-12 se ha observado en la mucosa intestinal de los pacientes con CD (Fais y colaboradores (1994) J. Interferon Res. 14:235-238; Parronchi y colaboradores (1997) Am. J. Path. 150:823-832; Monteleone y colaboradores (1997) Gastroenterology 112:1169-1178, y Berrebi y colaboradores (1998) Am. J. Path. 152:667-672). El perfil de secreción de citocina de las células T de la lámina propia de los pacientes con CD es característico de una respuesta predominante de Th1, incluyendo los niveles ampliamente elevados de IFN ? (Fuss, y colaboradores (1996) J. Immunol. 157:1261-1270). Por otra parte, las secciones de tejido de colon de los pacientes con CD muestran una abundancia de los macrófagos de expresión de IL-12 y células T de expresión de IFN Y (Parronchi y colaboradores (1997) Am. J. Path. 150:823-832). La expresión creciente de IL-23 también se ha observado en los pacientes con enfermedad de Crohn y en los modelos ratón de la enfermedad intestinal inflamatoria. IL-23 es esencial para la colitis mediada por células T y para promover la inflamación a través de IL-17 y para los mecanismos dependientes de IL-6 en modelos ratón de colitis (ver, por ejemplo, la revisión de Zhang y colaboradores, (2007) Intern. Immunopharmacology 7:409-416).

La sobreexpresión de IL-12/IL-23 p40 y ARN mensajero de IL-23 p19 en lesiones psoriásicas de piel sugiere que la inhibición de IL-12 e IL-23 con un anticuerpo neutralizante en la proteína de subunidad IL-12/23 p40 puede ofrecer un método terapéutico eficaz para el tratamiento de la psoriasis (Yawalkar, y colaboradores (1998) J. Invest. Dermatol. 111: 1053-57; Lee y colaboradores (2004) J. Exp. Med. 199: 125-30; Shaker y colaboradores (2006) Clin. Biochem. 39: 119-25; Piskin y colaboradores (2006) J. Immunol. 176: 1908-15; ver también las revisiones recientes de Torti y colaboradores (2007) J. Am. Acad. Dermatol. 57(6): 1059-1068; Fitch y colaboradores (2007) Current Rheumatology Reports 9:461-467). Ambas citocinas contribuyen al desarrollo de la inmunorespuesta de célula T auxiliar tipo 1 (Th1) en la psoriasis, pero cada una tiene una función única (Rosmarin y Strober (2005) J. Drugs Dermatol. 4:318-25; Hong y colaboradores (1999) J. Immunol. 162:7480-91; Yawalkar, y colaboradores (1998) J. Invest. Dermatol. 111:1053-57). Tales métodos terapéuticos para el tratamiento de la psoriasis se necesitan claramente en la técnica.

Debido a las funciones de IL-12 y IL-23 humanas en una variedad de trastornos humanos, las estrategias terapéuticas se han diseñado para inhibir o contrarrestar la actividad de IL-12/IL-23. Particularmente, los anticuerpos que unen, y neutralizan, la subunidad p40 de IL-12/IL-23, se han buscado como medios para inhibir la actividad de IL-12/IL-23. Algunos de los primeros anticuerpos fueron los anticuerpos monoclonales murinos (mAbs), secretados por los hibridomas preparados de los linfocitos de los ratones inmunizados con IL-12 (ver, por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 97/15327 de Strober y colaboradores; Neurath y colaboradores (1995) J. Exp. Med. 82:1281-1290; Duchmann y colaboradores (1996) J. Immunol. 26:934-938). Estos anticuerpos murinos contra IL-12 están limitados para su uso in vivo debido a los problemas asociados con la administración de los anticuerpos de ratón a humanos, tal como vida útil corta del suero, incapacidad de causar ciertas funciones efectoras humanas y la obtención de una inmunorespuesta indeseada contra el anticuerpo de ratón en un humano (la reacción del "anticuerpo humano antiratón" (HAMA)).

Generalmente, los intentos para superar los problemas asociados al uso de anticuerpos completamente murinos en humanos, han implicado el diseño genético de los anticuerpos para que sean más "humanos". Por ejemplo, se han preparado los anticuerpos quiméricos, en donde las regiones variables de las cadenas de anticuerpo se derivan de murino y las regiones constantes de las cadenas de anticuerpo se derivan de humano, (Junghans y colaboradores (1990) Cáncer Res. 50:1495-1502; Brown y colaboradores (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:2663-2667; Kettleborough y colaboradores (1991) Protein Engineering 4:773-783). Sin embargo, debido a que estos anticuerpos quiméricos y humanizados aún conservan algunas secuencias murinas, todavía pueden producir una reacción inmune indeseada, la reacción de anticuerpo humano anti-quimérico (HACA, por su abreviatura en inglés), especialmente cuando se administran durante períodos prolongados.

Un agente inhibitorio de IL-12/IL-23 preferido para los anticuerpos murinos o derivados de los mismos (por ejemplo, los anticuerpos quiméricos o humanizados) es un anticuerpo completamente humano anti-IL-12/IL-23, debido a que tal agente no debe producir la reacción de HAMA, incluso si se utiliza durante períodos prolongados. Se han descrito los anticuerpos humanos recombinantes que unen la subunidad p40 de IL-12/IL-23 humana con alta afinidad y cinética de disociación lenta y que tienen la capacidad de neutralizar IL-12 humana, incluyendo la proliferación de blastos de fitohemaglutinina inducida por h IL-12 y la producción de IFNy humano inducida por hlL-12 (ver la Patente Norteamericana No. 6,914,128).

La selectividad de los anticuerpos monoclonales (Mabs) para los antígenos específicos los hace candidatos terapéuticos excelentes. Sin embargo, debido a la estructura de las moléculas de anticuerpo son vulnerable a la degradación enzimática y no enzimática. Por ejemplo, el almacenamiento de los anticuerpos a temperaturas elevadas durante periodos de tiempo prolongados da lugar a una degradación no enzimática del anticuerpo (Connell, G.E. y R.H. Painter (1966) Can. J. Biochem. 44(3):371-9; Córdoba, A.J. y colaboradores (2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818(2): 115-21 ; Cohén, S.L. y colaboradores (2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22):6976-7).

Los anticuerpos humanos de inmunoglobulina gamma (IgG) se componen generalmente de dos cadenas ligeras y cadenas pesadas idénticas. La cadena pesada es del tipo gamma mientras que la cadena ligera puede ser del tipo kappa o lambda, son diferentes en sus regiones constantes de terminal carboxilo. los enlaces de disulfuro inter-cadena mantienen juntas las cadenas pesadas. El número de enlaces de disulfuro varía entre las subclases IgG. Para I gG 1 , por ejemplo, existen dos enlaces de disulfuro inter-cadena pesada y un enlace de disulfuro que mantienen juntas cada cadena ligera y cadena pesada.

Una molécula de IgG se compone de una región Fe y de dos regiones Fab que son ligadas por una región bisagra. La región bisagra se divide en 3 porciones - la región superior, central e inferior (figura 1). La región superior liga las ramificaciones Fab a la región central mientras que la región inferior liga la porción Fe a la región central. La región central contiene los enlaces de disulfuro inter-cadena y tiene alto contenido de prolina. La longitud de la región bisagra varía entre las subclases de IgG y proporciona la flexibilidad a las ramificaciones Fab, permitiendo la variación del ángulo entre las ramificaciones así como la libertad de giro alrededor de su eje. Como resultado de su flexibilidad, la región bisagra es expuesta y así perturbada fácilmente por la temperatura y almacenamiento durante periodos de tiempo prolongados. Por ejemplo, la región bisagra es accesible para las proteasas tal como papaína y lys-C, que se utilizan rutinariamente para generar los fragmentos Fe y Fab del anticuerpo. Otras enzimas que duplican las moléculas de IgG en esta región incluyen la catepsina L, plasmina, y metaloproteasas.

Los anticuerpos monoclonales en la formulación líquida experimentan la hidrólisis no enzimática cuando están almacenados a 5°C durante periodos de tiempo prolongados, que produce fragmentos Fab + Fc y Fab (Jiskoot, W. y colaboradores (1990) Pharm. Res. 7(12):1234-41 ; Alexander, A.J. y D.E. Hughes (1995) Anal. Chem. 67(20):3626-32; Córdoba, A.J. y colaboradores (2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818(2):115-21 ; Liu, H. y colaboradores (2006) J. Chrom. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 837:35-43; y Cohén, S.L. y colaboradores (2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22):6976-7). La fragmentación, supervisada comúnmente por la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC, por su abreviatura en inglés), aumenta a condiciones de pH extremo y temperaturas altas (Cohén, S.L. y colaboradores (2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22):6976-7). La segmentación ocurrió en los múltiples enlaces de péptido a través de la secuencia de región de cadena pesada Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys. La división a través de la secuencia de región de cadena pesada Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys dio lugar a la escalera correspondiente del fragmento Fab (48 kDa), mientras que, la segmentación entre los residuos Ser-Cys ocurrió vía un mecanismo de eliminación beta y dio lugar a los fragmentos de cadena pesada y ligera (23 kDa).

La fragmentación inducida por metal en la región bisagra de una molécula de IgG que contuvo una cadena ligera kappa fue demostrada en el anticuerpo monoclonal recombinante, Campath (Smith, M.A. y colaboradores (1996) Int. J. Pept. Protein Res. 48(1 ):48-55). Smith y colaboradores reportaron que la fragmentación mediada por cobre a pH ligeramente alcalino y la segmentación fue localizada específicamente entre la lisina y los residuos de treonina en la región bisagra de la secuencia de cadena pesada Ser-Cys-ASP-Lys-Thr-His-Thr-Cys. El mecanismo de segmentación no fue revelado por los autores, sin embargo, la segmentación fue reducida a condiciones ácidas de pH 5-6.

Aún existe una necesidad de determinar los parámetros que rodean la fragmentación de las moléculas de anticuerpo para proporcionar las composiciones estables (por ejemplo, formulaciones) y los métodos para prevenir la segmentación de anticuerpos en su formulación durante el procesamiento y almacenamiento.

Por ejemplo, aún existe una necesidad de una formulación farmacéutica acuosa que comprenda un anticuerpo, o fragmento del mismo, que sea conveniente para que el uso terapéutico inhiba o contrarreste la actividad perjudicial de IL-12 e IL-23 y que tenga una estabilidad mejorada durante el procesamiento y almacenamiento de larga duración y que tenga una resistencia mejorada a la fragmentación de la cadena ligera lambda.

Breve Descripción de la Invención La invención proporciona, en un primer aspecto, las formulaciones acuosas que comprenden un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena lambda, por ejemplo, un anticuerpo que es conveniente para que el uso terapéutico inhiba o contrarreste la actividad perjudicial de IL-12 e IL-23 y mejore las características con respecto a las formulaciones reconocidas en la técnica. Por ejemplo, las formulaciones de la invención tienen una vida útil de por lo menos 24 meses, por ejemplo, en un estado líquido o sólido. En otra modalidad, las formulaciones de la invención mantienen la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

La invención proporciona, en un segundo aspecto, las composiciones y métodos para inhibir la fragmentación de las inmunoglobulinas que comprenden una cadena ligera lambda basado en la observación que el hierro, en presencia de histidina, da lugar a la fragmentación creciente de un anticuerpo que contiene una cadena ligera lambda debido a una segmentación específica en la región bisagra. La presencia de la histidina sola en la formulación no tuvo ningún efecto sobre la fragmentación. El nivel de fragmentación fue dependiente de la dosis con respecto a los niveles de hierro e histidina. Los niveles elevados de fragmentación causados por el hierro e histidina no fueron observados en los anticuerpos que contuvieron una cadena ligera kappa. El anticuerpo que contiene la cadena lambda se segmenta en residuos que están presentes en la región bisagra, en la cercanía del enlace de disulfuro que une la cadena ligera y la cadena pesada.

En el primer aspecto, la invención proporciona una formulación estable que comprende una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda y un sistema amortiguador que comprende histidina, en donde la formulación está sustancialmente libre de metal.

En una modalidad, el metal es Fe2+ o Fe3+. En otra modalidad, el metal es Cu2+ o Cul + .

En otra modalidad, la invención además proporciona una formulación estable que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula que comprende una cadena ligera lambda en una solución amortiguada que comprende histidina con un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, en donde el metal está presente en una concentración que no da lugar a la segmentación de la cadena ligera lambda en presencia de la histidina.

En otra modalidad, la invención además proporciona una formulación estable que comprende una molécula que abarca por lo menos una porción de una cadena ligera lambda, un sistema amortiguador que comprende imidazol, y un metal, en donde la molécula no se segmenta dentro de la región bisagra en presencia de un metal.

En una modalidad, la formulación está sustancialmente libre de metal después de someterse a por lo menos un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de filtración, intercambio de amortiguador, cromatografía e intercambio de resina. En una modalidad, el intercambio de amortiguador comprende la diálisis con un amortiguador seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador que comprende histidina, un amortiguador que comprende citrato y fosfato y un amortiguador que comprende imidazol.

En una modalidad, el metal está presente en una concentración de, por ejemplo, menos de aproximadamente 5,060 partes por billón, menos de aproximadamente 1,060 ppb, menos de aproximadamente 560 ppb, menos de aproximadamente 310 ppb, menos de aproximadamente 160 ppb, menos de aproximadamente 110 ppb y menos de aproximadamente 70 ppb. En una modalidad particular, el metal está presente a una concentración de menos de aproximadamente 160 ppb, y preferiblemente a una concentración de menos de aproximadamente 70 ppb.

En una modalidad, la formulación comprende una molécula que abarca una cadena ligera lambda y por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de un poliol y tensioactivo. En una modalidad, la formulación además comprende un estabilizador. En una modalidad, la formulación además comprende manitol, polisorbato 80 y metionina. En una modalidad, la formulación además comprende un amortiguador de citrato o un amortiguador de fosfato. En una modalidad, el pH es de aproximadamente 5 o menos. En otra modalidad, la formulación comprende (a) 1-10% de manitol, (b) 0.001%-0.1% de polisorbato 80 y (c) un sistema amortiguador que comprende 1-100 mM de histidina y 1-50 mM de metionina, con un pH de 5 a 7. En aún otra modalidad, la formulación comprende (a) 2-6% de manitol, (b) 0.005-0.05% de polisorbato 80 y (c) un sistema amortiguador que comprende 5-50 mM de histidina y 5-20 mM de metionina, con un pH de 5 a 7. En una modalidad particular, la formulación comprende (a) aproximadamente 4% de manitol, (b) aproximadamente 0.01% de polisorbato 80 y (c) un sistema amortiguador que comprende aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 10 mM de metionina, con un pH de aproximadamente 6.

En una modalidad, la invención proporciona una formulación farmacéutica acuosa que comprende (a) 1-250 mg/ml de un anticuerpo humano que une un epítopo de una subunidad p40 de IL-12/IL-23, (b) 1-10% de manitol, (c) 0.001%-0.1% de polisorbato 80, (d) 1-50 mM de metionina, y (e) 1-100 mM de histidina, con un pH de 5 a 7, en donde la formulación está sustancialmente libre de metal.

En una modalidad, la formulación farmacéutica no tiene una conductividad de menos de aproximadamente 2.5 mS/com. En otra modalidad, la formulación farmacéutica no es la formulación usada en el ejemplo 9 de la Patente Norteamericana No. 6,914,128.

En una modalidad, la molécula es un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo. En varias modalidades, la concentración del anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es, por ejemplo, de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 250 mg/ml, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 200 mg/ml, o es de aproximadamente 100 mg/ml.

En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir un epítopo de una subunidad p40 de IL-12/IL-23. En la modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, es capaz de unir el epítopo de la subunidad p40 cuando la subunidad p40 está unida a una subunidad p35 de IL-12. En otra modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, es capaz de unir el epítopo de la subunidad p40 cuando la subunidad p40 está unida a una subunidad de p 19 de IL-23. En aún otra modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, es capaz de unir el epítopo de la subunidad p40 cuando la subunidad p40 está unida a la subunidad p35 de IL-12 y también cuando la subunidad p40 está unida a una subunidad de p19 de IL-23. En una modalidad particular, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, une un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 al cual se une un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Y61 y J695.

En una modalidad particular, la invención además proporciona una formulación farmacéutica acuosa que comprende (a) aproximadamente 100 mg/ml de un anticuerpo humano que une un epítopo de una subunidad p40 de IL-12/IL-23, (b) aproximadamente 4% de manitol, (b) aproximadamente 0.01% de polisorbato 80, (c) aproximadamente 10 mM de metionina, y (d) 10 mM de histidina, con un pH de aproximadamente 6.

En una modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, se disocia de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 con una Kd de 1 x 10"10M o menos o una constante de índice koff de 1 x 103 s"1 o menos, según lo determinado por la resonancia de plasmón superficial.

En una modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, neutraliza la actividad biológica de la subunidad p40 de IL-12/IL-23. En una modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo neutraliza la actividad biológica de IL-12. En una modalidad particular, la neutralización de la función de IL-12 es lograda por la interacción del anticuerpo humano, o fragmento del mismo, con la subunidad p40 de IL-12. En una modalidad particular, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de blastos de fitohemaglutinina en un análisis de PHA in vitro con una Cl50 de 1 x 10"9 M o menos, o que inhibe la producción de IFNv humano con una Cl50 de 1 x 10'10 M o menos. En otra modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión del mismo, neutraliza la actividad biológica de IL-23. En una modalidad particular la neutralización de la función de IL-23 es lograda por la interacción del anticuerpo humano, o fragmento del mismo, con la subunidad p40 de IL-23.

En una modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una cadena pesada CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 y una cadena ligera CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2. En otra modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una cadena pesada CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 3 y una cadena ligera CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4. En otra modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una cadena pesada CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 5 y una cadena ligera CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6. En aún otra modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 7 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8. En una modalidad particular, el anticuerpo humano es el anticuerpo J695, o una porción de unión a antígeno del mismo.

En una modalidad, la formulación tiene una vida útil de por lo menos 24 meses. En otra modalidad, la formulación mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

En una modalidad, la formulación además comprende un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico adicional.

En una modalidad, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticoesteroide, ciclosporina , sulfasalazina, aminosalicilato, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, un inhibidor de lipooxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, un antioxidante, un inhibidor de tromboxano, un antagonista del receptor IL-1, un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 ß, un anticuerpo del receptor anti-IL-1, un anticuerpo monoclonal anti-IL-6, un anticuerpo del receptor anti-IL-6, un factor de crecimiento, un inhibidor de elastasa, un compuesto de piridinil-imidazol, un anticuerpo o agonista de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, E AP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, un anticuerpo para CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o ligando del mismo, metotrexato, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, NSAID, ibuprofeno, prednisolona, un inhibidor de fosfodiesterasa, un agonista de S1P1, un inhibidor de bcl-2, un agonista de adenosina, un agente anti-trombótico, un inhibidor de complemento, un agente adrenérgico, IRAK, NIK, IKK, p38, un inhibidor de MAP cinasa, inhibidor de enzima de conversión I L- 1 ß , inhibidor de enzima de conversión de TNFa, un inhibidor de señalización de célula T, un inhibidor de metaloproteinasa, un inhibidor de enzima de conversión de angiotensina, un receptor de citocina soluble, receptor soluble de p55 TNF, receptor soluble de p75 TNF, slL-1RI, slL-1RII, slL-6R, una citocina antiinflamatoria, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, y TGF .

En otra modalidad, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNF y fragmentos de anticuerpo del mismo, un constructo de TNFR-lg, un inhibidor de TACE, un inhibidor de PDE4, un corticoesteroide, budenosida, dexametasona, sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, inhibidor de enzima de conversión de IL-?ß, IL-1ra, un inhibidor de tirosina cinasa, 6-mercaptopurina, y IL-11.

En aún otra modalidad, el agente terapéutico adicional se selecciona del grupo que consiste de metilprednisolona, ciclofosfamida, 4-aminopiridina, tizanidina, interferón-ß a , interferón-ß? b, copolímero 1, oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, cladribina, un inhibidor de TACE, un inhibidor de cinasa, SIL-13R, un anti-P7, y ligando de glicoproteína de selectina p.

En otra modalidad, la invención además proporciona una formulación estable que comprende una molécula que abarca por lo menos una porción de una cadena ligera lambda, un sistema amortiguador que comprende histidina, y un quelante de metal, en donde la molécula no se segmenta dentro de la región bisagra ni se segmenta dentro de la región bisagra a un nivel que es menor que el nivel de segmentación observado en ausencia del quelante de metal.

En una modalidad, el metal es Fe2+ o Fe3 + . En otra modalidad, el metal es Cu2+ o Cul + .

En una modalidad, el quelante de metal se selecciona del grupo que consiste de citrato, sideróforo, calixarenos, ácido aminopolicarboxílico, ácido hidroxiaminocarboxílico, glicina sustituida con N, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), un quelante hierro bidentado, tridentado o hexadentado, un quelante de cobre, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos. En una modalidad preferida, el quelante de metal es deferoxamina.

En el segundo aspecto, la invención proporciona los métodos para inhibir o prevenir la segmentación de una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda en una formulación que contiene histidina, el método comprende la etapa de inhibir o prevenir la capacidad de los metales para segmentar la molécula. En una modalidad, la inhibición o prevención comprende incluir por lo menos un quelante de metal en la formulación. En otra modalidad, la inhibición o prevención comprende someter la molécula por lo menos a un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de filtración (por ejemplo, ultrafiltración y diafiltración), intercambio de amortiguador, cromatografía, e intercambio de resina. En una modalidad, el intercambio de amortiguador comprende la diálisis con un amortiguador seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador que comprende histidina, un amortiguador que comprende citrato y fosfato y un amortiguador que comprende imidazol.

En aún otra modalidad, la inhibición o prevención comprende la inhibición o prevención de la segmentación alterando por lo menos un aminoácido en la cadena ligera lambda o en la cadena pesada. En aún otra modalidad, la inhibición o prevención comprende la inhibición o prevención de la segmentación alterando la secuencia de aminoácido en la cadena lambda tal que sea cambiada una secuencia de aminoácido ácido glutámico-cisteína-serina. En aún otra modalidad, la inhibición o prevención comprende la disminución del pH de las formulaciones hacia niveles más ácidos, por ejemplo, a un pH de 5 o menos. En otra modalidad, la inhibición o prevención comprende incluir un amortiguador adicional, tal como un amortiguador de citrato o un amortiguador de fosfato, en la formulación. En una modalidad, la formulación comprende aproximadamente 1-100 mM de histidina, por ejemplo, aproximadamente 10 mM de histidina.

En una modalidad, la formulación comprende un nivel de hierro que no da lugar a la segmentación del anticuerpo que contiene la cadena lambda después de 6 meses a 25°C o 40°C, por ejemplo, el hierro está presente en menos de aproximadamente 160 ppb.

En una modalidad, la molécula está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 2 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 7 mg/ml, por ejemplo aproximadamente 100 mg/ml.

En una modalidad, la molécula es una inmunoglobulina, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal. En una modalidad particular, la molécula es un anticuerpo anti-IL-12/23, por ejemplo, J695. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD-80 y/o anti-IGF1 , 2.

En otra modalidad, la molécula contiene una región bisagra seleccionada del grupo que consiste de DVD-lg™, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado en CDR, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un Fv ligado a disulfuro, un anticuerpo de dominio único, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo doble específico, y un anticuerpo biespecífico. En una modalidad, la molécula comprende por lo menos una porción de una cadena pesada. En otra modalidad, la porción de una cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido serina-cisteína-ácido aspártico-lisina (SCDK), o por lo menos una modificación que no inhibe la unión del anticuerpo. En otra modalidad, la segmentación ocurre en la región bisagra entre los residuos de serina y cisteína. En otra más modalidad, la segmentación ocurre entre los residuos de cisteína y ácido aspártico.

En una modalidad, el metal es Fe2+ o Fe3+. En otra modalidad, el metal es Cu2+ o Cul + .

En una modalidad, la cadena ligera lambda comprende la secuencia de aminoácido de ácido glutámico-cisteína-serina (ECS), o por lo menos una modificación que no inhiba la unión del anticuerpo. En otra modalidad, la segmentación ocurre en una región bisagra de la cadena lambda. En otra modalidad, la segmentación ocurre entre los residuos de ácido glutámico y cisteína. En aún otra modalidad, la segmentación ocurre entre la los residuos de serina y cisteína.

En una modalidad, la segmentación ocurre a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 25°C, por ejemplo, aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C. En una modalidad, la segmentación ocurre a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, por ejemplo aproximadamente pH 5 a aproximadamente 6.

En una modalidad, por lo menos un quelante de metal es un sideróforo seleccionado del grupo que consiste de aerobactina, agrobactina, azotobactina, bacilibactina, ácido N-(5-C3-L-(5-aminopentil)hidroxicarbamoil)-propionamido)pent¡l)-3-(5-(N-hidroxiacetoamido)-pentil)carbamoil)-proprionhidroxámico (deferoxamina, deferoxamina o DFO o DEF), desferritiocina , enterobactina, eritrobactina, ferricromo, ferrioxamina B, ferrioxamina E, fluviabactina, fusarinina C, micobactina, parabactina, pseudobactina, vibriobactina, vulnibactina, yersiniabactina, ornibactina, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos (Roosenberg, J. M. y colaboradores (2000) Studies and Syntheses of Siderophores, Microbial Iron Chelators, and Analogs as Potential Drug Delivery Agents. Current Medicinal Chem. 7: 159-197). En una modalidad preferida, el quelante de metal es deferoxamina.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es citrato o fosfato.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es un ácido aminopolicarboxilico seleccionado del grupo que consiste de ácido etilendiaminotetracético (EDTA), ácido nitriloacético (NTA), ácido trans-diaminociclohexano-tetraacético (DCTA), ácido pentaacético de dietilentriamina (DTPA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), ácido aspártico, ácido bis(aminoetil)glicoléter-N,N,N'N'-tetraacético (EGTA), ácido glutámico, y ácido N,N'-bis(2-hidroxibencil)etilendiamina-N,N -diacético (HBED), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es un ácido hidroxiaminocarboxí Meo seleccionado del grupo que consiste de ácido N-hidroxietiliminodiacético (HIMDA), N,N-bishidroxietilglicina (bicina), y N-(trishidroximetilmetil)glicina (tricina), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es una glicina sustituida con N, o derivado, análogo, o combinación de la misma. Por ejemplo, la glicina sustituida con N se selecciona del grupo que consiste de glicilglicina, y derivados, análogos, y combinaciones de la misma.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), o un derivado, análogo, y combinación del mismos.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es un calixareno, por ejemplo, un macrociclo u oligómero cíclico basado en un producto de hidroxialquilización de un fenol y un aldehido, o un derivado, análogo, o combinación de los mismos (Gutsche, C. D. (1989) Calixarenes. Cambridge: Royal Society of Chemistry; Dharam, P y Harjit, S. (2006) Syntheses, Structures and Interactions of Heterocalixarenes, Arcivoc).

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal comprende una combinación de DTPA y DEF. En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal comprende una combinación de EDTA, EGTA y DEF.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es un derivado de hidroxipiridina, un derivado de hidrazona, y un derivado de hidroxifenilo, o un derivado de nicotinilo, tal como 1 ,2-dimetil-3-hidroxipiridin-4-ona (Deferiprona, DFP o Ferriprox); 2-deox¡-2-(N-carbamoilmetil-[N,-2,-metil-3'-hidroxipiridin-4'-ona])-D-glucopiranosa (Feralex-G), piridoxal-isonicotinil-hidrazona (PIH); ácido 4,5-dihidro-2-(2,4-dihidroxifenil)-4-metiltiazol-4-carboxílico (GT56-252), ácido 4-[3,5-bis(2-hidroxifenil)-[l,2,4]triazol-1-il]benzoico (ICL-670); ácido N,N'-bis(o-hidroxibencil)et¡lendiamina-N,N'-diacético (HBED), 5-cloro-7-yodo-quinolin-8-ol (clioquinol), o un derivado, análogo, o combinación de los mismos.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal es un quelante de cobre seleccionado del grupo que consiste de trietilentetramina (trientina), tetraetilenpentaamina, D-penicilamina, etilendiamina, bispiridina, fenantrolina, batofenantrolina, neocuproina, sulfonato de batocuproina, cuprizona, cis,cis-1 ,3,5,-triaminociclohexano (TACH), tachpir, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

En otra modalidad, por lo menos un quelante de metal se puede seleccionar de agentes quelantes, análogos y derivados de los agentes descritos en la técnica, por ejemplo, que se describieron en "Iron Chelators and Therapeutic Uses", de Bergeron, R. y colaboradores, en Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Sexta Edición, Volumen 3: Cardiovascular Agents and Endocrines, editado por Abraham, D.J, John Wiley & Sons, Inc. 2003. Además, los quelantes se pueden seleccionar de los agentes quelantes, análogos y derivados de los agentes descritos en la Patente Norteamericana No. 6,083,966, Patente Norteamericana No. 6,521,652, Patente Norteamericana No. 6,525,080, Patente Norteamericana No. 6,559,315, PCT/US2004/029318, PCT/US2003/022012, WO/2002/043722 , y WO 2004/007520.

En otra modalidad, la formulación comprende por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de un aminoácido, azúcar, alcohol de azúcar, amortiguador, sal, y un tensioactivo.

En otra modalidad, la formulación comprende por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de aproximadamente 1 a aproximadamente 60 mg/ml de manitol, aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mM de metionina, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.5% (peso/volumen) de polisorbato 80, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 1% (peso/volumen) de polioxámero 188, aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de acetato, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de citrato, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de fosfato, y aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de arginina.

En otra modalidad, la inhibición o prevención de la fragmentación comprende el cambio de pH de la formulación hacia niveles más ácidos agregando ácido, titulación o diálisis o varios procesos de filtración conocidos en la técnica para reducir el pH, por ejemplo, pero sin limitarse a, diálisis o filtración de flujo tangencial.

En otra modalidad, la inhibición o prevención de la fragmentación comprende el uso de amortiguadores específicos tal como fosfato o citrato.

En otra modalidad del segundo aspecto, la invención proporciona un método para detectar la segmentación de una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda en una formulación que contiene histidina, el método comprende las etapas de incluir por lo menos un quelante de metal en la formulación y analizar por lo menos una porción de la cadena ligera lambda para la segmentación.

Breve Descripción de los Dibujos Los objetos, características y ventajas anteriores y adicionales de la presente invención, así como la invención por sí misma, serán entendidos más completamente a partir de la siguiente descripción de las modalidades preferidas cuando se leen junto con los dibujos anexados, en donde: La figura 1 muestra la región bisagra de una molécula de anticuerpo.

La figura 2 muestra el fraccionamiento (fracciones 1-4) de las diferentes especies de J695 después de la cromatografía por exclusión de tamaño.

La figura 3 muestra la evaluación de las diferentes fracciones de SEC del figura 2 analizada por SDS-PAGE que muestra una especie no reducible (NR, por su abreviatura en inglés), una cadena pesada (HC, por su abreviatura en inglés), una cadena ligera (LC, por su abreviatura en inglés), y fragmentos de la HC (HC-Fc) en la fracción 3 y las LC y HC-Fab en la fracción 4.

La figura 4 muestra un análisis por LC/ESI-MS de la fracción 3 de la figura 2, después de desglicosilación , que muestra múltiples sitios de segmentación en la HC en la región bisagra. Los picos se han etiquetado (a) a (e) y la identidad de los picos y del sitio de segmentación se proporcionan en la tabla 1.

La figura 5 muestra el análisis por MS de la fracción 4 de la figura 2 que muestra el fragmento Fab correspondiente en esta fracción. Los picos se etiquetan de (f) a (j) y la identidad de los picos y de los sitios de segmentación se proporciona en la tabla 1.

La figura 6 muestra un análisis por MS de la fracción 4 de la figura 2, que muestra la LC libre de los residuos de aminoácido 1-215 y la HC libre de los residuos de aminoácido 1-217.

La figura 7 muestra un análisis por CE-SDS de la fracción 3 de la figura cuadro 2 que muestra el fragmento 2 (Fab + Fc) mientras la fracción 4 contuvo Fab y los fragmentos de LC y HC. El fragmento 2 en el anticuerpo intacto se determina bien a partir de otros picos.

La figura 8 muestra la diálisis de J695 (Mab-lote 1) que contiene 500 ppb de hierro contra el amortiguador de ácido cítrico usando una membrana de 10,000 MWCO.

La figura 9 muestra diversos niveles de sales de metal (2.5, 10 y 50 ppm) añadidas a un lote de control normal de J695, incubadas durante 1 mes a 40°C y analizadas por CE-SDS.

La figura 10 muestra un análisis por CE-SDS después de la incubación de J695 que contiene 500 ppb de hierro con 1 mM de deferoxamina, durante 1 mes a 40°C.

La figura 11 muestra un lote normal de J695 sin hierro, después de la diálisis contra agua, e incubación con histidina, hierro, o hierro e histidina.

La figura 12 muestra una comparación del fragmento 2 de la figura 2 por ESl/LC-MS de J695 sometido a esfuerzo que contiene 500 ppb de hierro contra un lote normal sometido a esfuerzo.

La figura 13 muestra el análisis de la especie Fab correspondiente que revela que los sitios de segmentación fueron comparables cuando J695 sometido a esfuerzo que contuvo hierro fue comparado con un lote normal sometido a esfuerzo.

La figura 14 muestra el análisis de los fragmentos de LC y HC que revela niveles más altos de los fragmentos de las cadenas pesadas (1-217) y ligeras (1-215).

La figura 15 muestra la investigación de la fragmentación inducida por hierro de las moléculas de IgG que contienen una cadena ligera lambda o kappa.

La figura 16 muestra la secuencia de residuos en las cadenas ligeras lambda o kappa y los enlaces que se fragmentan.

Descripción Detallada de la Invención /. Definiciones El término "anticuerpo" se refiere ampliamente a cualquier molécula de inmunoglobulina compuesta de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), interconectadas por los enlaces de disulfuro o cualquier fragmento, mutante, variante, o derivación funcional de las mismas, que conservan las características esenciales de unión a epítopo de una molécula de Ig. Tal formato de anticuerpo mutante, variante, o derivado se conoce en la técnica, cuyas modalidades no limitantes se discuten en la presente.

En un anticuerpo integral, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta por tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones de VH y VL se pueden subdividir adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones de determinación de complementariedad (CDR, por su abreviatura en inglés), intercaladas con las regiones que son conservadas, llamadas regiones marco (FR, por su abreviatura en inglés). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, ubicadas de la terminal amino a la terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, I g E , IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2) o subclase.

El término "región Fe" se refiere a la región de terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina, que se puede generar por la digestión de papaína de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variable. La región Fe de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y comprende opcionalmente un dominio CH4. Los reemplazos de los residuos de aminoácido en la porción Fe para alterar la función efectora de anticuerpo se conocen en la técnica (Patentes Norteamericanas Nos.: 5,648,260 y 5,624,821). La porción Fe de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción de citocina, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por su abreviatura en inglés), fagocitosis, citotoxicidad dependiente de complemento (CDC, por su abreviatura en inglés) e vida útil/índice de eliminación del anticuerpo y complejos de antígeno-anticuerpo. Ciertos isotipos humanos de IgG, particularmente IgGI e lgG3, ADCC mediato y CDC vía la unión a FcyRs y complemento Clq, respectivamente. La dimerización de dos cadenas pesadas idénticas de una inmunoglobulina es mediada por la dimerización de los dominios CH3 y es estabilizada por los enlaces de disulfuro dentro de la región bisagra (Huber y colaboradores (1976) Nature 264:415-20; Thies y colaboradores (1999) J. Mol. Biol. 293:67-79). La mutación de los residuos de cisteína dentro de las regiones bisagra para prevenir que los enlaces de disulfuro de cadena pesada-cadena pesada desestabilicen la dimerización de los dominios CH3. Los residuos responsables de la dimerización de CH3 se han identificado (Dall'Acqua (1998) Biochem. 37:9266-73). Por lo tanto, es posible generar una mitad monovalente de Ig. Las moléculas de Ig de mitad monovalente se han encontrado en naturaleza para las subclases IgG e IgA (Seligman (1978) Ann. Immunol. 129:855-70; Biewenga y colaboradores (1983) Clin. Exp. Immunol. 51:395-400). Un mitad de molécula de Ig puede tener ciertas ventajas en la penetración de tejido debido a su tamaño más pequeño que el de un anticuerpo regular. En una modalidad, por lo menos un residuo de aminoácido se sustituye en la región constante de la proteína de unión de la invención, por ejemplo la región Fe, tal que la dimerización de las cadenas pesadas sea alterada, dando por resultado mitades de moléculas de Ig. La cadena ligera puede ser una de tipo kappa o lambda.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo o "porción de anticuerpo" incluye los fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unir específicamente a un antígeno (por ejemplo, hlL-12 y/o hlL-23). Tales modalidades del anticuerpo pueden también ser biespecíficas, dobles específicas, o multiespecíficas, por ejemplo, unen específicamente dos o más diferentes antígenos. Se ha mostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar por los fragmentos de un anticuerpo integral. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un enlace de disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de una sola ramificación de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región de determinación de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por los genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un enlace sintético que les permite hacerse como una sola cadena de proteína en donde las regiones de VL y VH se combinan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena simple (scFv); ver por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena simple también se piensan para ser comprendidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena simple, tal como diacuerpos también son comprendidas. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en donde los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptido, pero usando un enlace que es demasiado corto para permitir la combinación entre los dos dominios en la misma cadena, para de tal modo forzar a que los dominios se combinen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P., y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., y colaboradores (1994) Structure 2:1121-1123). Tales porciones de unión de anticuerpo se conocen en la técnica (Kontermann y Dubel eds. (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York. pp. 790. Además, los anticuerpos de cadena simple también incluyen los "anticuerpos lineales" que comprenden un par de segmentos Fv en tándem (VH-CH 1 -VH-CH 1 ) que, junto con los polipéptidos complementarios de cadena ligera, forman un par de regiones de unión a antígeno (Zapata y colaboradores (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062; Patente Norteamericana No. 5,641 ,870).

Incluso además, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de moléculas más grandes de inmunoadhesión, formadas por la asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para hacer una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., y colaboradores (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y etiqueta de polihistidina de terminal C para hacer las moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., y colaboradores (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpo, tal como los fragmentos Fab y F(ab')2, se pueden preparar de los anticuerpos enteros usando técnicas convencionales, tal como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de los anticuerpos enteros. Por otra parte, los anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión, se pueden obtener usando técnicas estándar de DNA recombinante, según lo descrito en la presente. Las porciones de unión a antígeno preferidas son dominios o pares completos de dominios completos.

El término "proteína de unión polivalente" se refiere a una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno. En una modalidad, la proteína de unión polivalente se diseña para tener tres o más sitios de unión a antígeno, y generalmente no es un anticuerpo natural. El término "proteína de unión multiespecífica" también se refiere a una proteína de unión capaz de unir dos o más objetivos relacionadas o sin relación. Las proteínas de unión de dominio variable dual (DVD-lg™) comprenden dos o más sitios de unión a antígeno y son las proteínas de unión tetravalentes o polivalentes. Las DVD-lg™ pueden ser monoespecíficas, es decir, capaces de unir un antígeno, o multiespecíficas, es decir, capaces de unir dos o más antígenos. Las proteínas de unión DVD-lg que comprenden dos polipéptidos de DVD-lg de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD-lg de cadena ligera son referidos como DVD--lg. Cada mitad de DVD--lg™ comprende un polipéptido de DVD-lg™ de cadena pesada, y un polipéptido de DVD-lg™ de cadena ligera, y dos sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDR implicadas en la unión a antígeno por sitio de unión a antígeno.

El término "anticuerpo biespecífíco" se refiere a los anticuerpos integrales que son generados por la tecnología de quadroma (Milstein, C. y A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40), por la conjugación química de dos diferentes anticuerpos monoclonales (Staerz, U.D. y colaboradores (1985) Nature 314(6012):628-31 ), o por "botón en ojal" o métodos similares que introducen mutaciones en la región Fe (Holliger, P. y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-8.18), dando por resultado múltiples y diferentes especies de inmunoglobulina de las cuales solamente una es el anticuerpo biespecífíco funcional. Por función molecular, un anticuerpo biespecífíco une un antígeno (o epítopo) en una de sus dos ramificaciones de unión (un par de HC/LC), y une un diferente antígeno (o epítopo) en su segunda ramificación (un diferente par de HC/LC). Por esta definición, un anticuerpo biespecífico tiene dos ramificaciones de unión a antígeno distintas (en ambas secuencias de especificidad y CDR), y es monovalente para cada antígeno al cual se une.

El término "anticuerpo específico dual" se refiere a un anticuerpo integral que puede unir dos diferentes antígenos (o epítopos) en cada una de sus dos ramificaciones de unión (un par de HC/LC) (Publicación PCT No. WO 02/02773). Por consiguiente, una proteína de unión específica dual tiene dos ramificaciones de unión a antígeno idénticas, con especificidad idéntica y secuencias idénticas de CDR, y es bivalente para cada antígeno a el cual se une.

Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena pesada o ligera. Las secuencias de aminoácido de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera de IgG humano se conocen en la técnica.

El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos a excepción de las mutaciones naturales posibles que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, los cuales son dirigidos contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb se dirige contra un solo determinante en el antígeno. No debe interpretarse que el modificante "monoclonal" requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal es producido por la tecnología de hibridoma.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias variables de región de cadena pesada y ligera de una especie y las secuencias de región constante de otra especie, tal como los anticuerpos que tienen las regiones variables murinas de cadena pesada y ligera ligadas a las regiones constantes humanas.

El término "anticuerpo con CDR injertada" se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie pero en donde las secuencias de uno o más regiones CDR de VH y/o VL se reemplazan con las secuencias de CDR de otras especies, tal como los anticuerpos que tienen regiones variables murinas de cadena pesada y ligera en donde una o más de las CDR murinas (por ejemplo, CDR3) se han reemplazado con las secuencias humanas de CDR.

El término "anticuerpo humano" incluye los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes que corresponden a las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana según lo descrito por Kabat y colaboradores (ver Kabat, y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, las mutaciones introducidas por la mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y particularmente CDR3. Las mutaciones se introducen preferiblemente usando el "método de mutagénesis selectiva" descrito en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, cuyo contenido completo es incorporado por referencia en la presente. El anticuerpo humano puede tener por lo menos una posición reemplazada con un residuo de aminoácido, por ejemplo, un residuo de aminoácido de aumento de actividad que no es codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. El anticuerpo humano puede tener hasta veinte posiciones reemplazadas con los residuos de aminoácido que no son parte de la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana. En otras modalidades, se reemplazan hasta diez, hasta cinco, hasta tres o hasta dos posiciones. En una modalidad preferida, estos reemplazos son dentro de las regiones CDR según lo descrito detalladamente más adelante. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", según lo utilizado en la presente, no se piensa para incluir los anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mamífera, tal como un ratón, se han injertado en las secuencias marco humanas. Los métodos para la generación de anticuerpos humanos o completamente humanos se conocen en la técnica e incluyen la transformación EBV de las células B humanas, la selección de los anticuerpos humanos o completamente humanos de las bibliotecas de anticuerpo preparadas por la expresión en fago, expresión en levadura, expresión en ARNm u otras tecnologías de expresión, y también de ratones u otras especies que son transgénicas para todo o una parte del locus de Ig humano que comprende todo o una parte de las regiones genómicas de cadena pesada y ligera definidas adicionalmente más arriba. Los anticuerpos humanos seleccionados pueden ser de afinidad madurada por los métodos reconocidos en la técnica que incluyen la mutagénesis in vitro, preferiblemente de las regiones CDR o residuos adyacentes, para aumentar la afinidad para el objetivo previsto.

La frase "anticuerpo humano recombinante" incluye los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descrita más adelante en la sección II), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo humano recombinante, combinatoria (descrita más adelante en la sección III), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo, Taylor, L.D., y colaboradores (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287-6295) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique la división de secuencias genéticas de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (ver Kabat, E.A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a la mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son las secuencias que, mientras se derivan y relacionan las secuencias de VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vivo. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos recombinantes son el resultado del método de mutagénesis selectiva o retromutación o ambos.

Un "anticuerpo aislado", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diversas especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente a IL-12 e IL-23 humana, por ejemplo, une la subunidad p40 de IL-12/IL-23 humana, está sustancialmente libre de los anticuerpos que unen específicamente los antígenos distintos a IL-12 y IL-23 humana). Un anticuerpo aislado que une específicamente IL-12 e IL-23 humana puede, sin embargo, tener una reactividad cruzada con otros antígenos, tal como moléculas de IL-12 e IL-23 humana de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o químico.

Un "anticuerpo neutralizante", según lo utilizado en la presente (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad IL-12 e IL-23 humana" o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de la subunidad p40 de IL-12/IL-23"), se piensa para referirse a un anticuerpo cuya unión a IL-12 e IL-23 humana (por ejemplo, la unión a la subunidad p40 de IL-12/IL-23) resulta de la inhibición de la actividad biológica de IL-12 e IL-23 humana (por ejemplo, actividad biológica de la subunidad p40 de IL-12/IL-23). Esta inhibición de la actividad biológica de IL-12 y/o IL-23 humana se puede determinar midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de IL-12 e IL-23 humana, tal como la inhibición de la proliferación de blastos de fitohemaglutinina humana en un análisis de proliferación de blastos de fitohemaglutinina (PHA), o la inhibición de la unión de receptor en el análisis de unión de un receptor de IL-12 e IL-23 humana (por ejemplo, un análisis de inducción de interferón gamma). Estos indicadores de la actividad biológica de IL-12 e IL-23 humana se pueden determinar por uno o más de varios análisis ¡n vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica, y descritos en la Patente Norteamericana No. 6,914,128 (por ejemplo, el ejemplo 3 en la columna 9, línea 31 a columna 113, línea 55), cuyo contenido completo es incorporado por referencia en la presente.

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en donde por lo menos se ha alterado una porción de la secuencia de VH y/o VL para que sea más "human", es decir, más similar a las secuencias de variable de línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo con CDR injertada, en donde las secuencias de CDR humanas se introducen en las secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las secuencias de CDR no humanas correspondientes. También un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmentos del mismo que une específicamente un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo humano y una región de determinación de complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácido de un anticuerpo no humano.

El término "región bisagra" significa la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 al dominio CH2. La región bisagra comprende aproximadamente 25 residuos y es flexible, permitiendo así que las regiones de unión a antígeno de dos terminales N se muevan independientemente. Las regiones bisagra se pueden subdividir en tres dominios distintos: dominios bisagra superiores, centrales, e inferiores (Roux y colaboradores (1998) J. Immunol. 161: 4083). Se han hecho algunas moléculas de anticuerpo alteradas en las cuales el número de residuos de cisteína en la región bisagra se reduce a uno para facilitar la incorporación de las moléculas de anticuerpo que es solamente necesario para formar un enlace simple de disulfuro. Esto también proporciona un objetivo específico para unir la región bisagra a otra región bisagra o a una molécula determinante o reportera (Patente Norteamericana No. 5,677,425). El número de residuos de cisteína en la región bisagra del anticuerpo también se ha aumentado (Patente Norteamericana No. 5,677,425). Se han construido otros anticuerpos mutados en los cuales la región bisagra de lgG1 y el dominio CH2 se han reemplazado por la región bisagra de lgG3 humana. (WO 97/11370). Estas moléculas contienen 11 grupos sulfhidrilo para la sustitución de múltiples haptenos vía grupos tiol.

El componente de cadena ligera de la proteína Ig es codificado por 2 loci separados, Igx (kappa) e I g ? (lambda). La proporción de los anticuerpos que contienen las cadenas ligeras ? o ? varía considerablemente entre diferentes especies, por ejemplo, en ratones la relación de :? es de 95:5, en comparación con 60:40 en humanos. En humanos, mientras que casi todas las células de producción de ? tengan ambos alelos ? cambiados, la proporción de células de producción de y ? es similar (Hieter, y colaboradores (1981) Nature 290: 368-72; US 20040231012). Las células B expresan la inmunoglobulina superficial (Ig) con la cadena ligera o ?, una elección que es llamada exclusión de isotipo. El reacomodo de la cadena ligera V-J ocurre en la transición de las células pre B-ll a las células B no maduras, donde la cadena ligera sustituía asociada a la membrana I g µ (mu) es sustituida por la cadena ligera o ? (Osmond, y colaboradores (1998) Immunol. Today 19, 65-68). Aunque el tiempo de reacomodo de la cadena ligera es esencialmente definido, los procesos que activan el reacomodo de locus de cadena ligera no se entienden completamente. Los reacomodos y ? son acontecimientos independientes (Arakawa, y colaboradores (1996) Int. Immunol. 8: 91-99), cuya activación puede ser afectada por diferencias en la resistencia de sus reforzadores respectivos. Una región que se cree importante en la regulación de la accesibilidad del locus humano ? se ha identificado a aproximadamente 10 Kb hacia abajo de CA7 (Glozak and Blomberg (1996) Mol. Immunol. 33: 427-38; Asenbauer y Klobeck (1996) Eur. J. Immunol. 26: 142-50). Las comparaciones funcionales en el análisis del gene reportero identificaron una región potenciadora central que es flanqueada por los elementos que pueden reducir drásticamente la actividad potenciadora en las células pre-B (Glozak y Blomberg (1996)). Aunque los estudios de transfección mostraron que las regiones potenciadoras ? y ? 3' parecen ser funcionalmente equivalentes, otras secuencias (funcionales) que flanquean los motivos potenciadores centrales son notablemente distintos. La supresión dirigida del potenciador 3' en los ratones transgénicos mostró que esta región no es esencial para el reacomodo y expresión del locus ? pero se requiere para establecer la relación de ?:? (Gorman, y colaboradores (1996) Immunity 5: 241-52).

El locus ? de Ig humana en el cromosoma 22q11.2 es de tamaño 1.1 Mb y contiene comúnmente 70 genes VA y 7 segmentos genéticos JA-CA (Frippiat, y colaboradores (1995) Hum. Mol. Genet. 4: 983-91; Kawasaki, y colaboradores (1997) Genome Res. 7: 260-61). Aproximadamente la mitad de los genes VA se consideran como funcionales y JA-CA 1, 2, 3 y 7 son activos. Los genes VA se organizan en 3 grupos que contienen distintos grupos familiares del gene V. Existen 10 familias del gene VA, VAIII es la más grande la cual es representada por 23 miembros. En los linfocitos humanos de sangre periféricos, la mayoría de los segmentos del gene V próximos a J-C en el grupo A, de las familias I, II e III, se reacomodan preferencialmente, la contribución del segmento 2a2 VA (Giudicelli, y colaboradores (1997) Nucí. Acids Res. 25: 206-11.) es inusualmente alta (Giudicelli, y colaboradores (1997) Nucí. Acids Res. 25: 206-11.) Todos los segmentos del gene ? tienen la misma polaridad, que permite el reacomodo de supresión (Combriato y KIobeck (1991) Eur. J. Immunol. 21: 1513-22). La diversidad de secuencia del repertorio de IgA es proporcionada principalmente por la combinación de VA-JA. La diversidad adicional de CDR3 debido a las adiciones del nucleótido N (no codificado) o a P (palindrómico) en la unión de V a J, aunque no sea tan extensa como se observa en el reacomodo de IgH, parece ser utilizada con mucho más frecuencia en humanos que en ratones (Foster, y colaboradores (1997) Clin. Invest. 99, 1614-27; Ignatovich, PhD thesis, University of Cambridge, 1998; Bridges y colaboradores (1995) J. Clin. Invest. 96: 831-41; Víctor y colaboradores (1994) J. Immunol. 152: 3467-75), donde la actividad de TdT (transferasa terminal del desoxirribonucleótido) es infrarregulada al momento del reacomodo de la cadena ligera. Una alineación de varias secuencias de cadena ligera A se proporciona a continuación, lo cual indica que existe una secuencia de consenso de QPKAXPXVTLFPPSSEELQANKATLVCLXSDFYPGAVTVAWKADXS PVKXGVETTXPSKQ SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCXVTHEGSTVEKTVAPXECS; donde X es A, N, T, S, I, V, G, K, Q, o R. 1 60 hCM (1) QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA WKADGSPVKAGVETTKPSKQ hCI2 (1) QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTTPSKQ hCI3 (1) QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVA WKADSSPVKAGVETTTPSKQ hCI7 (1) QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTV AWKADGSPVKVGVETTKPSKQ 61 105 hCM (61) SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKT VAPTECS hCI2 (61) SNN KYAASS Y LSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKT VAPTECS hCI3 (61) SNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTH EGSTVEKT VAPTECS hCI7 (61) SNN KYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTH EGSTVEKT VAPAECS Las cadenas kappa de anticuerpo humano se han clasificado en cuatro subgrupos en base a las secuencias de aminoácido no variantes (ver, por ejemplo, Kabat y colaboradores (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest (4ta ed.), publicado por U.S. Department of Health and Human Services) Parecen ser aproximadamente 80 genes VK humanos, pero solamente un subgrupo IV del gene VK se ha identificado en el genoma humano (ver Klobeck, y colaboradores (1985) Nucleic Acids Research, 13:6516-6528). La secuencia de nucleótido de Hum4VL se define en Kabat y colaboradores (1991), supra. Los términos "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y "etiquetado de Kabat" se utilizan alternativamente en la presente. Estos términos, que se reconocen en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de residuos de aminoácido que son más variables (es decir, hipervariables) que otros residuos de aminoácido en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo, o a una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat y colaboradores (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391; Kabat, E.A. y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH No. 91-3242). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 65 para CDR2, y posiciones de aminoácido 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable oscila de las posiciones de aminoácido 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácido 50 a 56 para CDR2, y posiciones de aminoácido 89 a 97 para CDR3.

Según lo utilizado en la presente, el término "CDR" se refiere a la región de determinación de complementariedad dentro de una secuencia variable de anticuerpo. Existen tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera, que se designan como CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Los límites exactos de estas CDR se han definido diferentemente de acuerdo con diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Id.) no sólo proporciona un sistema de numeración de residuo ambiguo aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino también proporciona los límites de residuo exactos que definen las tres CDR. Estas CDR se pueden referir como CDR de Kabat. Chotia y colaboradores encontraron que ciertas porciones secundarias dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones estructurales de péptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad en el nivel de secuencia de aminoácido (Chotia y colaboradores (1987) Mol. Biol. 196:901-917; Chotia y colaboradores (1989) Nature 342:877-883). Estas porciones secundarias fueron designadas como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 donde "L" y "H" designan las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones pueden ser referidas como CDR de Chotia, que tienen límites que se traslapan con las CDR de Kabat. Otros límites que definen las CDR que se traslapaba con las CDR de Kabat han sido descritos por Padlan (1995) FASEB J. 9:133-139 y MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5):732-45. Aún otras definiciones del límite de las CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas descritos en la presente, pero no obstante se traslaparán con las CDR de Kabat, aunque puedan acortarse o alargarse debido a la predicción o hallazgos experimentales que los residuos o grupos de residuos particulares o incluso CDR completas que no afectan significativamente la unión a antígeno. Los métodos usados en la presente pueden utilizar las CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas modalidades utilicen las CDR definidas por Kabat o Chotia.

Según lo utilizado en la presente, término "marco" o "secuencia de marco" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR se puede determinar por diferentes sistemas, el significado de una secuencia marco está sujeta a diferentes interpretaciones correspondientemente. Las seis CDR (CDR-L1, -L2, y -L3 de cadena ligera y las CDR-H1, -H2, y -H3 de cadena pesada) también dividen las regiones marco en la cadena ligera y en la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en donde CDR1 se ubica entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región marco, según lo referido por otras, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una cadena simple de inmunoglobulina natural. Según lo utilizado en la presente, una FR representa una de las cuatro subregiones, y las FR representan dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región marco.

El término "quelante" se refiere ampliamente a un agente que se une a o forma complejos con los iones de metal. En una modalidad, tal unión o formación de complejo incluye uno o más átomos del quelante de metal. La unión y formación de complejo pueden ser cualquier forma y combinación de enlaces, por ejemplo, covalente, dativa, o iónica. En una modalidad, un quelante se une a o forma un complejo con los iones de metal y de tal modo secuestra los iones de metal. Los derivados, análogos, y formatos de combinación de los quelantes de metal se conocen en la técnica, cuyas modalidades no limitantes se discuten más adelante.

El término "lote normal sometida a esfuerzo" significa un lote que se ha incubado a una temperatura elevada (comúnmente 25°C o 40°C) en ausencia de metales. Por ejemplo, en un lote normal sometido a esfuerzo, la segmentación de una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda (por ejemplo, un anticuerpo) puede ocurrir en la región bisagra, tal como, por ejemplo, en múltiples enlaces de péptido a través de la secuencia de región de cadena pesada Ser-Cys-Asp-Lys-Thr-His-Thr-Cys.

La frase "libre sustancialmente de metal" o "concentración de metal en la formulación que no da lugar a la segmentación de la cadena ligera lambda" se refiere a una concentración de metal en la formulación que es suficientemente baja (por ejemplo, menos de aproximadamente 160 ppb, preferiblemente menos de aproximadamente 110 ppb y más preferiblemente menos de aproximadamente 70 ppb a una temperatura de, por ejemplo, 25°C o 40°C) tal que sea observado un nivel normal o aceptable de fragmentación o segmentación de una cadena ligera lambda que contiene el anticuerpo presente en la formulación, por ejemplo, el nivel de segmentación observado en un lote sometido a esfuerzo normal correspondiente, por ejemplo, aproximadamente 0.5% de fragmentación. Por ejemplo, la concentración de metal en la formulación es tal que solamente se observa menos de aproximadamente 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% o 0.5% de fragmentación o segmentación en la cadena ligera lambda (por ejemplo, la región bisagra de la cadena lambda). Se puede determinar el nivel de fragmentación o segmentación de una cadena ligera lambda que contiene el anticuerpo en una formulación, por ejemplo, por SEC, electroforesis capilar y/o espectrometría de masa.

El término "sujeto" se piensa para incluir los organismos vivos, por ejemplo, procariotas y eucariotas. Los ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas, y animales transgénicos no humanos. En las modalidades específicas de la invención, el sujeto es un humano.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a las preparaciones que están en tal forma que permiten la actividad biológica de los ingredientes activos que serán inequívocamente efectivos, y que no contienen ningún componente adicional que sea significativamente tóxico para los sujetos a los cuales la formulación sería administrada. Los excipientes "farmacéuticamente aceptables" (por ejemplo, vehículos, aditivos) son los que se pueden administrar razonablemente a un sujeto mamífero para proporcionar una dosis efectiva del ingrediente activo utilizado.

Una formulación "estable" es una en el cual el anticuerpo en la misma conserva esencialmente su estabilidad física estabilidad y/o estabilidad química y/o actividad biológica durante el almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de la proteína están disponibles en la técnica y por ejemplo, se repasan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad se puede medir a una temperatura seleccionada durante un periodo seleccionado. Preferiblemente, la formulación es estable durante 24 meses a entre 2 y 8°C. Además, la formulación es preferiblemente estable durante por lo menos 18 meses, y más preferiblemente durante 24 meses, a entre -20 y -80°C. Además, la formulación es preferiblemente estable después del congelamiento (por ejemplo, a -80°C) y descongelamiento (por ejemplo, a 25 a 37°C) de la formulación, más adelante referido como un "ciclo de congelamiento/descongelamiento." Preferiblemente, la formulación es estable después de por lo menos cinco ciclos de congelamiento/descongelamiento.

Un anticuerpo "conserva su estabilidad física" en una formulación farmacéutica si no presenta sustancialmente ninguna muestra de agregación, precipitación y/o desnaturalización durante el examen visual del color y/o claridad, o según lo medido por la dispersión de luz UV o por cromatografía por exclusión de tamaño.

Un anticuerpo "conserva su estabilidad química" en una formulación farmacéutica, si la estabilidad química en un momento dado es tal que el anticuerpo aún se considera que conserva su actividad biológica según lo definido más adelante. La estabilidad química se puede determinar detectando y cuantificando las formas químicamente alteradas del anticuerpo. La alteración química puede implicar la modificación del tamaño (por ejemplo, recorte) que se puede evaluar usando, por ejemplo, la cromatografía por exclusión de tamaño, SDS-PAGE y/o ionización de desorción de láser asistida por matriz/espectrometría de masa de tiempo de proceso (MALDI/TOFMS). Otros tipos de alteración química incluyen la alteración de carga (por ejemplo, que ocurre como resultado de la desamidación) , que se puede evaluar mediante, por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico.

Un anticuerpo "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si el anticuerpo en una formulación farmacéutica es biológicamente activo para su propósito previsto. Por ejemplo, conserva la actividad biológica si la actividad biológica del anticuerpo en la formulación farmacéutica es de aproximadamente 30%, aproximadamente 20%, o aproximadamente 10% (dentro de los errores del análisis) de la actividad biológica exhibida cuando la formulación farmacéutica fue preparada (por ejemplo, según lo determinado en un análisis de unión a antígeno).

"Isotónico" puede significar, por ejemplo, que la formulación de interés tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas tendrán generalmente una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La isotonicidad se puede medir usando, por ejemplo, una presión de vapor o un osmómetro de tipo congelamiento por hielo. Un "agente de tonicidad" es un compuesto que hace a la formulación isotónica.

Un " p o I i o I " es una sustancia con múltiples grupos de hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductivas y no reductivas), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. Los polioles preferidos en la presente tienen un peso molecular que es de menos de aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un "azúcar reductivo" es uno que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir los iones de metal o reaccionar de manera covalente con la lisina y otros grupos amino en las proteínas y un "azúcar no reductivo" es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductivo. Los ejemplos de azúcares reductivos son fructosa, mañosa, maltosa, lactosa, arabinosa, xilosa, ribosa, ramnosa, galactosa y glucosa. Los azúcares no reductivos incluyen sucrosa, trehalosa, sorbosa, melecitosa y rafinosa. El manitol, xilitol, eritritol, treitol, sorbitol y glicerol son ejemplos de alcoholes de azúcar. En cuanto a los ácidos de azúcar, éstos incluyen L-gluconato y sales metálicas del mismo. El poliol puede también actuar como agente de tonicidad. En una modalidad de la invención, un ingrediente de la formulación es manitol en una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/ml (por ejemplo, 1-10%). En una modalidad particular de la invención, la concentración de manitol es de 30 a 50 mg/ml (por ejemplo, 3-5%). En una modalidad preferida de la invención, la concentración de manitol es de aproximadamente 40 mg/ml (por ejemplo, 4%).

Según lo utilizado en la presente, "amortiguador" se refiere a una solución amortiguada que resiste los cambios de pH por la acción de sus componentes conjugados de ácido-base. Un amortiguador usado en esta invención tiene un pH en el intervalo de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 4.5, aproximadamente 4.5 a aproximadamente 5.0, aproximadamente 5.0 a aproximadamente 5.5, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6, aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5, aproximadamente 5.7 a aproximadamente 6.3, aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.0, aproximadamente 7.5 a aproximadamente 8.0. En una modalidad, un amortiguador de la invención tiene un pH de aproximadamente 5 o menos. En una modalidad, un amortiguador de la invención tiene un pH de aproximadamente 6. Los ejemplos de los amortiguadores que controlarán el pH en este intervalo incluyen acetato (por ejemplo acetato de sodio), succcinato (tal como succcinato de sodio), gluconato, histidina, metionina, citrato, fosfato, imidazol, y otros amortiguadores de ácido orgánico. En una modalidad de la invención, el sistema amortiguador comprende histidina. En una modalidad particular de la invención, el sistema amortiguador comprende histidina y metionina. En una modalidad, el sistema amortiguador comprende 1-50 mM de histidina (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) con un pH de 5-7, por ejemplo, aproximadamente 5 o aproximadamente 6. En una modalidad preferida, el sistema amortiguador de la invención comprende 1-50 mM de histidina (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y 1-50 mM de metionina (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) con un pH de 5-7, por ejemplo, aproximadamente 5 o aproximadamente 6. En una modalidad, el sistema amortiguador comprende aproximadamente 10 mM de histidina, con un pH de aproximadamente 6. En una modalidad, el sistema amortiguador comprende aproximadamente 10 mM de histidina, con un pH de aproximadamente 5 o menos. En una modalidad particularmente preferida de la invención, el amortiguador comprende aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 10 mM de metionina con un pH de aproximadamente 6. En otra modalidad preferida de la invención, el amortiguador comprende aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 10 mM de metionina con un pH de aproximadamente 5 o menos.

En otra modalidad de la invención, el sistema amortiguador comprende histidina y fosfato. En una modalidad particular, el sistema amortiguador comprende histidina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM, y fosfato (por ejemplo, hidrógeno-fosfato de sodio) a una concentración de entre 1-60 mM (por ejemplo, entre 10-50 mM, entre 20-40 mM) y preferiblemente 30 mM. En una modalidad preferida, el sistema amortiguador comprende histidina, metionina y fosfato, por ejemplo, el sistema amortiguador comprende histidina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM, metionina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM, y fosfato a una concentración de entre 1-60 mM (por ejemplo, entre 10-50 mM, entre 20-40 mM, o entre 20-30 mM) y preferiblemente de aproximadamente 30 mM.

En otra modalidad, el sistema amortiguador comprende la histidina y citrato. En una modalidad particular, el sistema amortiguador comprende histidina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM, y citrato a una concentración de entre 1-60 mM (por ejemplo, entre 10-50 mM, o entre 20-40 mM) y preferiblemente de aproximadamente 30 mM. En una modalidad preferida, el sistema amortiguador comprende histidina, metionina y citrato, por ejemplo, el sistema amortiguador comprende histidina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM, metionina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM, y citrato a una concentración de entre 1-60 mM (por ejemplo, entre 10-50 mM, o entre 20-40 mM) y preferiblemente de aproximadamente 30 mM.

En aún otra modalidad, el sistema amortiguador comprende imidazol. En una modalidad, el sistema amortiguador comprende imidazol a una concentración de entre 1-50 mM, entre 5-40 mM, entre 5-30 mM, entre 10-30 mM, entre 10-20 mM, y preferiblemente, por ejemplo, 10 mM. En una modalidad preferida, el sistema amortiguador comprende imidazol y metionina, por ejemplo, imidazol a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 5-30 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente 10 mM, y metionina a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 10-30 mM, o entre 10-20 mM) y preferiblemente de aproximadamente 10 mM.

En aún otra modalidad, el sistema amortiguador comprende fosfato y citrato, por ejemplo, fosfato (por ejemplo, hidrógeno-fosfato de sodio) a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 5-30 mM, entre 10-20 mM) y preferiblemente 10 mM, y citrato (ácido cítrico) a una concentración de entre 1-50 mM (por ejemplo, entre 5-40 mM, entre 5-30 mM, entre 10-20 mM) y preferiblemente 10 mM.

En cualquiera de los sistemas amortiguadores anteriores, el pH está preferiblemente entre aproximadamente 2 y 7, entre aproximadamente 3 y 7, entre aproximadamente 4 y 7, por ejemplo, aproximadamente 5 o menos (por ejemplo, entre aproximadamente 2 y 5, entre aproximadamente 2.5 y 5, entre aproximadamente 3 y 5, entre aproximadamente 3.5 y 5, entre aproximadamente 4.0 y 5 o entre aproximadamente 4.5 y 5) o aproximadamente 6.

En un sentido farmacológico, en el contexto de la presente invención, una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" de un anticuerpo se refiere a una cantidad efectiva en la prevención o tratamiento de un trastorno para el tratamiento cuyo anticuerpo es efectivo. Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficiara del tratamiento con el anticuerpo. Este incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas que incluyen las condiciones patológicas que predisponen al sujeto al trastorno implicado.

Un "conservador" es un compuesto que se puede incluir en la formulación esencialmente para reducir la acción bacteriana en la misma, facilitando así la producción de la formulación para usos múltiples, por ejemplo. Los ejemplos de conservadores potenciales incluyen cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en donde los grupos alquilo son compuestos de cadena larga), y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservadores incluyen los alcoholes aromáticos tal como fenol, alcohol butílico y bencílico, parabenos de alquilo tal como parabeno de metilo o propilo, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol.

"Tratamiento" se refiere al tratamiento terapéutico y a medidas profilácticas o preventivas. Aquellas necesarias para el tratamiento incluyen las que son adecuadas para el trastorno así como aquellas en las cuales el trastorno debe ser prevenido.

Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" según lo utilizado en la presente significan modos de administración distinta a la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiacas, intradérmicas, intraperitoneal, transtraqueal, subcutáneas, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracoidea, inyección intraespinal e intraesternal e infusión.

Las frases "administración sistémica", "administrado sistémicamente", "administración periférica" y "administrado periféricamente" según lo utilizado en la presente significa la administración del compuesto, fármaco u otro material distinta a la administración directa en el sistema nervioso central, tal que entre al sistema del paciente y, así, sea sometido al metabolismo y a otros procesos similares, por ejemplo, administración subcutánea.

La frase "portador farmacéuticamente aceptable" es reconocida en la técnica e incluye un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, conveniente para la administración a los mamíferos. Los portadores incluyen relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulado, implicado en llevar o transportar el agente objeto de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no ser perjudicial para el paciente.

La frase "interleucina humana 12" o "IL-12 humana" (abreviada en la presente como hIL- 12, o IL-12), según lo utilizado en la presente, incluye una citocina humana que es secretada principalmente por los macrófagos y células dendríticas. El término incluye una proteína heterodimérica que comprende una subunidad de 35 kD (p35) y una subunidad de 40 kD (p40) las cuales se ligan juntas con un enlace de disulfuro. La proteína heterodimérica es referida como "subunidad p70". La estructura de IL-12 humana se describe adicionalmente en, por ejemplo, Kobayashi, y colaboradores (1989) J. Exp Med. 170:827-845; Seder, y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. 90:10188-10192; Ling, y colaboradores (1995) J. Exp Med. 154:116-127; Podlaski, y colaboradores (1992) Arch. Biochem. Biofis.294:230-237; y Yoon y colaboradores (2000) EMBO Journal 19(14): 3530-3541. El término IL-12 humana se piensa para incluir IL-12 humana recombinante (rhlL-12), que se puede preparar por métodos de expresión recombinantes estándar.

La frase "interleucina humana 23" o "IL-23 humana" (abreviada en la presente como hlL-23, o IL-23), según lo utilizado en la presente, incluye una citocina humana que es secretada principalmente por los macrófagos y células dendríticas. El término incluye una proteína heterodimérica que comprende una subunidad de 19 kD (p19) y una subunidad de 40 kD (p40) que son ligadas juntas con un enlace de disulfuro. La proteína heterodimérica es referida como heterodímero "p40/p19". La estructura de la IL-23 humana se describe adicionalmente en, por ejemplo, Beyer y colaboradores (2008) J. Mol. Biol. 382:942-955; Lupardus y colaboradores (2008) J. Mol. Biol. 382:931-941. El término IL-23 humana se piensa para incluir la IL-23 humana recombinante (rhlL-23), que se puede preparar por métodos de expresión recombinantes estándar.

La frase "subunidad p40 de la IL-12/IL-23 humana" o "subunidad p40 de la IL-12 e IL-23 humana", o "subunidad p40" según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a una subunidad p40 que es compartida por la IL-12 humana e IL-23 humana. La estructura de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 se describe en, por ejemplo, Yoon y colaboradores (2000) EMBO Journal 19(14): 3530-3541.

El término "actividad" incluye actividades tal como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-p40 que une a un antígeno de IL-12 e IL-23 y/o la potencia de neutralización de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-p40 cuya unión a IL-12 humana y/o IL-23 humana inhiba la actividad biológica de IL-12 humana y/o IL-23 humana, por ejemplo la inhibición de la proliferación de blastos de PHA o inhibición de la unión de receptor en un análisis de unión del receptor de IL-12 humana (ver, por ejemplo, el ejemplo 3 de la Patente Norteamericana No. 6,914,128).

La frase "resonancia de plasmón de superficial" incluye un fenómeno óptico que permite el análisis de las interacciones biospecíficas en tiempo real por la detección de alteraciones en las concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden y Piscataway, NJ). Para otras descripciones, ver Jónsson, U., y colaboradores (1993) Ann. Biol.

Clin. 51:19-26; Jonsson, U., y colaboradores (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., y colaboradores (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; and Johnnson, B., y colaboradores (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El término "K0ff", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse al índice constante para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno.

El término "Kd", según lo utilizado en la presente, se piensa para referirse a la constante de disociación de una interacción particular del anticuerpo-antígeno.

//. Composiciones y métodos de la invención Usando la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), espectrometría de masa (MS) y electroforesis capilar (CE) para supervisar la fragmentación, fue descubierta una trayectoria de degradación mediante la cual la histidina y metal (hierro o cobre) actúan juntos para fragmentar la cadena ligera lambda que contiene las moléculas fuera. El hierro e histidina son necesarios para acelerar la cinética de fragmentación en la región bisagra de una molécula de anticuerpo a 40°C. El hierro o histidina solos tienen poco o nada de efecto sobre la aceleración de la cinética de fragmentación de la molécula de IgG. Los estudios de adición de metal conducidos con un número de diferentes metales mostraron que la presencia de hierro o cobre en la formulación de anticuerpo resulta en la segmentación del anticuerpo de una manera dependiente de la dosis. La quelación del hierro con deferoxamina, un quelante específico al hierro, bloqueó esta fragmentación. La investigación de las moléculas de IgG que tienen una cadena lambda o kappa mostró que este mecanismo de fragmentación es específico para las moléculas que contienen una cadena lambda. Las cadenas ligeras kappa y lambda se diferencian en sus regiones de terminal C y la cadena ligera lambda tiene un residuo de serina adicional después del residuo de cisteína.

La SEC fue utilizada para supervisar los agregados y fragmentos y para fraccionar los fragmentos del anticuerpo después de la incubación a temperatura elevada durante un periodo prolongado. CE-SDS se utilizó no sólo para cuantificar exactamente los fragmentos sino también para cuantificar las otras especies de degradación. Los espectros de MS de un lote normal sometido a esfuerzo mostraron que los sitios de segmentación principales en el fragmento 2 (Fab + Fc) están entre los residuos C/D, D/K, K/T, T/H y H/T de la cadena pesada (figura 4). La segmentación entre los residuos de serina 217 y cisteína 218 (S/C) de la cadena pesada fue aumentada en las formulaciones que contienen hierro e histidina y por lo tanto los niveles elevados del fragmento de HC 1-217 se observan en los espectros de MS (figura 6). Similar a los lotes normales sometidos a esfuerzo, el fragmento Fab + Fc correspondiente que comienza con cis-218 no fue encontrado. De hecho, fue observada la elevación de un fragmento Fab + Fc que comienza con ácido aspártico (segmentación entre C/D) y una especie que muestra la adición de 27 DA al fragmento de ácido aspártico. La LC libre (residuos 1-217) no fue observada en los espectros S pero fueron detectados los niveles elevados de LC segmentada entre los residuos de E/C que dieron el fragmento 1-215 que terminó con el ácido glutámico. Estos resultados mostraron que la segmentación inducida por hierro fue localizada en los residuos alrededor de los enlaces de disulfuro que mantienen juntas las HC y LC.

Los iones de metal se conocen por catalizar la oxidación y degradación de las proteínas en diferentes maneras. Reaccionan directamente con los grupos tiol de los residuos de cisteína (sitio específico) para producir los radicales o pueden reaccionar con el oxígeno para producir un número de especies de oxígeno reactivas tal como el anión radical de superóxido, los radicales de hidroxilo y peróxido de hidrógeno (Li, S. y colaboradores (1995) Biotech. y Bioeng. 48:490-500; Li, S. y colaboradores (1993) Pharm. Res. 10(11 ): 1572-1579; Kocha, T. y colaboradores (1997) BBA 1337:319-326). La especie de oxígeno reactiva producida en presencia de los iones de metal y de un ambiente de reducción (DTT, ascorbato) segmentara la estructura de la proteína (Kim, R. y colaboradores (1985). Aunque no desea limitarse por ninguna teoría particular, es posible que los quelatos de cobre e histidina catalicen una variedad de oxidaciones. Los quelatos de hierro e histidina se han reportado (Davison, A.J. (1968) J. Biol. Chem. 243(22):6064-6067; Lavanant, H. y colaboradores (1999) Int. J. Mass Spectrom. 185/186/187:11-23). La cadena ligera lambda tiene un residuo de serina libre que está ausente en la cadena kappa. Un reporte reciente ha mostrado que los péptidos que terminan con un residuo de serina de terminal C se hidrolizan eficientemente en presencia de los metales (Yashiro, M. y colaboradores (2003) Org. Biomol. Chem. 1:629-632).

En una modalidad, los métodos de filtración incluyen la diafiltración, ultrafiltración, o una combinación de los mismos. En una modalidad, los métodos de intercambio de amortiguador incluyen diálisis. En otra modalidad, el intercambio de amortiguador incluye el uso de las columnas de desalación. En una modalidad, los métodos de cromatografía incluyen el uso de la cromatografía de afinidad tal como proteína A o cromatografía de intercambio catiónico débil para el capturar el anticuerpo.

En una modalidad, los métodos de intercambio de resina incluyen el uso de Chelex-100 para unir y desprender los metales.

En una modalidad, los aminoácidos en las LC y HC se sustituyen, o suprimen para inhibir la segmentación relacionada con el metal y la histidina. Los aminoácidos que pueden ser sustituidos o suprimidos incluyen el residuo de serina de terminal C presente en la cadena ligera lambda. Otros residuos incluyen el residuo de serina adyacente al residuo de cisteína en la cadena pesada.

///. Anticuerpos convenientes para el uso en las formulaciones de la invención La invención proporciona las formulaciones que comprenden un anticuerpo en una solución amortiguada de histidina que tiene un pH de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7 y que mejora la estabilidad, preferiblemente durante por lo menos aproximadamente 24 meses, por ejemplo, a una temperatura de 2-8°C o a una temperatura de entre -20 y -180°C. En otra modalidad de la invención, la formulación reivindicada permanece estable después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento. En una modalidad preferida, la cantidad de metal en la formulación es suficientemente baja para prevenir la segmentación del anticuerpo, por ejemplo, la segmentación de la cadena ligera lambda del anticuerpo. Preferiblemente, la formulación reivindicada está libre de metal. En otra modalidad preferida, la formulación comprende un quelante de metal, en donde el anticuerpo no se segmenta ni está menos segmentado, por ejemplo, dentro de la región bisagra de la cadena ligera lambda, en presencia de un metal. En aún otra modalidad, la formulación farmacéutica de la invención es conveniente para la inyección se no reutilizable.

Los anticuerpos que se pueden utilizar en la formulación incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, recombinantes, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, o fragmentos de los mismos. Pueden también utilizarse las moléculas de tipo anticuerpo que contienen uno o dos sitios de unión para un antígeno y una parte de Fe de una inmunoglobulina. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos usados en la formulación comprenden por lo menos una porción de una cadena ligera lambda. Los anticuerpos preferidos usados en las formulaciones de la invención son anticuerpos humanos. En una modalidad preferida, la formulación contiene un anticuerpo que es un anticuerpo recombinante humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo. En otra modalidad particular, el anticuerpo es un anticuerpo que contiene la cadena lambda o una porción de unión a antígeno del mismo.

En un aspecto de la invención, la formulación contiene un anticuerpo humano, por ejemplo, un anticuerpo humano que comprende una cadena lambda, que une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23. En una modalidad, el anticuerpo une a la subunidad p40 cuando la subunidad p40 está unida a la subunidad p35 de IL-12. En una modalidad, el anticuerpo une a la subunidad p40 cuando la subunidad p40 está unida a la subunidad p19 de IL-23. En una modalidad, el anticuerpo une a la subunidad p40 cuando la subunidad está unida a la subunidad p35 de IL-12 y también cuando la subunidad p40 está unida a la subunidad p19 de IL-23. En una modalidad preferida, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es un anticuerpo como los descritos en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, cuyo contenido en la presente por la referencia en su totalidad. Por ejemplo, en una modalidad preferida, el anticuerpo une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12 al cual se une un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Y61 y J695, según lo descrito en la Patente Norteamericana No. 6,914,128. Especialmente preferido entre los anticuerpos humanos es J695 según lo descrito en la Patente Norteamericana No. 6,914,128. Otros anticuerpos que unen IL-12 e IL-23 y que se pueden utilizar en las formulaciones de la invención incluyen el anticuerpo humano anti-IL-12 C340, según lo descrito en la Patente Norteamericana No. 6,902,734, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

En una modalidad, la formulación de la invención incluye una combinación de anticuerpos (dos o más), o un "mezcla" de anticuerpos. Por ejemplo, la formulación puede incluir el anticuerpo J695 y uno o más anticuerpos adicionales.

En un aspecto, la formulación de la invención contiene los anticuerpos J695 y porciones de anticuerpo, los anticuerpos relacionados con J695 y porciones de anticuerpo, y otros anticuerpos humanos y porciones de anticuerpo con las propiedades equivalentes a J695, tal como unión de alta afinidad a hlL-12/IL-23 con baja de cinética de disociación y capacidad de alta neutralización. Por ejemplo, en una modalidad de la invención, la formulación contiene un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, que se disocia de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 humana con una Kd de 1.34 x 10"10 M o menos o con una constante de índice Koff de 1 x 103 s 1 o menos, según lo determinado por la resonancia de plasmón superficial. Preferiblemente, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, se disocia de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 humana con una constante de índice koff de 1 x 10"4 s" o menos, y más preferiblemente con una constante de índice k0ff de 1 x 10"5 s"1 o menos, o con una Kd de 1 x 10"10 M o menos, y preferiblemente con una Kd de 9.74 x 10"11 o menos.

La constante de índice de disociación (Koff) de un anticuerpo contra IL-12/IL-23 se puede determinar por la resonancia de plasmón superficial. Generalmente, el análisis de resonancia de plasmón superficial mide las interacciones de unión en tiempo real entre el ligando ( I L - 12 humana recombinante inmovilizada en una matriz de biosensor) y el analito (anticuerpos en la solución) por la resonancia de plasmón superficial (SPR, por su abreviatura en inglés) usando el sistema de BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). El análisis resonancia de plasmón superficial puede también ser realizado inmovilizando el analito (anticuerpos en una matriz de biosensor) y presentando el ligando (IL-12/IL-23 recombinante en la solución) (ver, por ejemplo, los análisis descritos en el ejemplo 5 del documento US 6,914,128, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad). La actividad de neutralización de los anticuerpos contra IL-12/IL-23, o porciones de unión a antígeno de los mismos, se puede determinar usando uno o más de varios análisis in vitro convenientes (ver, por ejemplo, los análisis descritos en el ejemplo 3 del documento US 6,914,128, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia).

En otra modalidad de la invención, la formulación contiene un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, que neutraliza la actividad biológica de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 humana. En una modalidad, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, neutraliza la actividad biológica de p40 libre, por ejemplo, monómero p40 o homodímero de p40, por ejemplo, un dímero que contiene dos subunidades p40 idénticas. En las modalidades preferidas, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, neutraliza la actividad biológica de la subunidad p40 cuando la subunidad p40 está unida a la subunidad p35 de IL-12 y/o cuando la subunidad p40 está unida a la subunidad p19 de IL-23. En varias modalidades, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, inhibe la proliferación de blastos de fitohemaglutinina inducida IL-12 humana en un análisis de PHA in vitro con una Cl50 de 1 x 10*7 M o menos, preferiblemente con una CI5o de 1 x 10"8 M o menos, más preferiblemente con una CI5o de 1 x 10'9 M o menos, muy preferiblemente con una Cl50 de 1 x 10~10 M o menos, e incluso más preferiblemente con una Cl50 de 1 x 10"11 M o menos. En otras modalidades, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, inhibe la producción de IFNv humano inducida por IL-12 humana con una Cl50 de 1 x 10"10 M o menos, preferiblemente con una Cl50 de 1 x 10"11 M o menos, y más preferiblemente con una Cl50 de 5 x 10"12 M o menos.

En aún otra modalidad de la invención, la formulación contiene un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, que tiene una cadena pesada de CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 y una cadena ligera de CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2. En una modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, además tiene una cadena pesada de CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3 y una cadena ligera de CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4. En una modalidad, el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, además tiene una cadena pesada de CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 5 y una cadena ligera de CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6. En una modalidad particularmente preferida, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 7, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de las formulaciones de la invención puede comprender una región constante de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de las regiones constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA y IgE. Preferiblemente, la región constante de cadena pesada del anticuerpo es IgG 1. En varias modalidades, el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, o un fragmento Fv de cadena simple.

Los ejemplos de los anticuerpos que contienen la cadena lambda, por ejemplo, los anticuerpos que contienen la cadena lambda que se pueden incluir en las formulaciones de la invención, son bien conocidos en la técnica y se entiende que son comprendidos por la invención. Los ejemplos de anticuerpos que contienen la cadena lambda incluyen, pero no se limitan a, anticuerpo anti-IL-17, anticuerpo 7, según lo descrito en la Solicitud Internacional WO 2007/149032 (Cambridge Antibody Technology), cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad, el anticuerpo anti-IL-12/IL-23, J695, (Abbott Laboratories), el anticuerpo anti-IL-13, CAT-354, (Cambridge Antibody Technology), el anticuerpo de CD4 anti-humano, CE9y4PE, (IDEC-151, clenoliximab) (Biogen IDEC/Glaxo Smith Kline), el anticuerpo de CD4 anti-humano, IDEC CE9.1/SB-210396 (keliximab) (Biogen IDEC), el anticuerpo de CD80 anti-humano IDEC-114 (galiximab) (Biogen IDEC), el anticuerpo anti-proteína de virus de la rabia CR4098 (foravirumab), y el anticuerpo anti-receptor 2 de ligando de inducción de apoptosis relacionada con TNF humano (TRAIL-2) HGS-ETR2 (lexatumumab) (Human Genome Sciences, Inc.).

IV. Preparación de las formulaciones La presente invención ofrece formulaciones (por ejemplo, formulaciones de proteína y/o formulaciones de anticuerpo) que mejoran las propiedades con respecto a las formulaciones reconocidas en la técnica. Por ejemplo, las formulaciones de la invención tienen una vida útil y/o estabilidad mejoradas con respecto a las formulaciones reconocidas en la técnica. En una modalidad, las formulaciones de la invención tienen una vida útil de por lo menos 18 meses, por ejemplo, en un estado líquido o en un estado sólido. En otra modalidad, las formulaciones de la invención tienen una vida útil de por lo menos de 24 meses, por ejemplo, en un estado líquido o en un estado sólido. En una modalidad preferida, las formulaciones de la invención tienen una vida útil de por lo menos 24 meses a una temperatura de 2-8°C. En una modalidad preferida, las formulaciones de la invención tienen una vida útil de por lo menos de 18 meses o por lo menos 24 meses a una temperatura de entre aproximadamente -20 y -80°C. En otra modalidad, las formulaciones de la invención mantienen la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación. En un aspecto preferido, las formulaciones de la invención comprenden una molécula, por ejemplo, un anticuerpo, que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda, en donde la formulación proporciona resistencia mejorada a la fragmentación de la cadena ligera lambda, por ejemplo, segmentación reducida de la cadena ligera lambda, con respecto a las formulaciones reconocidas en la técnica.

En un aspecto preferido, las formulaciones de la invención están sustancialmente libres de metal. En una modalidad preferida, las formulaciones de la invención están sustancialmente libres de un metal seleccionado del grupo que consiste de Fe2+ y Fe3 + . En otra modalidad preferida, las formulaciones de la invención están sustancialmente libres de un metal seleccionado del grupo que consiste de Cu2+ y Cu1 + . En una modalidad preferida, las formulaciones de la invención comprenden una cantidad de metal que es suficientemente baja para reducir o prevenir la segmentación de la cadena lambda en presencia de histidina, por ejemplo, el metal está presente a una concentración de menos de aproximadamente 5,060 ppb, menos de aproximadamente 1,060 ppb, menos de aproximadamente 560 ppb, menos de aproximadamente 500 ppb, menos de aproximadamente 450 ppb, menos de aproximadamente 400 ppb, menos de aproximadamente 350 ppb, menos de aproximadamente 310 ppb, menos de aproximadamente 300 ppb, menos de aproximadamente 250 ppb, menos de aproximadamente 200 ppb, menos de aproximadamente 160 ppb, menos de aproximadamente 150 ppb, menos de aproximadamente 140 ppb, menos de aproximadamente 130 ppb, menos de aproximadamente 120 ppb, menos de aproximadamente 110 ppb, menos de aproximadamente 100 ppb, menos de aproximadamente 90 ppb, menos de aproximadamente 80 ppb, menos de aproximadamente 70 ppb, menos de aproximadamente 60 ppb, menos de aproximadamente 50 ppb, menos de aproximadamente 40 ppb, menos de aproximadamente 30 ppb, menos de aproximadamente 20 ppb, menos de aproximadamente 10 ppb, o menos de aproximadamente 1 ppb. En una modalidad preferida, el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 160 ppb. En una modalidad preferida, el metal está presente a una concentración de menos de aproximadamente 110 ppb. En una modalidad particularmente preferida, el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 70 ppb, por ejemplo, una concentración de aproximadamente 60 ppb. Las concentraciones máximas intermedias a las concentraciones citadas anteriormente, por ejemplo, menos de aproximadamente 65 ppb, también se piensan como parte de esta invención. Además, los intervalos de valores usando una combinación de cualquiera de los valores citados anteriormente como límites superiores y/o inferiores, por ejemplo, concentraciones entre aproximadamente 50 ppb y aproximadamente 70 ppb, también se piensan como incluidos.

En una modalidad preferida, las formulaciones de la invención están sustancialmente libres de metal después del sometimiento a por lo menos un procedimiento de eliminación de metal, tal como filtración, intercambio de amortiguador, cromatografía o intercambio de resina. Los procedimientos útiles para eliminar el metal de las formulaciones de la invención son conocidos por un experto en la técnica y se describen adicionalmente en la presente, por ejemplo, en los ejemplos más adelante. En otra modalidad preferida, las formulaciones de la invención comprenden un quelante de metal, por ejemplo, tal que la molécula no está segmentada dentro de la región bisagra ni está segmentada dentro de la región bisagra a un nivel que sea menor que el nivel de segmentación observado en la ausencia del quelante de metal. En las formulaciones de la invención, el quelante de metal puede ser, por ejemplo, un sideróforo, calixerenos, ácido aminopolicarboxílico, ácido hidroxiaminocarboxílico, glicina sustituida con N, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), un quelante de hierro bidentado, tridentado o hexadentado, un quelante de cobre, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos. En una modalidad, el quelante de metal es deferoxamina. Los quelantes de metal útiles en las formulaciones de la invención son conocidos por un experto en la técnica, y los ejemplos no excluyentes son descritos más adelante.

Los sideróforos particulares útiles en las formulaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, aerobactina, agrobactina, azotobactina, bacillibactina, ácido N-(5-C3-L(5-aminopentil)hidroxicarbamoil)-propionamido)pentil)-3-(5-(N-hidroxiacetoa mido)- pe ntil)carbamoil)-proprionhidroxá mico (deferoxamina, desferrioxamina o DFO o DEF), desferritiocina, enterobactina, eritrobactina, ferricromo, ferrioxamina B, ferrioxamina E, fluviabactina, fusarinina C, micobactina, parabactina, pseudobactina, vibriobactina, vulnibactina, yersiniabactina, ornibactina, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

Los ácidos aminopoiicarboxílicos útiles en las formulaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, ácido nitriloacético (NTA), ácido tetraacético de trans-diaminociclohexano (DCTA), ácido pentaacético de dietilentriamina (DTPA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), ácido aspártico, ácido bis(aminoetil)glicoléter-N,N,N'N'-tetraacético (EGTA), ácido glutámico, y ácido N,N'-bis(2-hidroxibencil)etilendiamina-N,N -diacético (HBED), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

Los ácidos hidroxiaminocarboxílico útiles en las formulaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, ácido N-hidroxietiliminodiacético (HIMDA), N,N-bishidroxietilglicina (bicina), y N-(trishidroximetilmetil)glicina (tricina), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos. Las glicinas sustituidas con N, por ejemplo, glicilglicina, así como derivados, análogos, o combinaciones de la misma, son también útiles como quelantes de metal en las formulaciones de la invención. El quelante de metal ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), y los derivados, análogos, y combinaciones de los mismos, pueden también utilizarse.

Los calixarenos particulares útiles en las formulaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, un macrociclo o oligómero cíclico basado en un producto de hidroxialquilización de un fenol y un aldehido, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos. Los quelantes de cobre particulares útiles en la invención incluyen trietilentetramina (trientina), tetraetilenpentaamina, D-penicilamina, etilendiamina, bispiridina, fenantrolina, batofenantrolina, neocuproina, sulfonato de batocuproina, cuprizona, cis,cis-1 ,3,5,-triaminociclohexano (TACH), tachpir, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

Los quelantes de metal adicionales que se pueden utilizar en las formulaciones de la invención incluyen citrato, un derivado de hidroxipiridina, un derivado de hidrazona, y un derivado de hidroxifenilo o un derivado de nicotinilo, tal como 1 ,2-dimetil-3-hidroxipiridin-4-ona (Deferiprona, DFP o Ferriprox); 2-deoxi-2-(N-carbamoilmetil-[N'-2'-metil-3'-hidroxipiridin-4'-ona])-D-glucopiranosa (Feralex-G), piridoxal-isonicotinil-hidrazona (PIH); ácido 4,5-dihidro-2-(2,4-dihidroxifenil)-4-metíltiazol-4-carboxílico (GT56-252), ácido 4-[3,5-bis(2-hidroxifenil)-[1 ,2,4]triazol-1 -il]benzoico (ICL-670); ácido N,N'-bis(o-hidroxibencil)etilendiamina-N,N'-diacético (HBED), 5-cloro-7-yodo-quinolin-8-ol (clioquinol), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

Será reconocido que las combinaciones de dos o más de cualquiera de los quelantes de metal anteriores se pueden utilizar en combinación en las formulaciones de la invención. Por ejemplo, en una modalidad particular de la invención, la formulación comprende una combinación de DTPA y DEF. En otra modalidad, la formulación comprende una combinación de EGTA y DEF.

En un aspecto preferido, las formulaciones de la invención comprenden una concentración alta de proteína, incluyendo, por ejemplo, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 45 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 50 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 100 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 110 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 120 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 130 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 140 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 150 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 160 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 170 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 180 mg/ml, una proteína concentración mayor de aproximadamente 190 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 200 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 210 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 220 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 230 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 240 mg/ml, una concentración de proteína mayor de aproximadamente 250 mg/ml, o una concentración de proteína mayor de aproximadamente 300 mg/ml. En una modalidad preferida de la invención, la proteína comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda. En una modalidad preferida de la invención, la proteína es un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo une a la subunidad p40 de I1-12/IL-23. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es J695, por ejemplo, según lo descrito en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

La preparación del anticuerpo de interés se realiza de acuerdo con los métodos estándar conocidos en la técnica. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo usado en la formulación se expresa en una célula, tal como, por ejemplo, una célula CHO, y es purificado por una serie estándar de etapas de cromatografía. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se dirige a la subunidad p40 de IL-12/IL-23, y se prepara de acuerdo con los métodos descritos en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

Después de la preparación del anticuerpo de interés, se prepara la formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo. La cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo presente en la formulación es determinada, por ejemplo, considerando los volúmenes de dosis y modos de administración deseados. En una modalidad de la invención, la concentración de anticuerpo en la formulación es de entre aproximadamente 0.1 a aproximadamente 250 mg del anticuerpo por mi de formulación líquida. En una modalidad de la invención, la concentración del anticuerpo en la formulación es de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mg de anticuerpo por mi de formulación líquida. En varias modalidades, la concentración de anticuerpo en la formulación es de entre aproximadamente 30 a aproximadamente 140 mg por mi, entre aproximadamente 40 a aproximadamente 120 mg/ml, entre aproximadamente 50 a aproximadamente 110 mg/ml, o entre aproximadamente 60 a aproximadamente 100 mg/ml. La formulación es especialmente conveniente para dosificaciones grandes de anticuerpo de más de 15 mg/ml. En varias modalidades, la concentración de anticuerpo en la formulación es de aproximadamente 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ó 250 mg/ml. En una modalidad preferida, la concentración de anticuerpo es de 50 mg/ml. En otra modalidad preferida, la concentración de anticuerpo es de 100 mg/ml. En una modalidad preferida, la concentración de anticuerpo es de por lo menos aproximadamente 100 mg/ml, por lo menos aproximadamente 110 mg/ml o por lo menos aproximadamente 120 mg/ml.

En varias modalidades de la invención, la concentración de anticuerpo en la formulación es de aproximadamente 0.1-250 mg/ml, 0.5-220 mg/ml, 1-210 mg/ml, aproximadamente 5-200 mg/ml, aproximadamente 10-195 mg/ml, aproximadamente 15-190 mg/ml, aproximadamente 20-185 mg/ml, aproximadamente 25-180 mg/ml, aproximadamente 30-175 mg/ml, aproximadamente 35-170 mg/ml, aproximadamente 40-165 mg/ml, aproximadamente 45-160 mg/ml, aproximadamente 50-155 mg/ml, aproximadamente 55-150 mg/ml, aproximadamente 60-145 mg/ml, aproximadamente 65-140 mg/ml, aproximadamente 70-135 mg/ml, aproximadamente 75-130 mg/ml, aproximadamente 80-125 mg/ml, aproximadamente 85-120 mg/ml, aproximadamente 90-115 mg/ml, aproximadamente 95-110 mg/ml, aproximadamente 95-105 mg/ml, o aproximadamente 100 mg/ml. El intermediario que oscila a las concentraciones citadas anteriormente, por ejemplo, aproximadamente 31-174 mg/ml, también se piensa como parte de esta invención. Por ejemplo, los intervalos de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores citados anteriormente como límites superiores y/o inferiores se piensan como incluidos.

En una modalidad, la invención proporciona una formulación con estabilidad mejorada o una vida útil prolongada que comprende un ingrediente activo, preferiblemente un anticuerpo, en combinación con un poliol, tensioactivo y un sistema amortiguador con un pH de aproximadamente 5 a 7. En una modalidad, la formulación además comprende un estabilizador. En una modalidad la formulación está libre de metal. En una modalidad preferida, la formulación con estabilidad mejorada de una vida útil prolongada comprende un ingrediente activo, preferiblemente un anticuerpo, y manitol, histidina, metionina, polisorbato 80, ácido hidroclórico, y agua. En otra modalidad, la formulación de la invención tiene una vida útil prolongada de por lo menos aproximadamente 24 meses a entre aproximadamente 2 y 8°C en estado líquido. El congelamiento de la formulación de la invención se puede también utilizar para prolongar adicionalmente su vida útil. En otra modalidad, la formulación de la invención mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

Se prepara una formulación acuosa que comprende el anticuerpo en una solución amortiguadora de pH. El amortiguador de esta invención tiene un pH que oscila de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, preferiblemente de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7.5, más preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 7, muy preferiblemente de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, e incluso más preferiblemente tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.2. En una modalidad particularmente preferida, el amortiguador tiene un pH de aproximadamente 6. En otra modalidad preferida, el amortiguador tiene un pH de aproximadamente 5 o menos tal como, por ejemplo, 2.5 a 5.0; 3.0 a 5.0, 3.5 a 5.0, 4.0 a 5.0, y 4.5 a 5.0. Los intervalos intermedios de los pH citados anteriormente también se piensan como parte de esta invención. Por ejemplo, los intervalos de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores citados anteriormente como límites superiores y/o inferiores se piensan como incluidos. Los ejemplos de los amortiguadores que controlarán el pH dentro de este intervalo incluyen acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succcinato (tal como, succcinato de sodio), gluconato, histidina, citrato, fosfato, imidazol y otros amortiguadores de ácido orgánico. En una modalidad preferida de la invención, la formulación contiene un sistema amortiguador que comprende histidina. En una modalidad preferida de la invención, el amortiguador es histidina, por ejemplo, L-histidina. En las modalidades preferidas, la formulación de la invención comprende un sistema amortiguador que comprende aproximadamente 1-100 mM de histidina, preferiblemente aproximadamente 5-50 mM de histidina, y más preferiblemente 10 mM de histidina. En otra modalidad, la formulación comprende un sistema amortiguador que comprende histidina y citrato o un sistema amortiguador que comprende histidina y fosfato. En aún otra modalidad, la formulación comprende un sistema amortiguador que comprende imidazol. En aún otra modalidad, la formulación comprende un sistema amortiguador que comprende citrato y fosfato. Un experto en la técnica reconocerá que el cloruro de sodio se puede utilizar para modificar la toxicidad de la solución, por ejemplo, a una concentración de 1-300 mM, y óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida.

Un poliol, que actúa como un tonificador y que puede estabilizar el anticuerpo, también se incluye en la formulación. El poliol se agrega a la formulación en una cantidad que puede variar con respecto a la isotonicidad deseada de la formulación. La formulación acuosa es preferiblemente isotónica. La cantidad de poliol agregada puede también variar con respecto al peso molecular del poliol. Por ejemplo, una cantidad más baja de un monosacárido (por ejemplo, manitol) se puede agregar, en comparación con un disacárido (tal como trehalosa). En una modalidad preferida de la invención, el poliol que se utiliza en la formulación como un agente de tonicidad es manitol. En una modalidad preferida, la composición comprende aproximadamente 10 a aproximadamente 100 mg/ml, o aproximadamente 20 a aproximadamente 80, aproximadamente 20 a aproximadamente 70, aproximadamente 30 a aproximadamente 60, aproximadamente 30 a aproximadamente 50 mg/ml de manitol, por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, y aproximadamente 100 mg/ml de manitol. En una modalidad preferida, la formulación comprende aproximadamente 40 mg/ml de manitol (que corresponde a aproximadamente 4% de manitol). En una modalidad preferida, la composición comprende entre aproximadamente 1% a aproximadamente 10% de manitol, preferiblemente entre aproximadamente 2% a aproximadamente 6% de manitol, y más preferiblemente aproximadamente 4% de manitol. En otra modalidad de la invención, el sorbitol de poliol se incluye en la formulación.

Un estabilizador o un antioxidante se puede también agregar a las formulaciones de anticuerpo descritas en la presente. Un estabilizador se puede utilizar en formas de dosificación líquidas y liofilizadas. Las formulaciones de la invención pueden comprender metionina, por ejemplo, L-metionina, como estabilizador. Por ejemplo, oxidada, la metionina puede actuar para fortalecer el efecto estabilizador de los otros amortiguadores presentes en la formulación. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, bajo ciertas circunstancias, la metionina está presente en las formulaciones como parte del sistema amortiguador y no como un estabilizador, por ejemplo, la metionina puede estar presente en una formulación en una cantidad insuficiente para actuar como estabilizador. Otros estabilizadores útiles en las formulaciones de la invención son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, glicina y arginina. Los crioprotectores pueden ser incluidos para una forma de dosificación liofilizada, principalmente sucrosa (por ejemplo, 1-10% de sucrosa, y óptimamente 0.5-1.0% de sucrosa). Otros crioprotectores convenientes incluyen trehalosa y lactosa.

Un detergente o tensioactivo también se agrega a la formulación de anticuerpo. Los detergentes ejemplares incluyen detergentes no iónicos tal como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20, 80, etc.) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188). La cantidad de detergente agregada es tal que reduce la agregación del anticuerpo formulado y/o minimiza la formación de macropartículas en la formulación y/o reduce la adsorción. En una modalidad preferida de la invención, la formulación incluye un tensioactivo que es un polisorbato. En otra modalidad preferida de la invención, la formulación contiene detergente polisorbato 80 o Tween 80. Tween 80 es un término usado para describir el sorbitán-monooleato de polioxietileno (20) (ver Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4ta ed., 1996). En una modalidad preferida, la formulación contiene entre 0.001 a aproximadamente 0.1% de polisorbatos 80, o entre aproximadamente 0.005 y 0.05% de polisorbatos 80, por ejemplo, aproximadamente 0.001, aproximadamente 0.005, aproximadamente 0.01, aproximadamente 0.05, o aproximadamente 0.1% de polisorbatos 80. En una modalidad preferida, aproximadamente 0.01% de polisorbatos 80 se encuentran en la formulación de la invención.

Según lo descrito en los ejemplos en la presente, ciertos componentes de la formulación pueden estar incluidos o presentes en la formulación sin afectar negativamente la estabilidad de la molécula de anticuerpo, por ejemplo, sin promover o aumentar la fragmentación de la molécula de anticuerpo. Por ejemplo, los tensioactivos, por ejemplo, polisorbatos (por ejemplo, polisorbato 80) o poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188), se pueden agregar a la formulación sin promover o aumentar la fragmentación del anticuerpo. Los polioles, por ejemplo, manitol, se pueden agregar a la formulación sin promover o aumentar la fragmentación del anticuerpo. Los aminoácidos, por ejemplo, arginina, se pueden también agregar a la formulación sin promover o aumentar la fragmentación del anticuerpo. Los amortiguadores de base orgánica, por ejemplo, acetato, se pueden agregar a la formulación sin promover o aumentar la fragmentación del anticuerpo. Así, el acetato (ácido acético) se puede utilizar, por ejemplo, para disminuir el pH de la formulación sin afectar negativamente la estabilidad de la molécula de anticuerpo. Además, las sales, tal como, por ejemplo, NaCI, se pueden agregar a la formulación, puesto que la fuerza iónica de la formulación no tiene ningún efecto sobré la estabilidad, por ejemplo, fragmentación, de la molécula de anticuerpo.

En una modalidad preferida de la invención, la formulación es una solución de 1.0 mi en un envase que contiene los ingredientes mostrados más adelante en la tabla 1. En otra modalidad, la formulación es una solución de 0.8 mi en un envase.

Tabla 1: Solución1' de 10 mi de la formulación de J695 para inyección 'Densidad de la solución: 1.0398 g/ml 2)Se utiliza como concentrado En una modalidad, la formulación contiene los agentes identificados anteriormente (es decir, anticuerpo, poliol/agente de tonicidad, tensioactivo y amortiguador) y está esencialmente libre de uno o más conservadores, tal como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol y bencetonio Cl. En otra modalidad, un conservador se puede incluir en la formulación, particularmente donde la formulación es una formulación de múltiples dosis. Uno o más otros portadores, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables tal como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980), se pueden incluir en la formulación con la condición que no afecten significativamente de manera dañina las características deseadas de la formulación. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas e incluyen; agentes amortiguadores adicionales; co-solventes; antioxidantes tal como ácido ascórbico; agentes quelantes tal como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); polímeros biodegradables tal como poliésteres; y/o contraiones de formación de sal tal como sodio.

Las composiciones de esta invención pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, las formas de solidificación líquidas, semisólidas y sólidas, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y uso terapéutico previstos. Las composiciones preferidas comunes están en forma de soluciones inyectables o infusibles, tal como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad preferida, el anticuerpo es administrado por infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo es administrado por inyección intramuscular o subcutánea. Por consiguiente, el anticuerpo se prepara preferiblemente como solución inyectable. La solución inyectable se puede componer de una forma de dosificación líquida o liofilizada en un frasco de pedernal o ámbar, ampolla o jeringuilla llenada previamente. En una modalidad preferida de la invención, la formulación estable que comprende un anticuerpo se prepara en una jeringuilla llenada previamente.

La formulación en la presente se puede también combinar con uno o más de otros agentes terapéuticos cuando sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no afectan de manera adversa al anticuerpo de la formulación. Tales agentes terapéuticos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito previsto. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados (por ejemplo, un efecto terapéutico sinérgico se puede lograr con el uso de la terapia de combinación que, a su vez, permite el uso de una dosis más baja del anticuerpo para lograr el efecto terapéutico deseado), evitando así las posibles toxicidades o complicaciones asociadas a varias monoterapias. En las modalidades preferidas de la invención, un anticuerpo que une la subunidad p40 de IL-12/IL-23 se co-formula con y/o co-administra con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar los trastornos en los cuales la actividad de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de una formulación de la invención se puede co-formular y/o coadministrar con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos (por ejemplo, los anticuerpos que unen otras citocinas, por ejemplo, IL-17, o que unen las moléculas de superficie celular). Además, un anticuerpo de una formulación de la invención se puede utilizar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Los agentes terapéuticos adicionales que se pueden combinar con la formulación de la invención se describen de la técnica anterior en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, por ejemplo, en la columna 76, línea 10 a la columna 78, línea 53, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo deben ser estériles. Esto es logrado fácilmente por la filtración a través de las membranas de filtración estériles, antes, o después, de la preparación de la formulación.

V. Administración de la formulación La formulación de la invención puede ser utilizada en indicaciones similares a las descritas en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad, y detallado adicionalmente más adelante.

En un aspecto de la invención, las formulaciones estables de la invención comprenden un anticuerpo que une a IL-12 y/o IL-23, por ejemplo, une a la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23, e inhibe la actividad de IL-12 e IL-23, por ejemplo, inhibe la actividad de la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23. Según lo utilizado en la presente, el término "formulación de inhibición de actividad de IL-12 y/o IL-23" se piensa para incluir las formulaciones que comprenden un anticuerpo que une a IL-12 y/o IL-23, por ejemplo, une la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23, e inhibe la actividad de IL-12 e IL-23, por ejemplo, inhibe la actividad de la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23.

El lenguaje "cantidad efectiva" de la formulación significa la cantidad necesaria o suficiente para inhibir la actividad de IL-12 e IL-23 (por ejemplo, inhibir la actividad de la subunidad p40 de IL-12/IL-23) por ejemplo, previene varios síntomas morfológicos y somáticos de un estado perjudicial asociado a la actividad de IL-12 e IL-23. En otra modalidad, la cantidad efectiva de la formulación es la cantidad necesaria para lograr el resultado deseado. En un ejemplo, una cantidad efectiva de la formulación es la cantidad suficiente para inhibir la actividad perjudicial de IL-12 e IL-23 (por ejemplo, actividad perjudicial de la subunidad p40 de IL-12/IL-23). En otro ejemplo, una cantidad efectiva de la formulación es 0.8 mi de la formulación que contiene 50 mg/ml o 100 mg/ml del anticuerpo (por ejemplo, 40 mg o 80 mg de anticuerpo), según lo descrito en la tabla 1. En otro ejemplo, una cantidad efectiva de la formulación es 1.0 mi de la formulación que contiene 50 mg/ml o 100 mg/ml de anticuerpo (por ejemplo, 50 mg o 100 mg de anticuerpo), según lo descrito en la tabla 1. La cantidad efectiva puede variar dependiendo de los factores tal como tamaño y peso del sujeto, o tipo de enfermedad. Por ejemplo, la elección de una formulación de inhibición de actividad de IL-12 e IL-23 puede afectar lo qué constituye una "cantidad efectiva". Un experto en la técnica podrá estudiar los factores ya mencionados y hacer la determinación con respecto a la cantidad efectiva de la formulación de inhibición de actividad de IL-12 e IL-23 sin la experimentación indebida.

El régimen de la administración puede afectar lo qué constituye una cantidad efectiva. La formulación de inhibición de actividad de IL-12 e IL-23 se puede administrar al sujeto antes o después del inicio de la actividad perjudicial IL-12 e IL-23. Además, varias dosificaciones divididas, así como dosificaciones escalonadas, se pueden administrar diariamente o secuencialmente, o la dosis se puede infundir continuamente, o puede ser una inyección de bolo. Además, las dosificaciones la formulación de inhibición de actividad de IL-12 y/o IL-23 se pueden aumentar o disminuir proporcionalmente según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.

El término "tratado", "tratar" o "tratamiento" incluye la reducción o atenuación de por lo menos un síntoma asociado o causado por el estado, trastorno o enfermedad que es tratado. Por ejemplo, el tratamiento puede ser para reducir uno o más síntomas de un trastorno o completar la erradicación de un trastorno.

Los niveles de dosificación actuales de los ingredientes activos (anticuerpo) en la formulación farmacéutica de esta invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente.

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del anticuerpo encontrado en la formulación, la ruta de administración, tiempo de administración, índice de excreción del compuesto particular que es utilizado, duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con el compuesto particular utilizado, edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico anterior del paciente que es tratado, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.

Un médico o veterinario experto en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la presente invención requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar las dosis de los compuestos de la invención utilizados en la formulación farmacéutica a los niveles más bajos que los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logre el efecto deseado.

Generalmente, una dosis diaria conveniente de una formulación de la invención será la cantidad de la formulación que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Tal dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos anteriormente. Una cantidad efectiva de la formulación de la presente invención es una cantidad que inhibe la actividad de IL-12 e IL-23 (por ejemplo, la actividad de la subunidad p40 de IL-12/IL-23) en un sujeto que sufre de un trastorno en el cual la actividad de IL-12 e IL-23 es perjudicial. En una modalidad preferida, la formulación proporciona una dosis efectiva de 40 mg, 50 mg, 80 mg o 100 mg por inyección del ingrediente activo, es decir el anticuerpo. En otra modalidad, la formulación proporciona una dosis efectiva que oscila de aproximadamente 0.1 a 250 mg del anticuerpo. Si se desea, la dosis diaria eficaz de la formulación farmacéutica se puede administrar como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dosis secundarias administradas por separado en los intervalos apropiados a través del día, opcionalmente, en formas de dosificación unitaria.

En una modalidad de la invención, la dosificación del anticuerpo en la formulación es de entre aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mg. En una modalidad, la dosificación del anticuerpo en la formulación es de entre aproximadamente 30 y aproximadamente 140 mg, entre aproximadamente 40 y aproximadamente 120 mg, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 110 mg, entre aproximadamente 60 y aproximadamente 100 mg, o entre aproximadamente 70 y aproximadamente 90 mg. En otra modalidad, la composición incluye una dosificación del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que une a IL-12 y/o IL-23 (por ejemplo, une a la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23, por ejemplo J695) por ejemplo, aproximadamente 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 ó 250 mg.

Los intervalos intermedios para las dosificaciones citadas anteriormente, por ejemplo, aproximadamente 2-139 mg, también se piensan como parte de esta invención. Por ejemplo, los intervalos de valores que usan una combinación de cualquiera de valores citados anteriormente como límites superiores y/o inferiores están pensados como incluidos.

Se debe observar que los valores de dosificación pueden variar con la severidad de la condición que se aliviará. Se debe entender adicionalmente que para cualquier régimen de dosificación específico objeto particular se debe ajusfar durante un periodo de tiempo según la necesidad individual y juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones, y que los intervalos de dosificación establecidos en la presente son ejemplares solamente y no están pensados para limitar el alcance o práctica de la composición reivindicada.

La invención proporciona a una formulación farmacéutica una vida útil prolongada, que, en una modalidad, se utiliza para inhibir la actividad de IL-12 e IL-23 (por ejemplo, la actividad de la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23) en un sujeto que sufre de un trastorno en el cual la actividad de IL-12 e IL-23 es perjudicial, que comprende administrar al sujeto el anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención tal que la actividad de IL-12 e IL-23 en el sujeto sea inhibida. Preferiblemente, IL-12 y/o IL-23 son IL-12 e IL-23 humanas y el sujeto es un sujeto humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa una IL-12 y/o IL-23 con las cuales un anticuerpo de la invención reacciona de manera cruzada. Además el sujeto puede ser un mamífero en el cual se han introducido IL-12 e IL-23 (por ejemplo, por la administración de IL-12 y/o IL-23 o por expresión de un transgén IL-12 e IL-23). Una formulación de la invención se puede administrar a un sujeto humano para propósitos terapéuticos (discutidos detalladamente más adelante). En una modalidad de la invención, la formulación farmacéutica líquida se puede administrar fácilmente, la cual incluye, por ejemplo, una formulación que es administrada por el propio paciente. En una modalidad preferida, la formulación de la invención se administra a través de la inyección se, preferiblemente no reutilizable. Por otra parte, una formulación de la invención se puede administrar a un mamífero no humano que expresa una IL-12 y/o IL-23 con las cuales el anticuerpo reacciona de manera cruzada (por ejemplo, un primate, cerdo o ratón) para los propósitos veterinarios o como un modelo animal de la enfermedad humana. Con respecto a lo anterior, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de las dosificaciones y periodos de tiempo de la administración).

Según lo utilizado en la presente, el término "un trastorno en el cual la actividad de la subunidad p40 de IL-12 e IL-23 es perjudicial" o "un trastorno en el cual la actividad de IL/12 e IL-23 es perjudicial" se piensa para incluir las enfermedades y otros trastornos en los cuales la presencia de IL-12 e IL-23, por ejemplo, la subunidad p40 de las mismas, en un sujeto que sufre del trastorno ha mostrado ser o se sospecha que sea responsable de la patofisiología del trastorno o de un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. Por consiguiente, un trastorno en el cual la actividad de IL-12 e IL-23 es perjudicial es un trastorno en el cual se espera que la inhibición de la actividad de IL-12 y/o IL-23, por ejemplo, inhibición de la actividad de la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23, alivia los síntomas y/o progresión del trastorno. Tales trastornos se pueden evidenciar, por ejemplo, por un aumento en la concentración de IL-12 y/o IL-23, por ejemplo, un aumento en la concentración de la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23, en un fluido biológico de un sujeto que sufre del trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de IL-12 y/o IL-23, por ejemplo, la concentración de la subunidad p40 de IL-12 y/o IL-23, en suero, plasma, fluido sinovial, etc. del tema), que se puede detectar, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-p40 IL-12 e IL-23 según lo descrito anteriormente.

Existen numerosos ejemplos de los trastornos en los cuales la actividad de IL-12 e IL-23, por ejemplo, la actividad de la subunidad p40 de IL-12 y/o de IL-23, es perjudicial. Los ejemplos de tales trastornos se describen en la Solicitud Norteamericana 60/126,603, incorporada por referencia en la presente. Los ejemplos de los trastornos en los cuales la actividad de IL-12 e IL-23, por ejemplo, la actividad de la subunidad p40 de IL-12 y/o de IL-23, es perjudicial también se describen en la Patente Norteamericana No. 6,914,128, por ejemplo, en la columna 81, línea 9 a la columna 82, línea 59, cuyo contenido es incorporado en la presente por referencia en su totalidad.

El uso de las formulaciones de la invención que comprenden un anticuerpo que une a IL-12 y/o IL-23, por ejemplo, la subunidad p40 de 11-12 y/o de IL-23, en el tratamiento de los trastornos específicos se discute detalladamente más adelante. A. Artritis reumatoide La interleucina-12 e interleucina-23 se han implicado en el desempeño de una función en las enfermedades inflamatorias tal como artritis reumatoide. El mensaje inducible por IL-12p40 se ha detectado en el sinovio de pacientes con artritis reumatoide e IL-12 ha mostrado estar presente en los fluidos sinoviales de los pacientes con artritis reumatoide (ver por ejemplo, Morita y colaboradores, (1998) Arthritis and Rheumatism 41: 306-314). Las células positivas a IL-12 se han encontrado presentes en la capa de revestimiento secundario del sinovio de la artritis reumatoide. En el modelo murino de la artritis inducida por colágeno (CIA, por su abreviatura en inglés) para la artritis reumatoide, el tratamiento de los ratones con un mAb anti-IL-12 (anticuerpo monoclonal anti-ratón IL-12 de rata, C17.15) antes de la artritis suprimió profundo el inicio, y redujo la incidencia y severidad de la enfermedad. El tratamiento temprano con mAb anti-IL-12 después del inicio de la artritis redujo la severidad, pero el tratamiento tardío de los ratones con mAb anti-IL-12 después del inicio de la enfermedad tuvo un efecto mínimo sobre la severidad de la enfermedad. Usando los ratones sometidos a direccionamiento genético que carecieron de la subunidad p19 de IL-23 o de la subunidad p40 de IL-12/23, IL-23 mostró ser esencial para el desarrollo de la artritis inducida por colágeno (Murfi y colaboradores (2003) J. Exp. Med. 198(12):1951-1957).

Por consiguiente, los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar, por ejemplo, la artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis por Lyme, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa. Comúnmente, el anticuerpo, o porción de anticuerpo, se administra sistémicamente, aunque para ciertos trastornos, la administración local del anticuerpo o porción de anticuerpo puede ser beneficiosa. Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la invención también se puede administrar con uno o más agentes terapéuticos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

B. Enfermedad de Crohn La interleucina-12 e interleucina-23 también desempeñan una función en la enfermedad intestinal inflamatoria, por ejemplo, la enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa. La expresión creciente de IFN-? e IL-12 ocurre en la mucosa intestinal de los pacientes con la enfermedad de Crohn (ver por ejemplo, Fais y colaboradores, (1994) J. Inferieron Res. 14: 235-238; Parronchi y colaboradores, (1997) Amer. J. Pathol. 150: 823-832; Monteleone y colaboradores, (1997) Gastroenterology 112: 1169-1178; Berrebi y colaboradores, (1998) Amer. J. Pathol. 152: 667-672). Los anticuerpos anti-IL-12 han mostrado suprimir la enfermedad en los modelos ratón de la colitis, por ejemplo, los ratones nuligénicos para IL-12 con colitis inducida por TNBS, y recientemente en los ratones nuligénicos para IL-10. La expresión creciente de IL-23 también se ha observado en pacientes con la enfermedad de Crohn y en modelos ratón de la enfermedad intestinal inflamatoria, por ejemplo, colitis inducida por TNBS y en ratones nuligénicos para RAG1. IL-23 ha mostrado ser esencial para la colitis mediada por células T y para promover la inflamación a través de los mecanismos dependientes de IL-17 y IL-6 en los modelos ratón de la colitis, por ejemplo, en ratones nuligénicos para IL-10 (ver por ejemplo, la revisión de Zhang y colaboradores, (2007) Intern. Immunofarmacology 7:409-416). Por consiguiente, los anticuerpos, y porciones de anticuerpo, de la invención, se pueden utilizar en el tratamiento de las enfermedades intestinales inflamatorias.

C. Esclerosis múltiple La interleucina-12 e interleucina -23 se han implicado como mediadores dominantes de la esclerosis múltiple. La expresión del mensaje de IL-12 p40 inducible o IL-12 por sí misma se puede demostrar en las lesiones de pacientes con esclerosis múltiple (Windhagen y colaboradores, (1995) J. Exp. Med. 182: 1985-1996, Drulovic y colaboradores, (1997) J. Neurol. Sci. 147: 145-150). Los pacientes progresivos crónicos con esclerosis múltiple tienen niveles de circulación elevados de IL-12. Las investigaciones con las células T y el células que presentan el antígeno (APC, por su abreviatura en inglés) de los pacientes con esclerosis múltiple revelaron una serie autoperpetuable de interacciones inmunes mientras que la base de la esclerosis múltiple progresiva condujo a una inmunorespuesta de tipo Th1. La secreción creciente de IFN-? de las células T condujo a la producción creciente de IL-12 por las APCs, que perpetuaron el ciclo que condujo a un estado crónico de una activación y enfermedad inmunes de tipo Th1 (Balashov y colaboradores, (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. 94: 599-603). La funciones de IL-12 e IL-23 en la esclerosis múltiple se han investigado usando modelos ratón y rata con encefalomielitis alérgica experimental (EAE, por su abreviatura en inglés) de la esclerosis múltiple. En un modelo de EAE de recaída-remisión de la esclerosis múltiple en ratones, el tratamiento previo con mAb anti-IL-12 retrasó el parálisis y redujo los conteos clínicos, y el tratamiento con mAb anti-IL-12 en el pico de la parálisis o durante el período subsecuente de remisión redujo los conteos clínicos. También en el modelo ratón de EAE, el tratamiento con un anticuerpo contra la subunidad p19 de IL-23 previno la inducción de EAE e invirtió la enfermedad establecida (Chen y colaboradores 2006 J. Clinical Investigation 116(5): 1317-1326) . Usando los ratones sometidos a direccionamiento genético que carecen de IL-23, IL-23 mostró ser esencial para la inflamación autoinmune del cerebro (Cua y colaboradores (2003) Nature 421:7440748). Los anticuerpos contra la subunidad p40 de IL-12/IL-23 mostraron tener actividades beneficiosas en un modelo primate no humano de la esclerosis múltiple, por ejemplo, EAE en el tití común (Hart y colaboradores 2008 Neurodegenerative Dis. 5:38-52). (Ver también las revisiones de: Gran y colaboradores, 2004 Crit. Rev. Immunol. 24:111-128; McKenzie y colaboradores 2006 Trends Immunol 27:17-23). Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los síntomas asociados a la esclerosis múltiple en humanos.

D. Diabetes mellitus dependiente de insulina La interleucina-12 se ha implicado como mediador importante de la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM, por su abreviatura en inglés). La IDDM fue inducida en ratones NOD por la administración de IL-12, y los anticuerpos anti-IL-12 fueron protectores en un modelo de transferencia adoptivo de IDDM. Los pacientes con inicio temprano de IDDM experimentan frecuentemente un llamado "período de luna de miel" durante el cual se mantiene una cierta función residual de la célula del islote. Estas células del islote residuales producen la insulina y regulan los niveles de glucosa en sangre mejor que la insulina mejor administrada. El tratamiento de estos pacientes de inicio temprano con un anticuerpo anti-IL-12 puede prevenir la destrucción adicional de las células del islote, para de tal modo mantener una fuente endógena de insulina. IL-23 se ha implicado en la exacerbación de la diabetes, basado en la observación de que IL-23 indujo la diabetes en ratones si se co-administra con múltiples dosis bajas sub-diabetógenas de estreptozotocina (ver, por ejemplo, la revisión de Cooke 2006 Rev. Diabet. Stud. 3(2):72-75). Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los síntomas asociados a la diabetes.

E. Psoriasis La interleucina-12 e interleucina-23 se han implicado como mediadores dominantes en la psoriasis. La psoriasis implica lesiones de piel agudas y crónicas que se asocian a un perfil de expresión de citocina de tipo Th1. (Hamid y colaboradores (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 1:225-231; Turka y colaboradores (1995) Mol. Med. 1:690-699). En ratones, la sobreexpresión de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 y la inyección de IL-23 recombinante dan lugar a la enfermedad de piel inflamatoria, y la administración de los anticuerpos anti-IL-12 p40 a los modelos murino de psoriasis resolvió las lesiones psoriásicas. Los ARNm de IL-12 p35 y p40 fueron detectados en muestras de piel humana enferma. En otros estudios, la expresión creciente de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 y de la subunidad p19 de IL-23 fue observada en lesiones psoriásicas humanas, y la expresión disminuida de IL-12 y IL-23 fue observada después de la terapia de psoriasis. Un polimorfismo genético en la subunidad p40 de IL-12 se ha ligado a la susceptibilidad creciente a la psoriasis, (ver, por ejemplo, las revisiones de Torti y colaboradores (2007) J. Am. Acad. Dermatol. 57(6): 1059-1068; Fitch y colaboradores (2007) Current Rheumatology Reports 9:461-467). IL-12 e IL-23 también se han identificado como factores esenciales en la artritis psoriásica (ver por ejemplo, la revisión de Hueber y colaboradores 2007 Immunology Letters 114:59-65). Por consiguiente, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden servir para aliviar los trastornos crónicos de la piel tal como psoriasis, así como artritis psoriásica.

F. Otros trastornos La interleucina 12 y/o interleucina 23 desempeñan una función esencial en la patología asociada a una variedad de enfermedades que implican elementos inmunes e inflamatorios. Estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis crónica juvenil, artritis por Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus dependiente de insulina, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, escleroderma de dermatitis, dermatitis atópica, enfermedad de injerto contra anfitrión, rechazo de trasplante de órgano, enfermedad inmune aguda o crónica asociada al trasplante de órgano, sarcoidosis, ateroesclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Grave, síndrome nefrótico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, purpurea de Henoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los ríñones, hepatitis activa crónica, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de septicemia, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, afecciones malignas, paro cardíaco, infarto del miocardio, enfermedad de Addison, esporádico, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) en adultos, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía eolítica ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, yersinia y artropatía asociada a salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arterioesclerosis, alergia atópica, enfermedad bullar autoinmune, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmune, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de célula gigante, hepatitis esclerótica primaria, hepatitis autoinmune criptogénica, síndrome de enfermedad inmunodeficiencia adquirido, enfermedades relacionadas a la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis C, inmunodeficiencia variada común (hipogammaglobulinemia variable común), cardiomiopatía dilatada, infertilidad femenina, falla ovárica, falla ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosa criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial postinflamatoria , neumonitis intersticial, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la enfermedad de tejido conectivo, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de tejido conectivo mezclada, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a la artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada al lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a la dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada la espondilitis anquilosante, enfermedad pulmonar difusa vasculítica, enfermedad pulmonar asociada a la hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármaco, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, pulmonía eosinófila crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial postinfección, artritis gotosa, hepatitis autoinmune, hepatitis autoinmune tipo 1 (hepatitis autoinmune clásica o lupoide), hepatitis autoinmune tipo 2 (hepatitis por anticuerpo anti-LKM), hipoglucemia mediada autoinmune, resistencia a la insulina tipo B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmune aguda asociada al trasplante de órgano, enfermedad inmune crónica asociada al trasplante de órgano, osteoartrosis, colangitis esclerótica primaria, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmune, enfermedad renal por NOS, glomerulonefritides, vasulitis microscópico de los ríñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o por NOS, autoinmunidad de esperma, esclerosis múltiple (todos los subtipos), diabetes mellitus dependiente de insulina, oftalmía simpatética, hipertensión pulmonar posterior a la enfermedad de tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nodosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, enfermedad de Takayasu/arteritis, trombocitopenia autoinmune, trombocitopenia idiopática, enfermedad de tiroides autoinmune, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmune con bocio (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmune atrófico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria y vitíligo. Los anticuerpos humanos, y porciones de anticuerpo de la invención se pueden utilizar para tratar las enfermedades autoinmunes, particularmente las asociadas a la inflamación, incluyendo, espondilitis reumatoide, alergia, diabetes autoinmune, y uveítis autoinmune.

La práctica de la invención aún será entendida mejor a partir de los siguientes ejemplos, que se presentan en la presente a modo de ilustración solamente y no se deben interpretar de ninguna manera como una limitación a la invención.

El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de literatura, patentes, solicitudes de patente, y sitios Web) que se pueden citar a través de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente por referencia. La práctica de la invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, las técnicas de análisis de proteína convencionales, que son bien conocidas en la técnica.

Ejemplificación El ejemplo 1 proporciona los métodos y materiales usados en la realización de la invención, por ejemplo, según lo utilizado en los ejemplos 2-6. El ejemplo 2 describe la preparación de una formulación de anticuerpo J695 líquida ejemplar. El ejemplo 3 proporciona los experimentos que demuestran la estabilidad de la formulación de J695 líquida durante ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento entre -80°C y 25°C. El ejemplo 4 proporciona los experimentos que demuestran la estabilidad de la formulación de J695 líquida durante el almacenamiento de larga duración a varias temperaturas en el estado congelado. El ejemplo 5 proporciona los experimentos que muestran la estabilidad de la formulación de J695 líquida durante ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento entre -80°C y 37°C. El ejemplo 6 proporciona los experimentos que muestran la estabilidad de la formulación de J695 líquida durante el almacenamiento de larga duración acelerado y a varias temperaturas. El ejemplo 7 proporciona los métodos y materiales usados en la relación de la invención, por ejemplo, según lo utilizado en los ejemplos 8-9. El ejemplo 8 demuestra la segmentación del anticuerpo que contiene la cadena ligera lambda en presencia de histidina y metal, por ejemplo, cobre o hierro. El ejemplo 9 muestra la fragmentación del anticuerpo y la prevención de la misma con respecto a varios parámetros de los componentes de formulación y solución de anticuerpo. Estos parámetros incluyen, pero no se limitan a, pH de solución, concentración de anticuerpo, resistencia iónica de la formulación, tipo y concentración de amortiguador de formulación, tensioactivos, y excipientes estabilizadores. El ejemplo 10 muestra la fragmentación de J695 (100 y 2 mg/ml) a varios niveles de hierro y a diferentes temperaturas.

Ejemplo 1: Métodos analíticos usados para supervisar la estabilidad de J695 Ejemplo 1.1: HPLC de intercambio catiónico La HPLC de intercambio catiónico fue utilizada para determinar la identidad y pureza de la sustancia de fármaco de J695 usando la cromatografía líquida de alto rendimiento de intercambio catiónico débil (HPLC Shimadzu 10AD con el detector SPD UV/VIS o equivalente). Las especies fueron disueltas en una fase inmóvil de intercambio catiónico débil (Dionex ProPac WCX-10, 4 mm x 250 mm, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) en la base de carga. Cien microlitros, a una concentración de 1 mg/ml, fueron inyectados y los componentes de muestra fueron disueltos utilizando cada vez más sal (cloruro de sodio) y disminuyendo el gradiente de pH en un sistema amortiguador de fosfato, (fase móvil A: 10 mM de fosfato de sodio dibásico, pH 7.5; fase móvil B: 20 mM de fosfato de sodio dibásico, 20 mM de acetato de sodio, 400 mM de cloruro de sodio, pH 5.0) a un caudal de 1.0 ml/min. La temperatura de columna fue mantenida a 25°C a través del análisis y las muestras fueron mantenidas a 2-8°C antes de la inyección. La identidad de los picos fue determinada comparando el tiempo de retención relativa del pico principal de interés (detectado vía la absorbancia a 280 nm) para una muestra contra el material de referencia estándar. El perfil de heterogeneidad para el cromatograma de muestra de prueba fue comparado al perfil cromatográfico estándar de referencia. La suma de las áreas pico en la región de isoforma principal, región ácida y en la región básica de la muestra, fue reportada para cada región. Todos los reactivos fueron comprados de JT Baker, (Phillipsburg NJ) a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1.2: ELISA de unión de J695 El ELISA de unión fue utilizado para medir la capacidad de unión relativa de la muestra de anticuerpo anti-IL-12 J695 a IL-12 con relación a la del estándar de referencia. En este análisis, la proteína rhlL-12 (ABC) fue unida, a través de una incubación durante la noche a 2-8°C, a una placa de microtítulo de 96 pozos (VWR International, West Chester, PA). El estándar y las muestras fueron diluidos en serie en 50% de 1X PBS con 50% de amortiguador de bloqueo Superblock (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) en PBS y 0.05% de Surfactamp-20 (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL), de 160 ng/ml a 0.625 ng/ml y se cargaron a los pozos recubiertos con rhlL-12 de la placa de microtítulo de 96 pozos. El J695 capturado entonces fue reconocido con anti-lgG-HRP humano de cabra (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL). Un kit de sustrato de TMB (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) fue utilizado como el sustrato para una lectura colorimétrica. La capacidad de unión relativa porcentual fue calculada como la relación de los valores "C" de la curva de 4 parámetros ajustada para el estándar y la muestra.

Ejemplo 1.3: HPLC por exclusión de tamaño La HPLC por exclusión de tamaño fue utilizada para determinar la pureza de J695 (HPLC Shimadzu 10AD con el detector SPD UV/VIS o equivalente). Diez microlitros de una solución de proteína de 2.0 mg/ml (mantenida a 2-8°C) fueron inyectados en la columna para obtener suficiente señal para el análisis. Las especies fueron separadas de manera ¡socrática a un caudal de 0.75 mi por minuto usando una columna de filtración en gel Superdex (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ) o una fase inmóvil comparable y 211 mM de Na2S04/92 mM de Na2HP04, pH 7.0 para la fase móvil. La temperatura de columna fue mantenida a temperatura ambiente durante el análisis. Las muestras de prueba fueron inyectadas dos veces y el J695 monomérico y otras especies fueron detectados por absorbancia a 214 nm. La pureza fue determinada comparando el área del anticuerpo J695 con el área total de 214 nm de componentes absorbentes en la muestra, excluyendo los picos relacionados al amortiguador. El método fue capaz de determinar los agregados de alto peso molecular y los fragmentos de anticuerpo del J695 intacto.

Ejemplo 1.4: Geles de SDS-PAGE reductivos v no reductivos teñidos con azul coloidal Los geles de SDS-PAGE reductivos y no reductivos teñidos con azul coloidal fueron utilizados para determinar la pureza de J695. Las muestras fueron preparadas bajo las condiciones reductivas y no reductivas usando el amortiguador de muestra (2x tris-glicina SDS, Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) con o sin mercaptoetanol agregado, respectivamente. Las muestras y estándares fueron diluidos inicialmente en agua MilliQ a 0.4 mg/ml y 0.1 mg/ml para los geles reducidos y no reducidos, respectivamente. Las muestras fueron diluidas 1:1 con el amortiguador de muestra y fueron calentadas a aproximadamente 60°C durante aproximadamente 30 minutos con SDS, que une y desnaturaliza las proteínas. La cantidad de SDS que une a la proteína fue directamente proporcional a su tamaño molecular. Los marcadores de peso molecular (Mark 12, marcadores MW no teñidos, Invitrogen Corp. Carlsbad, CA), la muestra de prueba y el estándar (reducidos y no reducidos) fueron cargados a los carriles separados de 12% (reducidos) y 8-16% (no reducidos) de geles comerciales de tris-glicina (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). La separación de especies de proteína fue completada en 1X de amortiguador de corrida de tris-glicina usando el voltaje constante de 60V durante los primeros 30 minutos, y entonces 125V hasta que la parte delantera dei tinte haya alcanzado la parte inferior del gel. La proteína fue detectada con el tinte azul coloidal (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA). Una valoración cualitativa de la pureza fue lograda por la comparación del perfil de pureza en el gel no reducido con el de la muestra de prueba para el estándar de referencia J695. La densitometría de exploración (explorador de UMAX con el software de densitometría Phoretix ID o equivalente) fue utilizada para determinar la pureza porcentual de la muestra de la suma de la cadena pesada y ligera detectada en el gel implementado bajo condiciones de reducción.

Ejemplo 1.5: Concentración de proteína (Amn) La medición espectrofotométrica midió la concentración de proteína de la sustancia de fármaco de J695. Las muestras fueron diluidas en triplicado para obtener un valor OD a A 280 entre 0.3 y 1.5 AU. Las diluciones fueron preparadas, en agua, usando de manera gravimétrica (en peso) un equilibrio analítico de Mettier Toledo. El espectrofotómetro (Beckman DU800 o equivalente) fue aislado a 280 nm. La absorbencia de cada muestra y control fue leída a 280 nm, con los valores resultantes corregidos para la dilución y divididos por el coeficiente de extinción para llegar a una concentración de proteína. Para J695, el valor de coeficiente de extinción a AU/mg/ml fue de 1.42.

Ejemplo 1.6: Análisis biológico de J695 Un análisis biológico basado en células de J695 midió la actividad relativa de las muestras de J695 comparadas a un estándar de referencia. Las células NK-92 fueron estimuladas con una concentración definida de IL-12 y mezcladas con concentraciones variables del anticuerpo anti-IL-12 J695. Durante el período de incubación, las células NK-92 secretaron el interferón gamma (IFN-?) en proporción con la cantidad de IL-12 en la solución. La cantidad de IFN-? fue cuantificada usando un kit de ELISA comercialmente disponible. Usando la regresión no lineal, fueron calculados los valores de Cl50 de la muestra y del estándar de referencia. La actividad de la muestra individual fue expresada como un porcentaje de la actividad (valor promedio de Cl50) del estándar de referencia.

Ejemplo 2: Preparación de la formulación de J695 La formulación farmacéutica fue hecha de acuerdo con el siguiente protocolo.

Los materiales que fueron utilizados en la formulación incluyeron: manitol, histidina, metionina, polisorbato 80, agua para inyecciones y ácido hidroclórico, que fue utilizado como una solución de 10% para ajustar el pH, y concentrado de proteína (es decir, concentrado de anticuerpo).

Ejemplo 2.1: Preparación de 10 I de amortiguador (equivalente a 10.133 ka - densidad de solución: 1.0133 g/ml) Los ingredientes fueron pesados como sigue: 400.00 g de manitol, 15.50 g de histidina, 14.90 g de metionina, 1.00 g de polisorbato 80, y 9.701 g de agua para inyección.

Una solución de 10% de ácido clorhídrico fue preparada combinando 54.80 g de ácido clorhídrico (37%) con 145.20 g de agua para inyección.

Un amortiguador fue preparado disolviendo los siguientes ingredientes pesados previamente (descritos anteriormente) en aproximadamente 90% de agua para inyección: manitol, histidina, metionina, y polisorbato 80. La secuencia de adición de los componentes de amortiguador no afectó la calidad del amortiguador.

Después de la adición de todos los componentes de amortiguador, el pH de la solución fue ajustado a aproximadamente pH 6 con 10% de ácido clorhídrico y fue agregado el peso final de agua.

Ejemplo 2.2: Preparación de 10 I de la formulación (equivalente a 10.398 kg) La solución amortiguada preparada en el ejemplo 2.1 fue agregada opcionalmente al concentrado de anticuerpo descongelado y, opcionalmente, mezclado de la siguiente manera. El concentrado de anticuerpo J695 fue descongelado en un baño de agua antes de la preparación de la formulación farmacéutica. Aproximadamente 8.37 kg del concentrado de anticuerpo fueron utilizados, que es equivalente a aproximadamente 1.0 kg de proteína con aproximadamente 125 mg de proteína/ml de concentrado de proteína. La densidad del concentrado fue de aproximadamente 1.0467 g/ml. El amortiguador fue agregado con agitación, hasta que el peso final de la solución a granel fue alcanzado.

La formulación final que contiene todos sus ingredientes fue filtrada a través de dos filtros de membrana estéril de 0.22 pm (difluoruro de polivinilideno hidrofílico, tamaño de poro de 0.22 µ?t?) en un receptáculo esterilizado. El medio de filtración usado fue esterilizado por filtración usando nitrógeno. Después de la esterilización, la formulación fue empaquetada para el uso en un frasco o jeringuilla llenada previamente.

El experto en la técnica apreciará que las cantidades de peso y/o relaciones de peso a volumen citadas en la presente, se puedan convertir a moles y/o molaridades usando los pesos moleculares reconocidos en la técnica de los ingredientes citados. Las cantidades de peso ejemplificadas en la presente (por ejemplo, g o kg) son para los volúmenes (por ejemplo, de amortiguador o formulación farmacéutica) citados. El experto en la técnica apreciará que las cantidades de peso pueden ser ajustadas proporcionalmente cuando se desean diferentes volúmenes de formulación. Por ejemplo, las formulaciones de 32 I, 20 I, 5 I, o 1 I incluirían 320%, 200%, 50% o 10%, respectivamente, de las cantidades de peso ejemplificadas.

Ejemplo 3: Análisis fisicoquímico de la formulación de J695 líquida estabilizada durante los estudios repetidos de congela iento/descongelamiento (-80°C/25QC) Después de que el amortiguador de la formulación para el anticuerpo J695 fuera seleccionado, la sustancia de fármaco fue formulada en la misma matriz que el producto final. El objetivo fundamental de la formulación de proteína es mantener la estabilidad de una proteína dada en su forma farmacéuticamente activa natural durante periodos de tiempo prolongados para garantizar una vida útil aceptable del fármaco de proteína farmacéutico. Comúnmente, la vida útil prolongado es logrado almacenando la proteína en congelamiento (por ejemplo, a -80°C) o sometiendo la proteína a un proceso de liofilización, es decir, almacenando la proteína en forma liofilizada, y reconstituyéndola inmediatamente antes del uso. Sin embargo, es bien conocido por los expertos en la técnica que los procesos de congelamiento y descongelamiento frecuentemente afectan la estabilidad de la proteína, lo cual significa que incluso el almacenamiento de la proteína farmacéutica en forma congelada se puede asociar a la pérdida de estabilidad debido a la etapa de congelamiento y descongelamiento. También, la primera etapa de proceso de liofilización implica el congelamiento, que puede afectar negativamente la estabilidad de la proteína. Debido a que es bien conocido que aumenta el riesgo de encontrar fenómenos de inestabilidad de proteína con el incremento de la concentración de proteína, lograr las condiciones de formulación que mantienen la estabilidad de la proteína a altas concentraciones de proteína es una tarea desafiante.

El comportamiento de congelamiento-descongelamiento del anticuerpo J695 a una concentración de proteína de 138 mg/ml fue evaluado sometiendo a la sustancia de fármaco a hasta 5 ciclos de estado congelado y estado líquido. El congelamiento fue realizado por medio de un congelador a -80°C de temperatura controlada, y el descongelamiento fuer realizado por medio de un baño de agua a 25°C de temperatura controlada. Aproximadamente 30 mi de solución de J695 fueron llenados en depósitos de PETG de 30 mi para este experimento. La tabla 2 proporciona una descripción de los intervalos de prueba y del número de ciclos de congelamiento/descongelamiento realizados. Los criterios que definen la calidad y estabilidad deseables del anticuerpo J695 para este estudio se enumeran en la tabla 3.

Tabla 2: Intervalos de prueba: Número de ciclos de congelamiento (-80°C) y descongelamiento (baño de agua a 25°C) aplicados *EI número define la cantidad de depósitos sometidos a tensión y probados Los criterios que definen la calidad y estabilidad, deseables del anticuerpo J695 para este estudio son los mismos según lo enumerado en la tabla 3.

Tabla 3: Parámetros que definen la calidad y estabilidad deseables del anticuerpo J695 para varios estudios de fatiga Prueba Espeficicaciones de verificación Claridad < Suspensión de referencia IV de EP Color < Solución de referencia BY4 PH 5.5-6.5 70%-130% de capacidad de unión porcentual Elisa de actividad relativa Pureza: > 98.0% de monómero SEC HPLC < 2% de agregados El patrón predominante de manara cromatográfica De acuerdo con el del material de referencia CEX-HPLC Suma de las isoformas principales > 85% Suma de la región ácida < 15% Suma de la región básica < 10% El patrón de bandeo predominante de SDS-PAGE acuerdo con el del estándar de referencia Coloidal Pureza: Suma de la cadena pesada + ligera > Reducido 97% Prueba Espeficicaciones de verificación SDS-PAGE El patrón de bandeo predominante de Coloidal acuerdo con el del estándar de referencia No reducido *Endotoxina < 0.2 EU/mg *Carga bacteriana < 1 CFU/ml biológica "Estos resultados fueron realizados a tiempo cero y al final del estudio.

Los resultados del experimento que evalúa el efecto de cinco ciclos de congelamiento-descongelamiento donde J695 se formula en por lo menos 110 mg/ml a un pH de aproximadamente 6 (6.2) se reportan en la tabla 4. La tabla 4 muestra que el anticuerpo J695 se puede someter a los ciclos repetidos de congelamiento/descongelamiento durante por lo menos cinco veces sin ningún efecto perjudicial sobre las propiedades químicas (HPLC de intercambio catiónico, HPLC por exclusión de tamaño, color, pH), propiedades fisicoquímicas (claridad, SDS PAGE reducido y no reducido) o actividad biológica (análisis ELISA de actividad) cuando se formula en la composición farmacéutica de la invención según lo descrito en el ejemplo 2. Tabla 4: Resultados de prueba del estudio de congelamiento/descongelamiento del anticuerpo J695 formulado a 138 mg/ml en la formulación según lo descrito en el ejemplo 2 Número de Parámetro de Criterio de Especificación ciclos de estabilidad Datos prueba de vida útil congelamiento/ comparado descongelamiento < 0 = < o = Solución Solución de Color de referencia Prueba inicial < BY5 referencia BY6 EP B7 1 < BY5 3 < BY5 5 < BY5 < o = Valores de Suspensión reporte Claridad de Prueba inicial < II relacionados a referencia la referencia EP IV Solución/ 1 < II Suspensión 3 < II 5 < II pH 5.5 a 6.5 5.0 a 5.4 Prueba inicial 6.2 1 6.2 3 6.2 5 6.2 Número de Parámetro de Criterio de Especificación ciclos de estabilidad Datos prueba de vida útil congelamiento/ comparado descongelamiento > o = 70% de ELISA concentración 65% a de Prueba inicial 89 de proteína 130% actividad observada (QCA- 1 93 260) 3 99 5 101 Monómero HPLC Pureza: > o = de pureza > Prueba inicial 99.5 SEC 90.0% o = 99% 1 99.4 3 99.4 5 99.4 Variantes El patrón de Usina > Prueba inicial Ajustado cromatográfico CEX- o = 80% predominante HPLC 1 Ajustado ajustado al de la 3 Ajustado referencia 5 Ajustado Número de Parámetro de Criterio de Especificación ciclos de estabilidad Datos prueba de vida útil congelamiento/ comparado descongelamiento Pico 1 Primera CEX- relacionado al región Prueba inicial 1.00 HPLC tiempo de ácida: < o = retención 6% 0.95-1.05 1 1.00 3 1.00 5 1.00 SDS- Patrón de unión N/A Prueba inicial Ajustado PAGE predominante Tinte ajustado al del azul 1 Ajustado estándar de coloidal referencia Reducido 3 Ajustado 5 Ajustado SDS- Patrón de unión N/A Prueba inicial Ajustado PAGE predominante Tinte ajustado al del azul 1 Ajustado estándar de coloidal referencia No 3 Ajustado Número de Parámetro de Criterio de Especificación ciclos de estabilidad Datos prueba de vida útil congelamiento/ comparado descongelamiento reducido 5 Ajustado carga < o = 1 bacteriana < o = 1 CFU/ml Prueba inicial 0 CFU/ml biológica 1 NP 3 NP 5 0 < o = 0.2 Endotoxina < o = 0.2 EU/mg Prueba inicial <0.1 EU/mg 1 NP 3 NP 5 <0.1 Ejemplo 4: Análisis fisicoquímico de la formulación de J695 líquida estabilizada durante el almacenamiento de larga duración a varias temperaturas en el estado congelado Para ajustar la vida útil del producto de fármaco final así como las estrategias de fabricación del producto de fármaco, la logística y envío del producto de fármaco final, la proteína a granel (es decir, la sustancia de fármaco, el ingrediente farmacéutico activo, API) se formula en una formulación que mantenga la estabilidad de la proteína farmacéutica en el estado congelado durante periodos más largos. Idealmente, la formulación de proteína mantiene la estabilidad a varias temperaturas en estado congelado, por ejemplo, a -80°C, -40°C, y -20°C, para ajusfar la flexibilidad de las ubicaciones de almacenamiento de la proteína a granel entre la fabricación de la proteína a granel y el producto de fármaco llenado final. Los expertos en la técnica reconocerán que esto es una tarea muy desafiante.

La estabilidad de almacenamiento del anticuerpo de J695 a una concentración de proteína de 121 mg/ml fue evaluada a varias temperaturas dentro de un intervalo de -20°C y -80°C durante periodos de tiempo prolongados a condiciones de temperatura controlada. Después de períodos de almacenamiento definidos, la proteína a granel fue descongelada y fue evaluado el impacto del tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento sobre la estabilidad de J695. Aproximadamente 1600 mi de la solución de J695 fueron llenados en depósitos de polietileno tereftalato copoliéster (PETG) de 2 I para este experimento. La tabla 4 proporciona una descripción de los intervalos de prueba y temperaturas de almacenamiento respectivas del anticuerpo J695 aplicados en este experimento.

Los resultados del experimento que evalúa el efecto del tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento donde J695 se formula a por lo menos 110 mg/ml a un pH de aproximadamente 6 (6.2) se reportan en la tabla 5.

Tabla 5: Intervalos de prueba: Temperaturas de almacenamiento y puntos de extracción de muestra aplicados durante el experimento de estabilidad *EI número define la cantidad de depósitos sometidos a tensión y probados.

NP = no realizado La tabla 6 muestra que el anticuerpo J695 se puede someter al almacenamiento durante por lo menos 18 meses a varias temperaturas dentro de un intervalo de -20°C y -80°C sin efecto perjudicial sobre estabilidad física y química. Por ejemplo, durante un periodo de almacenamiento de 18 meses, el anticuerpo J695 muestrea niveles de monómero exhibidos de por lo menos 98% para todas las temperaturas a las cuales la solución de anticuerpo congelada fue almacenada. Similarmente, los datos del ELISA de actividad mostraron que las muestras del anticuerpo J695 probadas exhibieron alta actividad, independientemente de la temperatura a la cual la solución congelada del anticuerpo J695 fue almacenada. Con respecto a la estabilidad química de J695 supervisada por HPLC de intercambio catiónico, los datos demostraron que la estabilidad química del anticuerpo J695 no es afectada durante por lo menos 18 meses cuando se almacena en forma congelada a las temperaturas entre -20°C y -80°C. Finalmente, los datos muestran que el anticuerpo J695 se puede someter al almacenamiento durante por lo menos 18 meses a varias temperaturas dentro de un intervalo de -20°C y -80°C sin impacto negativo sobre las propiedades químicas (HPLC de intercambio catiónico, HPLC por exclusión de tamaño, color, pH), propiedades fisicoquímicas (claridad, SDS PAGE reducido y no reducido) o las propiedades biológicas (análisis ELISA de actividad, carga bacteriana biológica, niveles de endotoxina) cuando se formula en la composición farmacéutica según lo descrito en el ejemplo 2.

Tabla 6: Resultados de prueba de un estudio de estabilidad que utiliza varias temperaturas de almacenamiento del anticuerpo J695 formulado a 121 mg/ml según lo descrito en el ejemplo 2 Duración Condiciones de almacenamiento Criterio de Especificación de Criterio de de prueba verificación estabilidad prueba -80°C -40°C -35°C -30°C -25°C -20°C (meses) < 0 = < o = Solución de Solución de Prueba Color referencia BY6 referencia EP inicial B7 < 0 = 0.25 NP NP NP NP NP BY6 < 0 = 0.5 NP NP NP NP NP BY6 < 0 = 1 NP NP NP NP NP BY6 ? o Duración Condiciones de almacenamiento Criterio de Especificación de Criterio de de prueba verificación estabilidad prueba -80°C -40°C -35°C -30°C -25°C -20°C (meses) 1 6.3 NP NP NP NP NP 3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6 6.3 NP NP NP NP NP 9 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 12 6.2 NP NP NP NP NP 18 6.3 6.3 6.3 6.3 6.3 6.2 Elisa de > o 60% de Prueba 75% a 125% 99 actividad actividad de unión inicial Concentración de 0.25 96 NP NP NP NP NP proteína 0.5 95 NP NP NP NP NP 1 106 NP NP NP NP NP ^ Ejemplo 5: Análisis fisicoquímico de la formulación de J695 líquida estabilizada durante los estudios repetidos de congelamiento/descongelamiento (-80°C/37°C) Después de que el amortiguador de formulación para el anticuerpo J695 fue seleccionado la sustancia de fármaco fue formulada en la misma matriz que el producto final.

El comportamiento de congelamiento-descongelamiento de la sustancia de fármaco de anticuerpo J695 a una concentración de proteína de por lo menos 100 mg/ml fue evaluado sometiendo dos diferentes lotes de sustancia de fármaco (formulada según lo descrito en el ejemplo 2) a cinco ciclos de estado congelado a estado líquido. Para este propósito las botellas de PETG de 2 I fueron utilizadas, las cuales contuvieron aproximadamente 1.6 I de J695 en la formulación según lo descrito en el ejemplo 2.

La tabla 7 muestra los resultados de un experimento que evalúa el efecto de cinco ciclos de congelamiento-descongelamiento en el amortiguador de formulación a partir de -80°C. Las soluciones fueron descongeladas dentro de un baño de agua ajustado a 37°C y se retiraron inmediatamente después del descongelamiento completo para la prueba de muestra. o Tabla 7: Resultados de prueba del estudio de congelamiento/descongelamiento del anticuerpo J695 form ulado según lo descrito en el ejemplo 2* o La tabla 7 muestra que la sustancia de fármaco de anticuerpo J695 en el amortiguador de formulación se puede congelar/descongelar por lo menos cinco veces sin ningún efecto perjudicial sobre las propiedades fisicoquímicas, según lo supervisado por la medición de claridad, PCS, medición de partículas subvisibles y HPLC por exclusión de tamaño.

Por ejemplo, durante una serie de cinco ciclos de congelamiento/descongelamiento todas las muestras de anticuerpo J695 probadas exhibieron niveles de monómero de por lo menos 98%. Generalmente, el procesamiento de congelamiento/descongelamiento de las soluciones de anticuerpo se conoce por sus altos riesgos de inducir la inestabilidad de la proteína, que puede reflejar un aumento de agregados y cantidades elevadas de partículas subvisibles. Cuando se formula en la composición farmacéutica según lo descrito en el ejemplo 2, durante una serie de cinco ciclos de procesamiento de congelamiento/descongelamiento no se observo virtualmente ningún cambio de los niveles de agregados (niveles para todas las muestras probadas debajo del 1%), ningún cambio en el nivel de fragmentos (niveles para todas las muestras probadas debajo de 0.5%), y ningún cambio en la cantidad de partículas subvisibles (datos virtualmente sin cambiar a través de todo el estudio de congelamiento/descongelamiento).

Ejemplo 6: Análisis fisicoquímico de la formulación de J695 líquida estabilizada durante el almacenamiento de larga duración y acelerado La estabilidad de almacenamiento del anticuerpo J695 a una concentración de proteína de 100 mg/ml fue evaluada a varias temperaturas durante periodos de tiempo prolongados en donde el producto de fármaco de J695 fue almacenado a condiciones de temperatura controlada. Después de períodos de almacenamiento definidos, las muestras fueron sometidas a tensión y fue evaluado el impacto del tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento sobre la estabilidad de J695.

Aproximadamente 1 mi de solución de J695 fue llenado en jeringuillas de cristal de 1 mi para este experimento (llenado primario: SF1F007A: jeringuilla SCF, Becton Dickinson, combinada con un tope de embolo Fluorotec 4023/50). La tabla 8 proporciona una descripción con respecto a los intervalos de prueba y temperaturas de almacenamiento respectivas del anticuerpo J695.

Tabla 8: Intervalos de prueba: Temperaturas de almacenamiento y puntos de extracción de muestra aplicados durante el experimento de estabilidad de 100 mg/ml de producto de fármaco de J695 Intervalo de prueba en meses Condiciones de almacenamiento— — — — 0 1.5 3 6 12 24 + 5°C X X X X X X 25°C/60% RH X X X - 40°C/75% RH X X X - X define los puntos de tiempo en los cueles las muestras de J695 fueron sometidas a presión y analizadas Las pruebas analíticas usadas para determinar la estabilidad del producto de fármaco líquido fueron métodos desarrollados o métodos de farmacopea. Los métodos fueron aplicados según lo descrito anteriormente para probar el producto de fármaco líquido de J695 y se realizaron según lo descrito en la farmacopea citada.

Los resultados del experimento que evalúa el efecto del tiempo de almacenamiento y temperatura de almacenamiento donde J695 fue formulado a 100 mg/ml a un pH de aproximadamente 6 se reportan en la tabla 9. La tabla 9 demuestra que el anticuerpo J695 se puede someter a almacenamiento durante por lo menos 24 meses a un intervalo de temperaturas de entre 2°C y 8°C sin efecto perjudicial sobre la estabilidad física y química. Por ejemplo, durante un periodo de almacenamiento de 24 meses, todas las muestras de anticuerpo J695 probadas permanecieron virtualmente sin cambios con respecto a la claridad, color, aspecto, niveles de partículas subvisibles, y pH. Además, durante un periodo de por lo menos 24 meses, J695 formulado según lo descrito en el ejemplo 2 a 100 mg/ml exhibió niveles de monómero de por lo menos 98%, con niveles de fragmento estando por debajo de 0.5%. Incluso a condiciones de almacenamiento aceleradas, J695 fue altamente estable, con nieles de monómero que excedieron 90% incluso después del almacenamiento a 40°C durante 6 meses.

Con respecto a la estabilidad química, el anticuerpo J695 formulado en la composición según lo descrito en el ejemplo 2 a 100 mg/ml exhibió niveles de isoforma principal de por lo menos 80% durante por lo menos 24 meses a 2-8°C, con los niveles de espécimen básico por debajo de 10%, y niveles de espécimen ácido por debajo de 20%. Incluso a condiciones de almacenamiento acelerado, J695 fue altamente estable, con niveles de isoforma principal que excedieron 80%, niveles de espécimen básico por debajo de 10% y los niveles de espécimen ácido por debajo de 20%, para todas las temperaturas a las cuales la solución de anticuerpo congelada fue almacenada, incluso después del almacenamiento a 25°C durante 6 meses.

En conclusión, los datos demuestran que el anticuerpo J695 se puede someter al almacenamiento durante por lo menos 24 meses a 2-8°C sin impacto negativo sobre las propiedades químicas (HPLC de intercambio catiónico, HPLC por exclusión de tamaño, color, pH), propiedades fisicoquímicas (claridad, niveles de partículas subvisible, HPLC por exclusión de tamaño) u otras propiedades (análisis ELISA de actividad, concentración de proteína) cuando fue formulado en la composición farmacéutica según lo descrito en el ejemplo 2.

Tabla 9: Resultados de prueba de un estudio de estabilidad acelerada y de largo plazo del anticuerpo J695 formulado según lo descrito en el ejemplo 2 Duración Condiciones de Criterio de Parámetro de de prueba aimacenamiento [°C/%RH] Prueba calidad [meses] +5 +25/60 40/75 Inicial Ajustado 1.5 Ajustado Ajustado Ajustado Sin color a solución 3 Ajustado Ajustado Ajustado Apariencia ligeramente amarilla 6 Ajustado Ajustado Ajustado 12 Ajustado - - 24 Ajustado - - Inicial < RS III No más opalescente 1.5 = RS II < RS III < RS III que la suspensión de 3 = RS II < RS III < RS III Claridad referencial IV; < RS 6 = RS II = RS II = RS III IV 12 = RS II - - 24 < RS II - - Inicial < BY6 Color 1.5 < BY6 < BY6 < BY6 No más coloreada (comparación intensamente que la 3 < BY6 < BY6 < BY6 visual contra solución de solución de 6 < BY6 < BY6 < BY5 referencia BY4; < referencia de BY4 12 < BY6 — color, EP) 24 < BY6 Duración Condiciones de Criterio de Parámetro de de prueba almacenamiento [°C/%RH] Prueba calidad [meses] +5 +25/60 40/75 Inicial 6.2 1.5 6.1 6.1 6.1 3 6.2 6.2 6.2 pH 5.5 a 6.5 6 6.2 6.2 6.2 12 6.2 - - 24 6.2 - - Contaminación Inicial 0 en partículas 1.5 0.2 0 0 Partículas 3 0 0 0.3 visibles Resultado de reporte 6 0 0.2 0 (conteo visual) 12 0.1 - - (conteo visual de acuerdo con Germán Drug 24 3.1 - - Codex) Duración Condiciones de Criterio de Parámetro de de prueba almacenamiento [°C/%RH] Prueba calidad [meses] +5 +25/60 40/75 Ajustado Ajustado No ajustado 87.7 85.2 73.3 3 0.7 0.8 0.9 11.6 14.0 25.8 Ajustado Ajustado No ajustado 88.0 83.5 64.1 6 0.6 0.7 1.0 11.4 15.8 34.9 Ajustado - - 87.5 12 0.5 12.0 Ajustado - - 89.4 24 0.1 10.4 Inicial 94 ELISA de 1.5 108 101 90 actividad 70 - 143% 3 95 94 71 biológica 6 87 83 63 Duración Condiciones de Criterio de Parámetro de de prueba almacenamiento [°C/%RH] Prueba calidad [meses] +5 +25/60 40/75 Inicial 95 1.5 96 96 93 Concentración 3 97 96 98 de proteína 90-110 mg/ml 6 98 98 99 (OD 280 nm) 12 99 24 98 1 A: Agregados; M: monómero; F: fragmentos Ejemplo 7: Métodos y materiales por los estudios de segmentación Ejemplo 7.1: Materiales La metionina, histidina, arginina, manitol, polisorbato 80, poloxámero 188, cloruro de sodio, fosfato, acetato, deferoxamina, EDTA, citrato de sodio, tris-clorhidrato, desferritiocina, dismutasa de superóxido, y hidroxitolueno de butilo de grado más alto, fueron comprados de Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). La N-glicanasa fue comprada de Prozyme (San Leandro, CA). Sulfato de hierro (ll)-7H20, sulfato de magnesio, sulfato de níquel (II), sulfato de cobalto (II), y sulfato de manganeso (II) fueron comprados de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). El cloruro férrico-6H20 fue comprado de Mallinckrodt (Phillipsbu rg , NJ, USA). El sulfato cúprico-5H20 fue comprado de EMD Chemicals (Gibbstown, NJ, USA). El sulfato de zinc-7H20 fue comprado de JT Baker (Phillipsburg, NJ, USA). La trampa C18 fue comprada de Michrom BioResources (Auburn, CA, USA) y el capilar: capilar sin recubrimiento descubierto (50 µ?? id, longitud total 30 cm) y el amortiguador de muestra SDS MW fueron comprados de Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA).

Ejemplo 7.2: Métodos Ejemplo 7.2.1: Desglicosilación del anticuerpo Las muestras fueron eran desglicosiladás de manera enzimática usando N-glicanasa para simplificar el espectro de masa. Aproximadamente 30 µ? de cada muestra (concentración de aproximadamente 1 mg/ml) fue agregado a 2 µ? de 10% p/p de n-octilglucósido y 2 µ? de N-glicanasa y las muestras fueron incubadas a 37°C durante 19 horas.

Ejemplo 7.2.2: Cromatografía por exclusión de tamaño La SEC fue realizada usando cualquiera de los dos métodos descritos más adelante, (a) una columna de Pharmacia Superdex 200 (10/300 GL) (GE Healthcare, Piscataway, NJ) fue utilizada para separar el fragmento de anticuerpo y los agregados de los monómeros. La separación fue realizada bajo condiciones ¡socráticas usando 211 mM de Na2S04 con 92 mM de Na2HP04, pH 7.0. La detección fue realizada a 214 nm y el caudal fue mantenido a 0.5 ml/minutos. Comúnmente, aproximadamente 100 µ? de una solución de 1 mg/ml (carga de 100 µg) fue inyectado a una columna. El material fraccionado de la columna fue concentrado e intercambiado en 50 mM de bicarbonato de amonio usando un dispositivo de filtro centrífugo 10 kD Amicon Ultra-15 (Millipore, USA). El material fraccionado comúnmente fue inyectado nuevamente a la columna de SEC usando el mismo método pero con un volumen de inyección más pequeño (20 µ? de 1 mg/ml, 20 pg), (b) un gel TSK G3000 SWXL (Tosoh Bioscience) fue utilizado alternativamente para supervisar los agregados y fragmentos del anticuerpo. La separación fue realizada bajo condiciones ¡socráticas usando 211 mM de Na2S04 con 92 mM de Na2HP04, pH 7.0. La detección fue realizada a 214 nm y el caudal fue mantenido a 0.25 ml/minutos. Comúnmente, aproximadamente 10 µ? de 2 mg/ml de solución (carga de 20 \ig) fue inyectado a una columna.

Ejemplo 7.2.3: Espectrometría de masa Las muestras fueron analizadas en un espectrómetro de masa API QSTAR pulsar QTOF (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) acoplado a un sistema de HPLC capilar Agilent 1100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Las muestras fueron introducidas en el espectrómetro de masa y desalaron usando una micro-trampa C18 de Michrom BioResources (Auburn, CA, USA). Las muestras fueron cargadas bajo condiciones acuosas (0.02% TFA, 0.08% de ácido fórmicos en agua) para que durante los primeros cinco minutos se eliminen las sales y después se eluyan bajo condiciones orgánicas (0.02% de TFA, 0.08% de ácidos fórmico en acetonitrilo). Las muestras fueron analizadas a una concentración aproximada de 1 mg/ml, inyección de 10 µ? para una carga de 10 pg. Para ayudar a simplificar el espectro de masa las muestras fueron tratadas con 50 mM de ditiotreitol (DTT) a temperatura ambiente durante 30 minutos para reducir los enlaces de disulfuro y liberar los componentes de la cadena ligera y cadena pesada. Alternativamente, las muestras fueron analizadas sin reducir y desglicosilaron para simplificar el espectro de masa. A 30 µ? (concentración aproximada = 1 mg/ml) de cada muestra se agregaron 2 µ? de 10% p/p de n-octilglucósido y 2 µ? de N-glicanasa (Prozyme) e incubaron a 37°C durante 19 horas. El espectrómetro de masa fue ajustado para funcionar en un modo de ion positivo con un voltaje capilar de 4500 m/z, intervalo de exploración de 1500-3500 para las muestras no reducidas y 500 a 2500 para las muestras reducidas. El instrumento fue ajustado y calibrado usando el péptido de sustrato de renina (catálogo Sigma No. R-8129). La deconvolución de los espectros de masa de ESI fue realizada usando el software BioAnalyst versión 1.1.

Ejemplo 7.2.4: Electroforesis capilar Todos los estudios fueron realizados en un sistema Proteomelab PA800 CE o un sistema P/ACE MDQ (Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA) y la detección fue realizada a 214 nm. Un capilar sin recubrimiento descubierto fue utilizado para la separación con dimensiones de 50 pm id x 30 cm de longitud total (número de parte Beckman Coulter 338451) con una ventana de detector de 0.2 micrones. La preparación de muestra fue realizada bajo condiciones no reductivas. Aproximadamente 100 pg de la muestra fueron agregados a un frasco de 0.5 mi y el volumen apropiado de agua Milli-Q fue agregado para obtener un volumen final de 100 µ?. 5 µ? de 500 mM de yodoacetamida entonces fue agregado, seguido por 50 µ? de 50 mM de acetato a pH 4, 1% de amortiguador SDS para una concentración final de 1 mg/ml. La muestra fue mezclada bien e incubada a 60°C durante 10 minutos. La muestra finalmente fue transferida a un frasco muestreador automático y colocada en el muestreador automático a 10°C hasta el análisis. Los parámetros de método para el acondicionamiento previo al análisis del capilar fueron (usando el flujo inverso) un enjuague básico (hidróxido de sodio a 0.1N) durante 3 minutos en 70 psi seguidas por un enjuague ácido (ácido clorhídrico a 0.1N) durante 3 minutos en 70 psi, seguido por un enjuague de agua (agua Milli-Q) durante 1 minuto en 70 psi, seguida por un llenado con gel SDS (amortiguador de gel SDS MW, No. de catalogo de Beckman 391163) durante 10 minutos en 70 psi, seguido por una inmersión en agua Milli-Q para limpiar el capilar. La muestra fue inyectada de manera electrocinética durante 10 segundos a 15 kV seguido por una inmersión en Milli-Q para limpiar el capilar. La separación con voltaje fue durante 35 minutos a 15 kV. La temperatura capilar fue de 20-25°C y la temperatura de almacenamiento de muestra estuvo a 10°C.

Ejemplo 7.2.5: ICP-MS Las muestras fueron sometidas para ICP-MS de baja resolución a QTI-Intertek (Whitehouse, NJ, USA) e ICP-MS de alta resolución a AQura GmbH (Rodenbacher Chaussee 4, D-63457 Hanau, Alemania). Para ICP-MS de baja resolución, un espectrómetro de ICP-MS Perkin Elmer Elan fue utilizado mientras fue utilizado el Thermo Element XR.

Ejemplo 7.2.6: Filtración Ejemplo 7.2.6.1 : Ultrafiltración (UF) La ultrafiltración (UF) es un tipo de filtración por membrana donde la presión hidrostática fuerza un líquido contra una membrana semipermeable. Se conserva el anticuerpo, mientras que el agua y solutos de bajo peso molecular tal como sales de hierro pasan a través de la membrana. Una membrana de celulosa regenerada Millipore 30 K Pellicon 2 fue instalada de acuerdo con las instrucciones de Millipore. Las especificaciones de esfuerzo de torsión del fabricante fueron mantenidas y el sistema de UF fue ajustado con los calibradores de presión, tubería, y bombas apropiados. La válvula apropiada entonces fue abierta para comenzar la ultrafiltración. La presión de entrada (alimentación) y la presión de retenido fueron mantenidas dentro de los intervalos especificadas y el caudal y presiones de filtración fueron supervisados estrechamente. Los datos fueron registrados cada 15-30 minutos. Después de que la ultrafiltración fue completada el peso final fue registrado y la concentración fue determinada Eiemplo 7.2.6.2: Diafiltración (DF) La diafiltración (DF) es un proceso de filtración de flujo tangencial que se realiza en combinación con una operación de filtración (generalmente UF), donde el amortiguador se agrega para reemplazar la cantidad de solución perdida a través del filtro para mantener un volumen constante. El DF se utiliza para eliminar los metales y reemplazar la solución original con un nuevo amortiguador. El fluido se bombea tangencialmente a lo largo de la superficie de membrana (membranas de celulosa regeneradas Millipore 30 K Pellicon 2 por instrucciones de Millipore). Se aplica la presión constante para forzar una porción de fluido a través de la membrana al lado del filtrado. Como en la UF, las moléculas de IgG son demasiado grandes para pasar a través de los poros de la membrana y se conservan en el lado ascendente. Los componentes conservados no se acumulan en la superficie de la membrana. En su lugar, son arrastrados hacia adelante por el flujo tangencial. Por lo menos 8 diavolumes se utilizan para eliminar el hierro.

Ejemplo 8: Análisis de fragmentación Ejemplo 8.1: Fragmentación de una molécula de IgG (J695) en la región bisagra La SEC se utiliza comúnmente para supervisar la disminución del pico de monómero y el aspecto de los picos adicionales en un cromatógrama. La figura 2 muestra un perfil de SEC común de un anticuerpo monoclonal después del almacenamiento a 40°C durante aproximadamente 6 meses. Cuatro fracciones (fracciones 1-4) fueron recolectadas y analizadas posteriormente por SDS-PAGE, MS y CE-SDS. Las fracciones 1 y 2 representan el agregado y el anticuerpo de monómero, respectivamente. La fracción 3 contiene 100 kDa de especies formadas por la pérdida de una ramificación Fab (Fab + Fc o fragmento 2) y un porcentaje bajo de una especie no reducible (NR) integrada por un enlace de tioéter entre las cadenas pesadas (HC) y ligeras (LC) (Tous, G.l. y colaboradores (2005) Anal. Chem. 77(9):2675-82). La fracción 4 contiene la ramificación Fab (Córdoba, A.J. y colaboradores (2005) J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 818(2): 115-21 ).

El análisis del agregado y monómero por SDS-PAGE, bajo condiciones de reducción (figura 3, líneas 1 y 2), mostró la HC, LC y una especie NR con una masa evidente de 100 kDa. Los agregados de orden superior que son no reducibles se encuentran en la fracción 1 y a un grado menor en la fracción 2. El análisis de la fracción 3 bajo condiciones de reducción (línea 3) mostró HC, LC, especies NR y el fragmento Fe de cadena pesada (HC-Fc). El análisis de la fracción 4 (línea 4) mostró LC y el fragmento Fab de HC (HC-Fab).

Las fracciones 3 y 4 también fueron analizadas por ESI/LC-MS. La figura 4 muestra los espectros obtenidos después de la desglicosilación de la fracción 3. Los múltiples sitios de segmentación se observan en la región bisagra de cadena pesada de la molécula de IgG que dan lugar a la pérdida de la ramificación Fab (picos a-e, presentados brevemente en la tabla 9). Los sitios de segmentación principales se observan en el pico a entre los residuos His-222 y Thr-223 (H/T) y en el pico e entre los residuos Cys-218 y Asp-219 (C/D). Los sitios de segmentación menores se encuentran entre T/H, K/T, y D/K. El sitio de segmentación entre Ser-217 y Cys-218 (S/C) no fue encontrado y la adición de 70 Da al residuo de ácido aspártico en HC al pH más alto de 8 no fue reportada por Cohén y colaboradores (2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22):6976-7.

La figura 5 los espectros MS obtenidos de la fracción 4, que contuvo la especie Fab correspondiente (los picos f-j, se presentan brevemente en la tabla 10).

Tabla 10: Sinopsis de los espectros ESI/LC-MS de los diferentes fragmentos después de la separación por SEC Teo. Teo. Masa Sitio de Pico Residuos Glutamina Piroglutamina Observada Segmentación HC: a 96804.1 96770.1 96781.0 H/T 223-444 HC: b 96941.2 96907.2 96914.0 T/H 222-444 c HC: 97042.3 97008.3 97022.1 K/T 221-444 Teo. Teo. Masa Sitio de Pico Residuos Glutamina Piroglutamina Observada Segmentación HC: d 97170.5 97136.5 97157.3 D/K 220-444 HC: e 97285.6 97251.6 97268.0 C/D 219-444 HC: f - 46377.9 46380.2 C/D 1-218 HC: g - 46493.0 46492.9 D/K 1-219 HC: h - 46621.1 46623.2 K/T 1-220 HC: 1 - 46722.2 46725.0 T/H 1-221 HC: j - 46859.4 46861.0 H/T 1-222 LC: k - 22927.5 22927.9 E/C 1-215 HC: 1 - 23159.0 23159.3 S/C 1-217 Los sitios de segmentación principales también se observan en el pico (f) entre los residuos C/D y el pico (j) entre los residuos de H/T. Los sitios de segmentación secundarios entre D/K y T/H se encuentran con un alto nivel de segmentación entre K/T cuando se comparan al espectro del fragmento 2. También se muestra en la figura 6 (los picos k y I, se presentan brevemente en la tabla 10) la presencia de fragmentos libres de cadena ligera (pico (k) - residuos 1-215) y del fragmento de cadena pesada (pico (I) -residuos 1-217) en la fracción 4. Según lo observado anteriormente, no se observo la especie del fragmento 2 correspondiente que contendría el fragmento 218-444 ni la adición de 70 Da al residuo Asp-219 según lo reportado por Cohén y colaboradores (2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22) 6976-7.

Las fracciones 3 y 4 también fueron analizadas por CE-SDS. La figura 7 muestra un electroferograma de la fracción 3 y la posición de migración de la especie del fragmento 2 (pérdida de la ramificación Fab). Según lo observado en el electroferograma del anticuerpo intacto, el fragmento 2 fue determinado a partir del pico de monómero principal así como de otros picos, que por lo tanto proporcionaron una valoración exacta de los niveles de este fragmento para el análisis subsecuente. La fracción 4 mostró el Fab intacto así como los fragmentos LC y HC.

Ejemplo 8.2: Presencia de la segmentación causada por hierro o cobre de la molécula de IgG de una manera dependiente de la dosis en presencia de histidina En una modalidad, la incubación de un lote 1 anticuerpo anti-IL-12 J695 que contiene la cadena ligera lambda a 40°C acelera la fragmentación del anticuerpo en la región bisagra cuando el hierro e histidina están presentes en la formulación (tabla 11).

Tabla 11: El análisis por SEC mostró una fragmentación y agregación mejoradas en el lote 1 de J695 a 40°C A 40°C, el nivel de fragmentación en J695, lote 1 fue tan alto como 4.73% cuando fue comparado con un promedio de 0.5% obtenido de 5 lotes normales. Usando CE-SDS el nivel del fragmento 2 (Fab + Fc) fue calculado exactamente y mostró ser 3 veces más alto en el lote 1 de J695 (tabla 12).

Tabla 12: Análisis por CE-SDS de las diferentes especies de degradación Otras especies de degradación fueron cuantificadas por CE-SDS y el nivel del fragmento Fab fue elevado. Los niveles de fragmentos (fragmentos de LC/HC) también fueron significativamente elevados.

Un número de estudios conducidos no apoyaron la actividad de proteasa como una causa de la fragmentación creciente en el lote 1 de J695. La incubación, por ejemplo, con una mezcla de inhibidores de proteasa no tuvo niveles inferiores de fragmentación y la electroforesis en gel bidimensional y la identificación de las proteínas de célula hospedadora, después de eliminar el anticuerpo monoclonal, tampoco no mostraron ninguna evidencia de proteasas contaminantes (resultados no mostrados).

Los niveles normales de fragmentación fueron restaurados después de la diálisis contra el ácido cítrico, usando una membrana de 10,000 MWCO a 40°C (figura 8), sugiriendo que los metales estuvieron implicados en la fragmentación mejorada del lote 1 de J695. Un número de experimentos fue realizado posteriormente para evaluar la función de los metales en la fragmentación. El lote 1 de J695, así como otros lotes, fue analizado para determinar la presencia de 64 diferentes elementos por ICP-MS. Estos estudios demostraron que el lote 1 de J695 tuvo diez veces el nivel de hierro (500 ppb) cuando fue comparado con 5 lotes normales usando ICP-MS de alta resolución (tabla 13).

Tabla 13: Análisis de los niveles de hierro por ICP-MS de alta resolución Las muestras de anticuerpo fueron adicionadas con diferentes niveles de sales de metal (2.5, 10 y 50 ppm) en un lote normal e incubaron a 40°C. Según lo mostrado en la figura 9, las formulaciones con los estados oxidados del hierro o cobre mostraron un aumento dependiente de dosis en la fragmentación (fragmento 2). Otros metales probaron no tener ningún efecto sobre la fragmentación. El nivel de fragmentación observado con 500 ppb de hierro adicionado (2.5 ppm de sal de hierro) fue similar al observado para el lote 1 de J695. La tabla 14 presenta brevemente el perfil de degradación del anticuerpo inducido por diferentes metales según lo analizado por CE-SDS. Las muestras de anticuerpo fueron almacenadas a 40°C durante i mes antes del análisis. Los niveles de fragmentos Fab, libres de LC/HC y fragmento 2 (Fab+Fc), fueron todos elevados en presencia de hierro o cobre y estuvieron sin cambio en presencia de otros metales.

Tabla 14: Análisis por CE-SDS del perfil de fragmentación con diferentes metales Fragmento de HC/FAB Fragmento 2 LC/HC 2.5 ppm Fe3 + 1.40 0.72 3.02 Fe2 + 1.41 0.72 3.07 Cu2 + 1.26 0.72 3.04 Zn2 + 0.62 0.60 1.54 Mg2 + 0.65 0.60 1.58 Ni2 + 0.68 0.62 1.54 Co2 + 0.65 0.59 1.54 n2 + 0.65 0.62 1.66 10 ppm Fe3 + 1.96 0.82 4.20 Fe2 + 2.45 0.92 5.20 Cu2 + 2.08 1.00 4.78 Fragmento de HC/FAB Fragmento 2 LC/HC Zn2 + 0.66 0.61 1.59 Mg2 + 0.69 0.61 1.66 Ni2 + 0.68 0.59 1.52 Co2 + 0.68 0.60 1.52 Mn2 + 0.78 0.62 1.86 50 ppm Fe3 + 2.22 0.92 4.50 Fe2 + 2.67 1.06 5.28 Cu2 + 2.56 1.21 5.37 Zn2 + 0.59 0.59 1.56 Mg2 + 0.66 0.60 1.58 Ni2 + 0.58 0.62 1.50 Co2 + 0.53 0.34 1.00 Mn2 + 0.76 0.63 1.72 Ejemplo 8.3: Quelación de hierro con deferoxamina, un auelante de hierro específico, fragmentación bloqueada El lote 1 de J695 fue incubado con 1 mM de deferoxamina, un quelante de hierro específico. Los niveles de fragmentación normales fueron observados después de la incubación a 40°C durante 1 mes (figura 10). La adición de un lote de anticuerpo normal con hierro (500 ppb) mostró niveles de fragmento elevados que fueron restaurados a los niveles normales por incubación previa con deferoxamina (figura 10).

Ejemplo 8.4: Fragmentación mejorada catalizada por histidina e hierro La contribución de la histidina a la fragmentación inducida por metal fue investigada (figura 11). Un lote normal del anticuerpo monoclonai fue dializada contra agua. El hierro solo (50 ppm) o histidina sola (10 mM) fueron agregados o el hierro (50 ppm) con diferentes concentraciones de histidina (2, 5 y 10 mM) a un pH constante de 6.0 fueron agregados al anticuerpo monoclonai e incubaron a 40°C durante una semana. Según lo mostrado en la figura 11 ni la presencia de histidina ni hierro solos dio lugar a un aumento significativo de la fragmentación de anticuerpo son respecto a los niveles de control. Sin embargo, cuando el anticuerpo fue incubado con hierro e histidina juntos, fue observado un aumento dependiente de dosis de la fragmentación, lo cual indicó que el nivel de histidina agregado a la formulación podría desempeñar una función significativa en la fragmentación inducida por hierro.

Ejemplo 8.5: La comparación de los espectros MS entre un lote normal sometido a esfuerzo y una fragmentación catalizada por 'metal en el lote 1 de J695 mostró un perfil de segmentación distinto La figura 12 muestra una comparación de los espectros MS después de la desglicosilación del fragmento 2 (Fab + Fc). La segmentación entre Cys-218 y Asp-219 (C/D) en la secuencia de la región bisagra SCDKTHTC fue significativamente elevada en el lote 1 de J695 mientras que la segmentación en otros sitios de segmentación en la molécula no fue aumentada. Sin embargo, el análisis de la especie Fab (figura 13) mostró que los niveles de fragmento Fab correspondiente en este sitio de segmentación (residuos 1-218) en el lote 1 de J695 fueron comparables con los de un lote normal sometido a esfuerzo, mientras que el fragmento libre de HC segmentado entre Ser-217 y Cys-218 (S/C) fue significativamente elevado, lo cual dio por resultado un fragmento de HC de los residuos 1-217 (figura 14). Cohén y colaboradores ((2007) J. Am. Chem. Soc. 129(22) 6976-7) han demostrado recientemente que la segmentación entre el enlace de S/C ocurre vía un mecanismo de eliminación ß. Este mecanismo es frecuente a un pH más alto (pH 8) y es precedido por la división del enlace de disulfuro de LC-HC y la hidrólisis subsecuente del residuo de dehidroalanina dando por resultado un fragmento Fab que termina con la amida de serina (adición de 1 Da de masa) y un fragmento Fe de terminal C con un grupo piruvoilo (adición de 70 Da de masa al residuo de ácido aspártico). Los resultados indicaron un aumento en el sitio de segmentación entre los residuos C/D y una adición de 27 Da al residuo de ácido aspártico (pico C en la tabla 14), lo cual sugirió un diferente mecanismo de hidrólisis. Fueron observados los niveles elevados de cadena ligera libre que se segmenta entre E/C (residuos 1-215) en el lote 1 de J695 (figura 14). La tabla 15 presenta brevemente los datos recolectados para la comparación de los diferentes espectros MS.

Tabla 15: Sinopsis de los espectros ESI/LC-MS de los diferentes fragmentos Teo. Teo. Masa Sitio de Pico Residuos Glutamina Piroglutamina Observada Segmentación HC: A 96804.1 96770.1 96777.0 H/T 223-444 HC: B 97285.6 97251.6 97257.3 C/D 219-444 HC: C 97284.2 C/D 219-444 HC: D 46377.9 46377.7 C/D 1-218 HC: E 46493.0 46494.4 D/K 1-219 HC: F 46621.1 46623.6 K/T 1-220 HC: G 46859.4 46859.4 H/T 1-222 LC: H 22927.5 22926.7 E/C 1-215 HC: I 23159.0 23159.5 S/C 1-217 Ejemplo 8.6: El mecanismo de segmentación es específico para las moléculas que contienen una cadena lambda Fue investigada la capacidad del hierro e histidina de catalizar la hidrólisis de las moléculas de anticuerpo que poseen la cadena ligera kappa o lambda. Dos moléculas de IgG con LC lambda fueron segmentadas por el hierro e histidina mientras que las moléculas de IgG con una LC kappa no fueron segmentadas (figura 15). La figura 16 muestra la secuencia de residuos alrededor de los cuales se observa la hidrólisis de la molécula de IgG.

Ejemplo 9: Estudios de estabilidad acelerada En una modalidad, la incubación de una cadena ligera lambda que contiene el anticuerpo anti-IL-12 J695 a 40°C acelera la fragmentación del anticuerpo en la región bisagra cuando el hierro e histidina están presentes en la formulación. Por lo tanto, fue elegida una temperatura de incubación de 40°C para estos estudios. Para distinguir claramente entre la fragmentación del anticuerpo inducida por temperatura por sí misma y la fragmentación inducida por la presencia de hierro e histidina, todos los estudios de estabilidad acelerada fueron diseñados y realizados tal que un control positivo (es decir, la formulación del anticuerpo que contiene hierro e histidina) estuviera ajustado por una formulación de referencia (es decir, la formulación respectiva que contiene histidina, pero que carece de hierro).

Todas las formulación de J695 probadas en los experimentos enumerados en los ejemplos 9.1 a 9.15 fueron llenadas en frascos de polipropileno criogénicos estériles no pirogénicos, e incubados a 40°C durante hasta 3 meses. En los puntos de tiempo predeterminados (es decir, a T0, después de Times y después de T3meses de almacenamiento a 40°C/75% RH), las muestras de todas las formulaciones fueron sometidas a tensión, y el grado de fragmentación del anticuerpo en varias formulaciones fue determinado por la SEC según lo descrito en 7.2.2.

Ejemplo 9.1: Fragmentación de J695 en presencia de hierro en la solución a pH 5 El anticuerpo J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 5.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro.

Además, el anticuerpo J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 5.0 en las siguientes composiciones: c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.1. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones de J695 promueve la fragmentación de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) en 2 mg/ml. Sin embargo, los resultados también demuestran que la reducción a pH 5 protegió al J695 contra la fragmentación mediada por hierro-histidina. Esta reducción de la fragmentación no fue observada a pH 6.0 o pH 7.0 (ver, por ejemplo, las tablas 15.2 y 15.3 más adelante).

Tabla 15.1: Niveles de fragmento de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 5, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.2 5.8 14.8 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro Ejemplo 9.2: Fragmentación de J695 en presencia de hierro en la solución a pH 6 El anticuerpo J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01 % (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro; y c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 2.5 ppm de hierro.

Además, el anticuerpo J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; e) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro; y f) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 2.5 ppm de hierro.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.2. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones J695 conduce a la fragmentación sustancial de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) en 2 mg/ml y 100 mg/ml de J695. Los resultados además demuestran que un aumento del nivel de hierro resulta en niveles crecientes de fragmentos de J695.

Tabla 15.2: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.3 4.2 11.0 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.5 14.0 27.9 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.5 15.0 28.6 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 2.5 ppm de hierro T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.1 3.9 10.8 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.6 7.2 18.4 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.1 9.3 23.7 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 2.5 ppm de hierro Ejemplo 9.3: Fragmentación de J695 en presencia de hierro en la solución a pH 7 El anticuerpo J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 7.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro.

Además, el anticuerpo J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 7.0 en las siguientes composiciones: c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.3. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones J695 promueve la fragmentación de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) en un intervalo amplio de concentración de proteína, es decir, 2 mg/ml hasta 100 mg/ml. Los resultados además demuestran que la fragmentación de J695 como consecuencia de la fragmentación mediada por hierro-histidina es dependiente del pH de la formulación. Según lo mostrado en la figura 15.3, las formulaciones que tienen un pH por encima de 6.0 (tabla 15.3) son mas propensas a la fragmentación. En 100 mg/ml y a pH 7.0, la fragmentación se estabiliza, mientras que en 2 mg/ml continúa aumentando a pH 7.0. Tabla 15.3: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 7, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml 3.5 6.1 15.4 de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 7, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metíonina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro 3.2 25.6 49.8 pH 7, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 3.3 4.9 13.9 pH 7, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro 2.9 10.6 24.0 Ejemplo 9.4: Fragmentación de J695 a las condiciones de varias fuerzas iónicas El anticuerpo J695 fue formulado a 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro; c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbatos 80 y 150 mM de NaCI; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro y 150 mM de NaCI.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.4. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones J695 conduce a la fragmentación sustancial de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) en 2 mg/ml y 100 mg/ml de J695. Los resultados además demuestran que la fuerza iónica no afecta la fragmentación de J695 mediada por hierro-histidina. Tabla 15.4: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.3 4.2 11.0 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.5 14.0 27.9 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.1 3.9 10.8 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 3.6 7.2 18.4 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 2.9 4.9 13.5 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 150 mM de NaCI pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de 2.6 9.6 20.2 polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro, 150 mM de NaCI pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 2.7 4.2 11.9 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 150 mM de NaCI T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de 2.6 6.7 18.0 polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro, 150 mM de NaCI Ejemplo 9.5: Fragmentación de J695 formulado en amortiguador de arginina en presencia de hierro e histidina en solución a pH 6 El anticuerpo J695 fue formulado a 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y b) 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: c) 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y d) 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.5. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones J695 da lugar a la fragmentación de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) y que la presencia de otros amortiguadores basados en ácido orgánico y aminoácido, tal como arginina, no afectan la fragmentación de J695 mediada por hierro-histidina, sin importar la concentración de proteína (por ejemplo, 2 mg/ml o 100 mg/ml).

Tabla 15.5: Niveles de fragmentos de las formulaciones de J695 durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 3.2 7.1 15.0 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 2 mg/ml de J695, 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 3.3 10.3 23.2 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 2.2 4.7 13.8 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 30 mM de arginina, 10 mM de histidina, 40 2.5 7.7 20.5 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro Ejemplo 9.6: Fragmentación de J695 formulado en amortiguador de fosfato en presencia de hierro e la histidina en la solución a pH 6 El anticuerpo J695 fue formulado en 2 mg/ml, concentración a pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y b) 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro.

Además, el anticuerpo J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: c) 30 mM de fosfato, histidina de 10 mM, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y d) 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.6. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones J695 no da lugar a la fragmentación de J695 en 2 mg/ml y 100 mg/ml. Los resultados además demuestran que el uso del fosfato en formulaciones de anticuerpo reduce la fragmentación de anticuerpos mediada por hierro-histidina, sin importar la concentración de proteína (por ejemplo, 2 mg/ml o 100 mg/ml).

Tabla 15.6: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 2.5 9.3 20.5 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 2 mg/ml de J695, 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 2.2 9.3 21.8 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 2.0 4.4 12.6 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 100 mg/ml de J695, 30 mM de fosfato, 10 mM de histidina, 40 2.1 4.8 13.6 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro Ejemplo 9.7: Fragmentación de J695 formulado en amortiguador de acetato en presencia de hierro e la histidina en la solución a pH 6 El anticuerpo J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y b) 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: c) 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y d) 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro.

La incubación a varios temperaturas, extracción de muestra, y análisis de fragmentación en las cuatro formulaciones resultantes fueron realizadas de acuerdo con el ejemplo 9.1.

Los resultados de estos estudios se proporcionan en la tabla 15.7. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones de J695 da lugar a la fragmentación de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) y que la presencia de otros amortiguadores basados en elementos orgánicos, tal como acetato, no afectan la fragmentación de J695 mediada por hierro-histidina, sin importar la concentración de proteína (por ejemplo, 2 mg/ml o 100 mg/ml).

Tabla 15.7: Niveles de fragmento de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada.

T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 2.4 5.7 17.2 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 2 mg/ml de J695, 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 2.4 12.5 26.4 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 1.9 5.1 14.7 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 pH 6, 100 mg/ml de J695, 30 mM de acetato, 10 mM de histidina, 40 2.0 7.6 20.7 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro Ejemplo 9.8: Fragmentación de J695 en presencia de polisorbato 80 J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, y 0.5 ppm de hierro c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, y 0.5 ppm de hierro Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente. Los resultados de este experimento se proporcionan en la tabla 15.9 y se discuten más adelante en el ejemplo 9.9.

Ejemplo 9.9: Fragmentación de J695 en presencia de poloxámero 188 J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, y 0.5 ppm de hierro; c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.1% (m/v) de poloxámero 188; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.1% (m/v) de poloxámero 188, y 0.5 ppm de hierro.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0, en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente.

Los resultados de los experimentos descritos en los ejemplos 9.8 y 9.9 se proporcionan en la tabla 15.9. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones de J695 da lugar a la fragmentación de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de hierro) y que la presencia o ausencia de tensioactivos, tal como polisorbato 80 o poloxámero 188, no afectan la fragmentación mediada de J695 mediada por hierro-histidina, sin importar la concentración de proteína (por ejemplo, 2 mg/ml o 100 mg/ml) y el tipo y concentración del tensioactivo.

Tabla 15.9: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 2.1 4.8 13.4 mg/ml de manitol pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de 10 2.1 9.7 26.2 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.5 ppm de hierro T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de 10 mM de metionina, 10 mM de 1.9 5.2 14.4 histidina, 40 mg/ml de manitol pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de 10 mM de metionina, 10 mM de 2.3 7.8 21.7 histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.5 ppm de hierro pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de 10 mM de metionina e, 10 mM de 2.0 4.7 13.0 histidina, 40 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de poloxámero 188 pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de 10 mM de metionina 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.5 2.1 9.0 24.4 ppm de hierro, 1 mg/ml de poloxámero 188 pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de 10 mM de metionina, 10 mM de 2.0 5.1 15.0 histidina, 40 mg/ml de manitol, 1 mg/ml de poloxámero 188 T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.5 2.1 8.0 21.4 ppm de hierro, 1 mg/ml de poloxámero 188 Ejemplo 9.10: Fragmentación de J695 en presencia de manitol J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, y 0.5 ppm de hierro; c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 150 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 150 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, y 0.5 ppm de hierro.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente. La incubación a varias temperaturas, extracción de muestra, y análisis de fragmentación de J695 en las ocho formulaciones resultantes fue realizada de acuerdo con el ejemplo 9.1.

Los resultados de estos estudios se enumeran en la tabla 15.10. Los resultados demuestran que la presencia de hierro e histidina en las formulaciones de J695 da lugar a la fragmentación de J695 con respecto al control (es decir, la 5 formulación que carece de hierro) y que este proceso de fragmentación no es afectado por varias concentraciones de azúcares y alcoholes de azúcar tal como manitol (por ejemplo, 0 y 150 mg/ml), y por la concentración de proteína (por ejemplo, 2 mg/ml y 100 mg/ml de J695). io Cuadro 15.10: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C I5 pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 0 2.1 4.9 15.8 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80 pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 0 2.0 13.9 30.0 20 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 150 2.0 4.6 14.0 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 25 polisorbato 80 T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de J c metionina, 10 mM de histidina, 150 2.0 13.5 29.1 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de 0 metionina, 10 mM de histidina, 0 1.8 5.1 14.7 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80 pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 0 1.8 8.2 22.0 5 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 150 1.8 4.4 12.8 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 0 polisorbato 80 pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 150 1.8 7.6 21.5 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 5 polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro Ejemplo 9.11: Fragmentación de J695 en presencia de deferoxamina J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 y 2.5 ppm de hierro; c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) polisorbato 80 y 1 mM de deferoxamina; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbatos 80, 0.5 y 2.5 ppm de hierro y 1 mM de deferoxamina.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente. La incubación a varias temperaturas, extracción de muestra, y análisis de fragmentación de J695 en las doce formulaciones resultantes fueron realizadas de acuerdo con el ejemplo 9.1.

Los resultados esenciales de estos estudios se enumeran en la tabla 15.11. Los resultados demuestran que la presencia de deferoxamina en las formulaciones de J695 no afecta negativamente la estabilidad de J695 con respecto al control (es decir, la formulación que carece de deferoxamina). Los resultados además demuestran que la deferoxamina reduce la fragmentación mediada por histidina-hierro en la formulación de J695 a una concentración amplia de hierro y a una concentración amplia de proteína (por ejemplo, a 2 mg/ml y 100 mg/ml de J695).

Tabla 15.11: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 1.8 4.7 12.0 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 1 mM de deferoxamina pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 1.9 4.7 12.2 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 1 mM de deferoxamina, 0.5 ppm de hierro pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 1.8 4.6 12.3 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 1 mM de deferoxamina, 2.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 1.8 4.7 12.3 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 1 mM de deferoxamina T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 1.6 4.9 12.4 polisorbato 80, 1 mM de deferoxamina, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 1.7 4.9 12.6 polisorbato 80, 1 mM de deferoxamina, 2.5 ppm de hierro Ejemplo 9.12: Fragmentación de J695 en presencia de una sal de citrato J695 fue formulado en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro; c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 30 mM de citrato; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro y 30 mM de citrato.

Además, J695 fue formulado en 100 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente. La incubación a varias temperaturas, extracción de muestra y análisis de fragmentación de J695 en las ocho formulaciones resultantes fueron realizadas de acuerdo con el ejemplo 9.1.

Los resultados esenciales de estos estudios se enumeran en la tabla 15.12. Los resultados demuestran que la presencia de citrato en las formulaciones J695 no afecta negativamente la estabilidad de J695 comparado al control (es decir, la formulación que carece de citrato). Los resultados además demuestran que el citrato reduce la fragmentación mediada por histidina-hierro en las formulaciones de J695 a una concentración amplia de proteína (2 mg/ml y 100 mg/ml de J695).

Tabla 15.12: Niveles de fragmentos de J695 con diferentes formulaciones durante los estudios de estabilidad acelerada T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses, 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 1.8 4.4 12.5 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 30 mM de citrato T3 T0, T1 mes, Composición de formulación meses , 5°C 40°C 40°C pH 6, 2 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 1.7 4.6 12.5 polisorbato 80, 30 mM de citrato, 0.5 ppm de hierro pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 1.6 4.6 13.1 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de polisorbato 80, 30 mM de citrato pH 6, 100 mg/ml de J695, 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.1 mg/ml de 1.7 4.9 13.0 polisorbato 80, 30 mM de citrato, 0.5 ppm de hierro Ejemplo 9.13: Fraamentación de J695 en presencia de desferritiocina J695 se formula en 2 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro; c) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbatos 80 y 0.1 mM de desferritiocina; y d) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80, 0.5 ppm de hierro y 0.1 mM de desferritiocina.

Además, J695 se formula en 100 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones (a) a (d) según lo enumerado anteriormente. La incubación a varias temperaturas, extracción de muestra, y análisis de fragmentación de J695 en las ocho formulaciones resultantes se realizaron de acuerdo con el ejemplo 9.1.

Ejemplo 9.14: Mutaciones de residuos en la región bisagra J695 con los residuos mutantes específicos en la región bisagra se formula en 2 mg/ml, pH 6 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80; y b) 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 0.5 ppm de hierro.

Además, J695 se formula en 100 mg/ml en las composiciones (a) a (b) según lo enumerado anteriormente. La incubación a varias temperaturas, extracción de muestra, y análisis de fragmentación de J695 en las cuatro formulaciones resultantes se realizaron de acuerdo con el ejemplo 9.1.

Ejemplo 9.15: Eliminación de histidina de la formulación J695 fue formulado en 17 mg/ml, pH 6.0 en las siguientes composiciones: a) 10 mM de metionina, 10 mM de imidazol, 40 mg/ml de manitol; y b) 10 mM de metionina, 10 mM de imidazol, 40 mg/ml de manitol y 100 ppm de sulfato de hierro (II).

La incubación de las composiciones fue realizada a 40°C durante 2 semanas y el análisis fue realizado por CE-SDS no reductivo según lo descrito en el ejemplo 7.2.4.

Los resultados esenciales de estos estudios se enumeran en la siguiente tabla 15.13. Los resultados demuestran que la eliminación de histidina y el reemplazo con imidazol no dan lugar a la fragmentación de J695 en presencia de hierro. Estos resultados demuestran que la eliminación de histidina inhibe o previene la fragmentación de J695 en presencia de hierro. Tabla 15.13: Niveles de fragmentos de J695 sin histidina en la formulación y después de los estudios de estabilidad acelerada. J695 fue formulado en 17 mg/ml, pH 6.0 según lo especificado anteriormente en a) y b).

LC y Fragmento HC/FAB (HCLC) (2)HC(1)LC Intacto otras 2 10 mM de metionina, 10 mM de 1.16 0.46 0.21 1.29 3.24 93.65 imidazol, 40 mg/ml de manitol LCy Fragmento HC/FAB (HCLC) (2)HC(1)LC Intacto otras 2 10 mM de metionina, 10 mM de imidazol , 40 mg/ml 0.95 0.49 0.42 1.25 3.14 93.76 de manitol y 100 ppm de sulfato de hierro (M) Ejemplo 9.16: Eliminación de hierro vía ultrafiltración/diafiltración o por diálisis J695 que contiene hierro (500 ppm) y J695 sin hierro (60 ppm) como control fueron dializados en el amortiguador de formulación (10 mM de histidina, 10 mM de metionina, 4% de manitol, pH 6.0) o amortiguador de citrato/fosfato (10 mM de hidrógeno-fosfato de sodio, 10 mM de ácido cítrico; pH = 6.0). Las muestras entonces fueron incubadas durante 1 mes a 40°C Las muestras fueron analizadas por CE-SDS no reductor después de la incubación para determinar la cantidad presente de fragmentos.

Los resultados se proporcionan en la siguiente tabla 15.14. Los resultados demuestran que la diálisis contra el amortiguador de formulación o amortiguador de citrato/fosfato resulta en una reducción de la fragmentación. La diálisis en el amortiguador de citrato/fosfato dio lugar a una mayor disminución de la fragmentación con respecto a la diálisis contra el amortiguador de formulación, indicando una función posible del citrato/fosfato en la unión de hierro y separación del hierro de la proteína.

Tabla 15.14: Niveles de fragmentos de J695 después de la diálisis y estudios de estabilidad acelerada LCy Fragmento HC/FAB (HCLC) (2)HC(1)LC Intacto otras 2 J695 con 60 ppm de hierro 0.62 0.6 0.23 1.51 2.55 94.48 después de 1 mes a 40°C J695 con 500 ppm de hierro 1.65 0.91 0.3 3.41 3.97 89.66 después de 1 mes a 40°C LCy Fragmento HC/FAB (HCLC) (2)HC(1)LC Intacto otras 2 J695 con 500 ppm de hierro y diálisis con amortiguador 0.57 0.6 0.21 1.45 2.69 94.48 de citrato después de 1 mes a 40°C J695 con 500 ppm de hierro y diálisis con amortiguador 1.02 0.78 0.22 2.1 3.21 92.66 de formulación después de 1 mes a 40°C Ejemplo 10: Fragmentación de J695 a varios niveles de hierro y a diferentes temperaturas El análisis por SEC mostró mejorar la fragmentación en J695 a 25°C y 40°C con el aumento de los niveles de hierro. No se observó ningún impacto del hierro, adicionado hasta 10,000 ppb, después de 6 meses de almacenamiento a 5°C.

Ejemplo 10.1: Fragmentación de J695 (100 mg/ml) a varios niveles de hierro v diferentes temperaturas Después de que fue seleccionado el amortiguador de formulación para el anticuerpo J695, la sustancia de fármaco fue formulada en la misma matriz que el producto final. El objetivo principal de la formulación de proteína es mantener la estabilidad de una proteína dada en su forma farmacéuticamente activa natural, durante periodos de tiempo prolongados para garantizar una vida útil aceptable del fármaco de proteína farmacéutico. La temperatura de almacenamiento recomendada para la jeringa llenada previamente con J695 es 2-8°C y los niveles de hierro normales medidos en varios lotes de J695 fueron de aproximadamente 60 ppb (tabla 16). Fue determinado el impacto de adicionar diferentes niveles de hierro en la fragmentación después de almacenar PFS a la temperatura de almacenamiento recomendada de 5o y a las temperaturas elevadas de 25°C y 40°C durante hasta 6 meses.

El anticuerpo, J695, fue formulado en 100 mg/ml en una jeringa llenada previamente, mantenida a pH 6.0 en las siguientes composiciones nominales: 1. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 2. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 10 ppb de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 3. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 50 ppb de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 4. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 100 ppb de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 5. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 250 ppb de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 6. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 500 ppb de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 7. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 1 ppm de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 8. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 5 ppm de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) 9. 10 mM de metionina, 10 mM de histidina, 40 mg/ml de manitol, 0.01% (m/v) de polisorbato 80 y 10 ppm de hierro al igual que el sulfato de Fe (II) Las formulaciones resultantes fueron llenadas en jeringas llenadas previamente e incubadas a 5, 25 y 40°C durante hasta 6 meses. En los puntos de tiempo predeterminados, las muestras de todas las formulaciones fueron extraídas, y el grado de fragmentación del anticuerpo en varias formulaciones fue determinado por SEC. Según lo observado en la tabla 16, no hubo impacto del hierro (adicionado con hasta 10,000 ppb) sobre la fragmentación observada después de 6 meses en las condiciones de almacenamiento recomendadas. Estos estudios indican que en las condiciones de almacenamiento recomendadas la formulación de J695 mantuvo la estabilidad de una proteína dada en su forma farmacéuticamente activa natural, durante periodos de tiempo prolongados para proporcionar una vida útil aceptable del fármaco de proteína farmacéutico.

También fue evaluado el impacto sobre la fragmentación a temperatura elevada adicionando diferentes niveles de hierro en las jeringas llenadas previamente con J695 y almacenando a 25° y 40°C. Según lo observado en la tabla 16, adicionar el hierro anterior anteriormente 160 ppb (que corresponde al nivel normal de 60 ppb de Fe + 100 ppb agregados para el experimento de adición) condujo a la fragmentación creciente a 25°C y 40°C según lo determinado por SEC.

Tabla 16 Temperatura Almacenamiento Características 5°C 25°C 40°C en meses Adicionado con 10 ppb 0 fragmentos 1.7 n/a n/a 1 fragmentos 1.4 1.6 3.6 3 fragmentos 1.4 2.2 7.7 6 fragmentos 1.2 3.1 13.2 adicionado con 50 ppb 0 fragmentos 1.8 n/a n/a 1 fragmentos 1.3 1.6 4.1 3 fragmentos 1.4 2.4 8.8 6 fragmentos .3 3.4 14.6 adicionado con 100 ppb 0 fragmentos 1.7 n/a n/a 1 fragmentos 1.3 1.5 4.7 3 fragmentos 1.4 2.6 10.2 6 fragmentos 1.4 3.8 16.3 Temperatura Almacenamiento Características 5°C 25°C 40°C en meses adicionado con 250 ppb 0 fragmentos 1.6 n/a n/a 1 fragmentos 1.2 1.8 6.7 3 fragmentos 1.4 3.6 13.9 6 fragmentos 1.4 5.3 20.5 adicionado con 500 ppb 0 fragmentos 1.7 n/a n/a 1 fragmentos 1.1 2.2 8.4 3 fragmentos 1.5 4.7 17.6 6 fragmentos 1.7 7.5 25.0 adicionado con 1,000 ppb 0 fragmentos 1.7 n/a n/a 1 fragmentos 2.7 3.8 12.0 3 fragmentos 1.2 4.5 19.1 6 fragmentos 1.3 8.2 27.8 adicionado con 5,000 ppb 0 fragmentos 1.9 n/a n/a Temperatura Almacenamiento Características 5°C 25°C 40°C en meses 1 fragmentos 4.3 4.6 13.5 3 fragmentos 1.2 5.4 21.2 6 fragmentos 1.5 10.1 30.9 adicionado con 10,000 ppb 0 fragmentos 1.9 n/a n/a 1 fragmentos 4.2 4.8 13.3 3 fragmentos 1.3 5.7 21.3 6 fragmentos 1.6 10.3 30.0 Ejemplo 10.2: Fragmentación de J695 (2 mo/ml) a varios niveles de hierro y a diferentes temperaturas Además, J695 se formula en 2 mg/ml, pH 6.0 en las composiciones nominales (1) a (9) según lo enumerado anteriormente. Las 9 formulaciones resultantes se llenan en frascos criogénicos de polipropileno no pirogénico estériles y se incuban a 5o, 25° y 40°C durante hasta 6 meses. Además, las 9 formulaciones se almacenan a la temperatura de almacenamiento recomendada a 2-8°C durante hasta 12 meses. En los puntos de tiempo predeterminados, las muestras de todas las formulaciones se extraen, y el grado de fragmentación del anticuerpo en varias formulaciones es determinado por SEC.

Incorporación por referencia El contenido de todas las referencias citadas (incluyendo referencias de literatura, patentes, solicitudes de patente, y sitios Web) que se pueden citar a través de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente por referencia en su totalidad, al igual que las referencias citadas en la misma. La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, las técnicas convencionales de la formulación de proteína, que son bien conocidas en la técnica.

Equivalentes La invención se puede incorporar a otras formas específicas sin apartarse del espíritu o características esenciales de la misma. Las modalidades anteriores deben por lo tanto ser consideradas en todos los aspectos como ilustrativas en lugar de limitantes de la invención descrita en la presente. El alcance de la invención es indicado así por las reivindicaciones anexadas en lugar de por la descripción anterior, y todos los cambios que se encuentran dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones por lo tanto se piensan como incluidos en la presente.

Claims (144)

REIVINDICACIONES

1. Un método para inhibir o prevenir la segmentación de una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda en una formulación que contiene histidina, el método comprende la etapa de inhibir o prevenir la capacidad de los metales de segmentar la molécula.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición o prevención comprende incluir por lo menos un quelante de metal en la formulación.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición o prevención comprende someter la formulación a por lo menos un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de filtración, intercambio de amortiguador, cromatografía, e intercambio de resina.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la filtración se selecciona del grupo que consiste de ultrafiltración y diafiltración.

5. El método de la reivindicación 3, en donde el intercambio de amortiguador comprende la diálisis con un amortiguador seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador que comprende histidina, un amortiguador que comprende citrato y fosfato y un amortiguador que comprende imidazol.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición o prevención comprende incluir un amortiguador de citrato o un amortiguador de fosfato en la formulación.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición o prevención comprende inhibir o prevenir la segmentación alterando por lo menos un aminoácido en la cadena ligera lambda.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición o prevención comprende inhibir o prevenir la segmentación alterando la secuencia de aminoácido en la cadena lambda tal que sea cambiada una secuencia de aminoácido ácido glutámico-cisteína-serina.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende aproximadamente 10 mM de histidina.

10. El método de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende aproximadamente 1-100 mM de histidina.

11. El método de la reivindicación 1, en donde la segmentación ocurre en una región bisagra de la cadena lambda.

12. El método de la reivindicación 1, en donde por lo menos una porción de una cadena ligera lambda comprende la secuencia de aminoácido ácido glutámico-cisteína-serina, o por lo menos una modificación que no inhibe la unión del anticuerpo.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la segmentación ocurre entre el ácido glutámico y la cisteína.

14. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula comprende por lo menos una porción de una cadena pesada.

15. El método de modificación de la reivindicación 1, en donde la porción de una cadena pesada comprende la secuencia de aminoácido SCDK, o por lo menos una que no inhibe la unión del anticuerpo.

16. El método de la reivindicación 10, en donde la segmentación ocurre entre la serina y la cisteína.

17. El método de la reivindicación 10, en donde la segmentación ocurre entre la cisteína y el ácido aspártico.

18. El método de la reivindicación 1, en donde el metal es Fe2 + .

19. El método de la reivindicación 1, en donde el metal es Fe3+.

20. El método de la reivindicación 1, en donde el metal es Cu2 + .

21. El método de la reivindicación 1, en donde el metal es Cu1 + .

22. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula está presente en un intervalo de concentración de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml.

23. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula está presente a una concentración de aproximadamente 2 mg/ml.

24. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula está presente a una concentración de aproximadamente 7 mg/ml.

25. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula está presente a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml.

26. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula es una inmunoglobulina.

27. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal.

28. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula se selecciona del grupo que consiste de una DVD-lg™, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, anticuerpo quimérico, anticuerpo con CDR injertada, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, Fv enlazado por disulfuro, anticuerpo de dominio simple, anticuerpo multiespecífico, anticuerpo dual específico, y un anticuerpo biespecífico.

29. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula es un anticuerpo anti-IL-12/23.

30. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula es J695.

31. El método de la reivindicación 1, en donde la molécula es un anticuerpo anti-CD80 o anti-IGF1, 2.

32. El método de la reivindicación 1, en donde la segmentación ocurre a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 25°C.

33. El método de la reivindicación 1, en donde la segmentación ocurre a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C.

34. El método de la reivindicación 1, en donde la segmentación ocurre a un pH de aproximadamente 4 a aproximadamente 8.

35. El método de la reivindicación 1, en donde la segmentación ocurre a un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 6.

36. El método de la reivindicación 1, en donde la inhibición o prevención comprende la disminución del pH a aproximadamente 5 o menos.

37. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal se selecciona del grupo que consiste de citrato, sideroforo, calixerenos, ácido aminopolicarboxílico, ácido hidroxiaminocarboxílico, glicina sustituida con N, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), quelante de hierro bidentado, tridentado o hexadentado, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

38. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es un sideroforo seleccionado del grupo que consiste de aerobactina, agrobactina, azotobactina, bacilibactina, ácido N-(5-C3-L-(5-aminopentil)hidroxicarbamoil)-propionamido)pentil)-3-(5-(N-hidroxiacetoamido)-pentil)carbamoil)-proprionhidroxámico (deferoxamina, desferrioxamina o DFO o DEF), desferritiocina, enterobactina , eritrobactina, ferricromo, ferrioxamina B, ferrioxamina E, fluviabactina, fusarinina C, micobactina, parabactina, pseudobactina, vibriobactina, vulnibactina, yersiniabactina, ornibactina, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

39. El método de la reivindicación 38, en donde el quelante de metal es deferoxamina.

40. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es citrato.

41. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es un ácido aminopolicarboxilico seleccionado del grupo que consiste de ácido etilendiaminotetracético (EDTA), ácido nitriloacético (NTA), ácido trans-diaminociclohexano-tetraacético (DCTA), ácido pentaacético de dietilentriamina (DTPA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), ácido aspártico, ácido bis(aminoetil)glicoléter-N,N,N'N'-tetraacético (EGTA), ácido glutámico, y ácido N,N'-bis(2-hidroxibencil)etilendiamina-N,N'-diacético (HBED), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

42. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es un ácido N-hidroxietiliminodiacético (HIMDA), N,N-bishidroxietilglicina (bicina), y N-(trishidroximetilmetil)glicina (tricina), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

43. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es una glicina sustituida con N, o derivado, análogo, o combinación de la misma.

44. El método de la reivindicación 43, en donde la glicina sustituida con N se selecciona del grupo que consiste de glicilglicina, y derivados, análogos, y combinaciones de la misma.

45. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), y derivados, análogos, y combinaciones del mismo.

46. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal comprende una combinación de DTPA y DEF.

47. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal comprende una combinación de EDTA, EGTA y DEF.

48. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es un calixareno seleccionado del grupo que consiste de un macrociclo u oligómero cíclico basado en un producto de hidroxialquilización de un fenol y un aldehido, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

49. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es un derivado de hidroxipiridina, un derivado de hidrazona, y un derivado de hidroxifenilo o un derivado de nicotinilo, tal como 1 ,2-dimetil-3-hidroxipiridin-4-ona (Deferiprona, DFP o Ferriprox); 2-deoxi-2-(N-carbamoilmetil-[N'-2'-metil-3'-hidroxipiridin-4'-ona])-D-glucopiranosa (Feralex-G), piridoxal-isonicotinil-hidrazona (PIH); ácido 4,5-dihidro-2-(2 ,4-dihidroxifenil)-4-metiltiazol-4-carboxílico (GT56-252), ácido 4- [3,5-bis(2-hidroxifenil)-[1 ,2,4]triazol-1-il]benzoico (ICL-670); ácido N,N'-bis(o-hidroxibencil)etilendiamina-N,N'-d ¡acético (HBED), 5-cloro-7-yodo-quinolin-8-ol (clioquinol), y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

50. El método de la reivindicación 2, en donde por lo menos un quelante de metal es un quelante de cobre seleccionado del grupo que consiste de trietilentetramina (trientina), tetraetilenpentaamina, D-penicilamina, etilendiamina, bispiridina, fenantrolina, batofenantrolina, neocuproina, sulfonato de batocuproina, cuprizona, cis,cis-1 ,3,5,-triaminociclohexano (TACH), tachpir, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

51. El método de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de aminoácido, azúcar, alcohol de azúcar, amortiguador, sal, y tensioactivo.

52. El método de la reivindicación 1, en donde la formulación comprende por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de aproximadamente 1 a 60 mg/ml de manitol, aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mM de metionina, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.5% (peso/volumen) de polisorbato 80, aproximadamente 0.001% a aproximadamente 1% (peso/volumen) de polioxámero 188, aproximadamente 1 a aproximadamente 150 mM de cloruro de sodio, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de acetato, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de citrato, aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de fosfato, y aproximadamente 1 a aproximadamente 30 mM de arginina.

53. Un método para detectar la segmentación de una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda en una formulación que contiene histidina, el método comprende las etapas de incluir por lo menos un quelante de metal en la formulación y analizar por lo menos una porción de la molécula para determinar la segmentación.

54. Una formulación estable que comprende una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda y un sistema amortiguador que comprenden histidina, en donde la formulación está sustancialmente libre de metal.

55. La formulación de la reivindicación 54, en donde el metal es Fe2+ o Fe3 + .

56. La formulación de la reivindicación 54, en donde el metal es Cu2+ o Cu1 + .

57. La formulación de la reivindicación 54, en donde la formulación está sustancialmente libre de metal después de someterse a por lo menos un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de filtración, intercambio de amortiguador, cromatografía e intercambio de resina.

58. La formulación de la reivindicación 57, en donde el intercambio de amortiguador comprende diálisis con un amortiguador seleccionado del grupo que consiste de un amortiguador que comprende histidina, un amortiguador que comprende citrato y fosfato y un amortiguador que comprende imidazol.

59. La formulación de la reivindicación 54, en donde el metal está presente en una concentración seleccionada del grupo que consiste de menos de aproximadamente 5,060 ppb, menos de aproximadamente 1,060 ppb, menos de aproximadamente 560 ppb, menos de aproximadamente 310 ppb, menos de aproximadamente 160 ppb, menos de aproximadamente 110 ppb y menos de aproximadamente 70 ppb.

60. La formulación de la reivindicación 59, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 160 ppb.

61. La formulación de la reivindicación 59, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 70 ppb.

62. La formulación de la reivindicación 54, que adicionalmente comprende por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de un poliol y un tensioactivo.

63. La formulación de la reivindicación 62, que adicionalmente comprende un estabilizador.

64. La formulación de la reivindicación 54, que adicionalmente comprende manitol, polisorbato 80 y metionina.

65. La formulación de la reivindicación 54, en donde el sistema amortiguador adicionalmente comprende citrato o fosfato.

66. La formulación de la reivindicación 54, en donde el pH es de aproximadamente 5 o menos.

67. La formulación de la reivindicación 64, que comprende (a) 1-10% de manitol, (b) 0.001-0.1% de polisorbato 80, (c) un sistema amortiguador que comprende de 1-100 m de histidina y 1-50 mM de metionina, con un pH de 5 a 7.

68. La formulación de la reivindicación 64, que comprende (a) 2-6% de manitol, (b) 0.005-0.05% de polisorbato 80, (c) un sistema amortiguador que comprende de 5-50 mM de histidina y 5-20 mM de metionina, con un pH de 5 a 7.

69. La formulación de la reivindicación 64, que comprende (a) aproximadamente 4% de manitol, (b) aproximadamente 0.01% de polisorbato 80, (c) un sistema amortiguador que comprende aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 10 mM de metionina, con un pH de aproximadamente 6.

70. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 54-69, en donde la molécula es un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo.

71. La formulación de la reivindicación 70, en donde la concentración de anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 250 mg/ml.

72. La formulación de la reivindicación 70, en donde la concentración de anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 200 mg/ml.

73. La formulación de la reivindicación 70, en donde la concentración de anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es aproximadamente 100 mg/ml.

74. La formulación de la reivindicación 70, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unir a un epítopo de una subunidad p40 de IL-12/IL-23.

75. La formulación de la reivindicación 74, en donde el anticuerpo humano es el anticuerpo J695, o una porción de unión a antígeno del mismo.

76. La formulación de la reivindicación 74 ó 75, que tiene una vida útil de por lo menos 24 meses.

77. La formulación de la reivindicación 74 ó 75, que mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

78. La formulación de la reivindicación 74 ó 75, que adicionalmente comprende un agente adicional.

79. La formulación de la reivindicación 78, en donde el agente adicional es un agente terapéutico.

80. La formulación de la reivindicación 79, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticoesteroide, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilato, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, un inhibidor de lipooxigenasa , mesalamina, olsalazina, balsalazida, un antioxidante, un inhibidor de tromboxano, un antagonista del receptor IL-1, un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 ß, un anticuerpo del receptor anti-IL-1, un anticuerpo monoclonal anti-IL-6, un anticuerpo del receptor anti-IL-6, un factor de crecimiento, un inhibidor de elastasa, un compuesto de piridinil-imidazol, un anticuerpo o agonista de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, E AP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, un anticuerpo para CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o ligando del mismo, metotrexato, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, NSAID, ibuprofeno, prednisolona, un inhibidor de fosfodiesterasa, un agonista de S1P1, un inhibidor de bcl-2, un agonista de adenosina, un agente anti-trombótico, un inhibidor de complemento, un agente adrenérgico, IRAK, NIK, IKK, p38, un inhibidor de MAP cinasa, inhibidor de enzima de conversión IL-1 ß , inhibidor de enzima de conversión de TNFa, un inhibidor de señalización de célula T, un inhibidor de metaloproteinasa, un inhibidor de enzima de conversión de angiotensina, un receptor de citocina soluble, receptor soluble de p55 TNF, receptor soluble de p75 TNF, slL-1 Rl , slL-1 Rll, slL-6R, una citocina antiinflamatoria, IL-4, IL-10 , IL-11, IL-13, y TGFp.

81. La formulación de la reivindicación 79, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNF y fragmentos de anticuerpo del mismo, un constructo de TNFR-lg, un inhibidor de TACE, un inhibidor de PDE4, un corticoesteroide, budenosida, dexametasona, sulfasalazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, inhibidor de enzima de conversión de I L- 1 ß , I L-1 ra , un inhibidor de tirosina cinasa, 6-mercaptopurina, y IL-11.

82. La formulación de la reivindicación 79, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de metilprednisolona, ciclofosfamida, 4-aminopiridina, tizanidina, interferón-ß? a, interferón-ß? b, copolímero 1, oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, cladribina, un inhibidor de TACE, un inhibidor de cinasa, slL-13R, un anti-P7, y ligando de glicoproteína de selectina p (PSGL).

83. Una formulación estable que comprende una molécula que comprende por lo menos una porción de una cadena ligera lambda, un sistema amortiguador que comprende imidazol, y un metal, en donde la molécula no se segmenta dentro de la región bisagra en presencia de un metal.

84. Una formulación estable que comprende una molécula que abarca por lo menos una porción de una cadena ligera lambda, un sistema amortiguador que comprende histidina, y un quelante de metal, en donde la molécula no se segmenta dentro de la región bisagra ni se segmenta dentro de la región bisagra a un nivel que sea menor que el nivel de segmentación observado en ausencia del quelante de metal.

85. La formulación de la reivindicación 83 ó 84, en donde el metal es Fe2+ o Fe3 + .

86. La formulación de la reivindicación 83 ó 84, en donde el metal es Cu2+ o Cu1 + .

87. La formulación de la reivindicación 84, en donde el quelante de metal se selecciona del grupo que consiste de sideróforo, calixarenos, ácido aminopolicarboxílico, ácido hidroxiaminocarboxílico, glicina sustituida con N, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetansulfónico (BES), un quelante hierro bidentado, tridentado o hexadentado, un quelante de cobre, y derivados, análogos, y combinaciones de los mismos.

88. La formulación de la reivindicación 87, en donde el quelante de metal es deferoxamina.

89. La formulación de la reivindicación 83 ó 84, que comprende por lo menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de un poliol y un tensioactivo.

90. La formulación de la reivindicación 89, que comprende un estabilizador.

91. La formulación de la reivindicación 84, que comprende manitol, polisorbato 80 y metionina.

92. La formulación de la reivindicación 84, en donde el sistema amortiguador adicionalmente comprende citrato o fosfato.

93. La formulación de la reivindicación 83 ó 84, en donde el pH de la formulación es de aproximadamente 5 o menos.

94. La formulación de la reivindicación 91, que comprende (a) 1.10% de manitol, (b) 0.001%-0.1% de polisorbato 80, (c) un sistema amortiguador que comprende de 1-100 mM de histidina y 10-50 mM de metionina, con un pH de 5 a 7.

95. La formulación de la reivindicación 91, que comprende (a) 6.2% de manitol, (b) 0.005-0.05% de polisorbato 80, (c) un sistema amortiguador que comprende de 5-50 mM de histidina y 5-20 mM de metionina, con un pH de 5 a 7.

96. La formulación de la reivindicación 91, que comprende (a) aproximadamente 4% de manitol, (b) 0.01% de polisorbato 80, (c) un sistema amortiguador que comprende aproximadamente 10 mM de histidina y aproximadamente 10 mM de metionina, con un pH de aproximadamente 6.

97. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 84-96, donde la molécula es un anticuerpo monoclonal, o porción de unión a antígeno del mismo.

98. La formulación de la reivindicación 97, en donde la concentración del anticuerpos, o porción de unión a antígeno del mismo, es de entre aproximadamente 1 y aproximadamente 250 mg/ml.

99. La formulación de la reivindicación 97, en donde la concentración de anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, está entre aproximadamente 40 y 200 mg/ml.

100. La formulación de la reivindicación 97, en donde la concentración de anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, es de aproximadamente 100 mg/ml.

101. La formulación de la reivindicación 97, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23.

102. La formulación de la reivindicación 101, en donde el anticuerpo humano es el anticuerpo J695, o una porción de unión a antígeno del mismo.

103. La formulación de la reivindicación 101 ó 102, que tiene una vida útil de por lo menos 24 meses.

104. La formulación de la reivindicación 101 ó 102, que mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

105. La formulación de la reivindicación 101 ó 102, que comprende un agente adicional.

106. La formulación de la reivindicación 105, en donde el agente adicional es un agente terapéutico.

107. La formulación de la reivindicación 106, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticoesteroide, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilato, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, un inhibidor de lipooxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, un antioxidante, un inhibidor de tromboxano, un antagonista del receptor IL-1, un anticuerpo monoclonal anti-IL-1 ß, un anticuerpo del receptor anti-IL-1, un anticuerpo monoclonal anti-IL-6, un anticuerpo del receptor anti-IL-6, un factor de crecimiento, un inhibidor de elastasa, un compuesto de piridinil-imidazol, un anticuerpo o agonista de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, y PDGF, un anticuerpo para CD2, CD3, CD4, CD8, CD20, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o ligando del mismo, metotrexato, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, NSAID, ibuprofeno, prednisolona, un inhibidor de fosfodiesterasa, un agonista de S1P1, un inhibidor de bcl-2, un agonista de adenosina, un agente anti-trombótico, un inhibidor de complemento, un agente adrenérgico, IRAK, NIK, IKK, p38, un inhibidor de MAP cinasa, inhibidor de enzima de conversión IL-1 ß , inhibidor de enzima de conversión de TNFa, un inhibidor de señalización de célula T, un inhibidor de metaloproteinasa, un inhibidor de enzima de conversión de angiotensina, un receptor de citocina soluble, receptor soluble de p55 TNF, receptor soluble de p75 TNF, slL-1RI, slL-1 Rl I, slL-6R, una citocina antiinflamatoria, IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, y ?T? .

108. La formulación de la reivindicación 106, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo anti-TNF y fragmentos de anticuerpo del mismo, un constructo de TNFR-lg, un inhibidor de TACE, un inhibidor de PDE4, un corticoesteroide, budenosida, dexametasona, sulfasaiazina, ácido 5-aminosalicílico, olsalazina, inhibidor de enzima de conversión de IL-?ß, IL-1ra, un inhibidor de tirosina cinasa, 6-mercaptopurina, y IL-11.

109. La formulación de la reivindicación 106, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste de metilprednisolona, ciclofosfamida, 4-aminopiridina, tizanidina, interferón-ß? a, interferón-ß? b, copolímero 1, oxígeno hiperbárico, inmunoglobulina intravenosa, cladribina, un inhibidor de TACE, un inhibidor de cinasa, SIL-13R, un anti-P7, y ligando de glicoproteína de selectina p (PSGL).

110. Una formulación estable que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que comprende una cadena ligera lambda en una solución amortiguada que comprende histidina con un pH de 5 a 7, en donde el metal está presente en una concentración que no da lugar a la segmentación de la cadena ligera lambda en presencia de histidina.

111. La formulación de la reivindicación 110, en donde la segmentación se produce en una región bisagra de la cadena lambda.

112. La formulación de la reivindicación 110, en donde el metal es Fe2+ y Fe3 + .

113. La formulación de la reivindicación 110, en donde el metal es Cu2+ o +Cu1.

114. La formulación de la reivindicación 110, en donde el metal está presente en una concentración seleccionada del grupo que consiste de menos de 5,060 ppb, menos de aproximadamente 1,060 ppb, menos de aproximadamente 560 ppb, menos de aproximadamente 310 ppb, menos de aproximadamente 160 ppb, menos de aproximadamente 110 ppb y menos de aproximadamente 70 ppb.

115. La formulación de la reivindicación 110, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 160 ppb.

116. La formulación de la reivindicación 110, en donde el metal está presente en una concentración de menos de 70 ppb.

117. La formulación de la reivindicación 110, que comprende por menos un excipiente adicional seleccionado del grupo que consiste de un poliol y un tensioactivo.

118. La formulación de la reivindicación 117, que comprende un estabilizador.

119. La formulación de la reivindicación 110, que comprende manitol, polisorbato 80 y metionina.

120. La formulación de la reivindicación 110, en donde la solución amortiguada que adicionalmente comprende fosfato o citrato.

121. La formulación de la reivindicación 110, en donde el pH es de aproximadamente 5 o menos.

122. La formulación de la reivindicación 110, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23.

123. La formulación de la reivindicación 122, en donde el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 a la que se une un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Y61 y J695.

124. La formulación de la reivindicación 123, en donde el anticuerpo humano es el anticuerpo J695, o una porción de unión a antígeno del mismo.

125. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 124, que tiene una vida útil de por lo menos 24 meses.

126. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 110 a 124, que mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

127. Una formulación farmacéutica acuosa que comprende (a) 1-250 mg/ml de un anticuerpo humano que se une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23, (b) 1-10% de manitol, (c) 0.001%-0.1% de polisorbato 80, (d) 10-50 mM de metionina, y (e) 100-100 mM de histidina, con un pH de 5 a 7, en donde la formulación está sustancialmente libre de metal.

128. La formulación de la reivindicación 127, en donde el metal está presente en una concentración seleccionada del grupo que consiste de menos de 5,060 ppb, menos de aproximadamente 1,060 ppb, menos de aproximadamente 560 ppb, menos de aproximadamente 310 ppb, menos de aproximadamente 160 ppb, menos de aproximadamente 110 ppb y menos de aproximadamente 70 ppb.

129. La formulación de la reivindicación 128, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 160 ppb.

130. La formulación de la reivindicación 128, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 70 ppb.

131. La formulación de la reivindicación 127, en donde el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 a la que se une un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Y61 y J695.

132. La formulación de la reivindicación 131, en donde el anticuerpo humano es el anticuerpo J695, o una porción de unión a antígeno del mismo.

133. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 127 a 132, que tiene una vida útil de por lo menos 24 meses.

134. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 127 a 132, que mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.

135. Una formulación farmacéutica acuosa que comprende (a) 100 mg/ml de un anticuerpo humano que se une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23, (b) aproximadamente 4% de manitol, (c) aproximadamente 0.01% de polisorbato 80, (d) aproximadamente 10 mM de metionina, y (e) aproximadamente 10 mM de histidina, con un pH de aproximadamente 6.

136. La formulación de la reivindicación 135, en donde el anticuerpo humano, o porción de unión a antígeno del mismo, se une a un epítopo de la subunidad p40 de IL-12/IL-23 a la que se une un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Y61 y J695.

137. La formulación de la reivindicación 136, en donde el anticuerpo humano es el anticuerpo J695, o una porción de unión a antígeno del mismo.

138. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 135 a 137, que está sustancialmente libre de metal.

139. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 135 a 137, que comprende un quelante de metal.

140. La formulación de la reivindicación 135, en donde el metal está presente en una concentración seleccionada del grupo que consiste de menos de aproximadamente 5,060 ppb, menos de aproximadamente 1,060 ppb, menos de aproximadamente 560 ppb, menos de aproximadamente 310 ppb, menos de aproximadamente 160 ppb, menos de aproximadamente 110 ppb y menos de aproximadamente 70 ppb.

141. La formulación de la reivindicación 140, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 160 ppb.

142. La formulación de la reivindicación 140, en donde el metal está presente en una concentración de menos de aproximadamente 70 ppb.

143. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 135 a 137, que tiene una vida útil de por lo menos 24 meses.

144. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 135 a 137, que mantiene la estabilidad después de por lo menos 5 ciclos de congelamiento/descongelamiento de la formulación.