MX2010008355A - Efecto de proteccion de alta dosis de folato en isquemia de miocardio. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de alta dosis de ácido fálico, o una dosis equivalente de uno de sus derivados activos biológicos para estabilizar disfunción de miocardio durante la isquemia y para aliviar lesión por post-reperfusión. La invención especialmente se refiere a un tratamiento temprano por la aplicación de una dosis alta de al menos 200mg de ácido fálico, o una dosis equivalente de un derivado durante isquemia activa, antes de la reperfusión.

Description

EFECTO DE PROTECCION DE ALTA DOSIS DE FOLATO EN ISQUEMIA DE MIOCARDIO Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de alta dosis de ácido fólico, o una dosis equivalente de uno de sus derivados activos biológicos para estabilizar la disfunción del miocardio durante la isquemia y para aliviar lesión post-reperfusión. La invención especialmente se refiere a un tratamiento temprano por la aplicación de una dosis alta de al menos 200 mg de ácido fólico, o una dosis equivalente de un derivado durante isquemia activa, antes de la reperfusión. Antecedentes de la Invención Durante la oclusión coronaria aguda, la perfusión del miocardio y el suministro de oxígeno se vuelven insuficientes para soportar la contracción muscular activa. En la zona isquémica, el contenido de fosfato de energía alta del miocardio cae, se eleve el fosfato inorgánico, y el tejido presenta acidosis (Jennings and Steenbergen, 1985) , resultando en discinesia regional y disfunción global. La reperfusión coronaria después de isquemia limita el daño de tejido pero confiere toxicidad de la activación de especies de oxigeno reactivo (ROS) , proteasas dependientes de calcio tal como calpaina, contractura de miofilamentos , disfunción microvascular, y citoquinas inflamatorias (Gross and Gross, REF.212787 2006) . El agotamiento. ATP durante la isquemia puede también contribuir a lesión por reperfusión (Gunduz. et al., 2006) . Además, las ROS generadas durante tanto isquemia (Klawitter et al., 2002) como reperfusión (Zweier and Talukder, 2006) se cree que juegan un papel central, y diversas estrategias antioxidantes se han probado para compensar este daño. Una forma para limitar el daño de isquemia/reperfusión es someter corazones a isquemia breve antes de exposición más prolongada, un fenómeno llamado pre-condicionamiento isquémico. Esto implica múltiples mecanismos que incluyen activación de proteína cinasa C (Yamamura et al., 2005), estimulación de canales mitocondriales KATP y síntesis de óxido nítrico mejorada (Jones and Bolli, 2006), con el último que juega un papel central. El tamaño del infarto después de isquemia-reperfusión es mayor en ratones deficientes de eNOS (Jones et al., 1999) pero reducido en ratones, con sobre-expresión de eNOS (Jones et al., 2004) . La síntesis de NO reducida y generación de ROS mejorada por NOS se producen cuando se convierten en funcional no acopladas por agotamiento/oxidación de su obligada tetrahidrobiopterina de cofactor (BH4) (Hevel and Marietta, 1992; Vasquez -Vivar et al., 1998) El papel potencial de NOS en lesión IR ha llevado a los esfuerzos para mejorar la función enzimática, que incluye administración de BH4 in vitro ( ajima et al., 2006) . Una alternativa mucho menos costosa puede ser el ácido fólico (FA) , una importante vitamina B para proteína mitocondrial normal y síntesis de ácido nucleico (Depeint et al., 2006) pero que también estabiliza BH4 al mejorar su afinidad de enlace a eNOS (Stroes et al., 2006; Hyndman et al., 2002) y mejora la regeneración BH4 de BH2 oxidado e inactivo. FA o su metabolito activo -5-metiltetrahidrofolato (5-MTHF)- mejora la función endotelial Verhaar et al., 1998; Shirodaria et al., 2007; Moat et al., 2006). Bajas dosis de FA se han probado en pacientes con enfermedades del sistema cardiovascular, pero estudios clínicos recientes que prueban la utilidad de FA para reducción de riesgo cardiovascular crónico han sido un tanto decepcionantes (Bazzano et al., 2006) y ciertamente no son concluyentes . De hecho, FA se ha estudiado en ensayos clínicos, particularmente para probar su potencial para reducir riesgo cardiovascular en pacientes con enfermedad vascular del miocardio. Por ejemplo, Oster (1981) demuestra que el tratamiento de ácido fólico a largo plazo (-10 años) en una dosis mucho más alta que la normalmente usada (40-80 mg/día) , reduce la incidencia de infarto de miocardio, angina de pecho y el requisito de la nitroglicerina en pacientes con enfermedad de las arterias coronarias. Esta observación no se confirmó por un ensayo controlado con placebo ni fue el mecanismo explorado. Otros estudios se centraron en la capacidad de FA para reducir homocisteina, y encontraron una disminución de 3 mol/l en homocisteina de suero (alcanzable con 0.8 mg/d) . A pesar de estos resultados positivos, meta-análisis de múltiples ensayos FA para usar en prevención cardiovascular han sido poco admirables (JAMA 2002; Wang et al., 2007; ald et al., 2006) y no está claro si la dosis, duración de estudio, población objetivo, u otros factores explican esto. Las dosis usadas en estudios antes de intervención cardiovascular (5-25mg/70kg/d) o ensayos de prevención (500 pg-l mg) son bajas, comparadas con la dosis de la invención. La WO0130352 describe una dosis de 30 - 500 mg de folato, preferiblemente 30 - lOOmg de folato para tratar hiperhomocistemia . Aunque la hiperhomocistemia se considera como un factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares, se desconoce el mecanismo de cómo los altos niveles de homocisteina podrían llevar a enfermedades cardiovasculares, y la aplicación no describe ningún efecto en enfermedades cardiovasculares como tal, especialmente no cuando el paciente no padece de hiperhomocistemia. La WO2006113389 describe un método para mejorar dilatación vascular que comprende administrar al sujeto una dosis alta (20 - lOOmg) de ácido fólico, y reclama que una dosis diaria de 20 - lOOmg puede retrasar o minimizar el desarrollo de una enfermedad del corazón simple. No hay indicación de que la disfunción del miocardio durante la isquemia se puede estabilizar, ni que la lesión por post-reperfusión se pueda aliviar por este tratamiento. Sorprendentemente se encontró que el pre-tratamiento de FA con alta dosis (al menos 200mg por sujeto) y/o tratamiento durante la isquemia antes de la reperfusión pueden aliviar la lesión IR y explora los mecanismos para tal efecto. Los datos muestran beneficios post-reperfusión pero más sorprendentemente revelan un efecto marcado y sorprendente de pre-tratamiento FA en reducción regional y disfunción de cámara y generación ROS durante el período de isquemia por sí mismo. Este beneficio parece ligado a alteraciones en catabolismo purino y conservación de niveles de fosfato de alta energía durante la isquemia. En este estudio se ha demostrado por primera vez que el pretratamiento con altas dosis de ácido fólico oral marcadamente reduce la severidad de disfunción isquémica durante oclusión coronaria, y mejora la función y disminuye el tamaño del infarto después de la reperfusión. Estos efectos se ligaron a fosfatos de alta energía conservados durante la isquemia a pesar de la reducción de flujo, mejorando la función global y regional, reduciendo necrosis y tensión oxidativa, y conservando acoplamiento eNOS sobre la reperfusión. Es poco usual la capacidad de pre-tratamiento FA para ayudar a mantener la contracción del miocardio a pesar del flujo coronario sustancialmente reducido, y muy diferente de la influencia de anti-oxidantes y agentes de preacondicionamiento clásicos. Estos típicamente tienen poco impacto durante la isquemia, pero benefician la post-reperfusión del corazón. Para esa materia, el beneficio de FA en reducir el tamaño del infarto aún si se suministra después de que la isquemia hubiera comenzado implica un mecanismo diferente . Breve Descripción de la Invención Un primer aspecto de la invención es el uso de un ácido fólico de dosis alta de al menos 200mg, preferiblemente al menos 600mg, aún más preferiblemente al menos lOOOmg o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico para estabilizar disfunción del miocardio durante la isquemia y/o para aliviar post-lesión por reperfusión. Los derivados de ácido fólico como se usan aquí se conocen por la persona experta en la técnica e incluyen, pero no se limitan a folato y 5-metiltetrahidrofolato. La disfunción del miocardio como se usa aquí incluye, pero no se limita a contracción del miocardio disminuida, muerte celular del miocardio y/o infarto inducido por arritmias. Una modalidad preferida es el uso de un ácido fólico de dosis alta o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico por lo Cual tal disfunción del miocardio es contracción del miocardio disminuida, otra modalidad preferida es el uso de un ácido fólico de dosis alta o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico por lo cual tal disfunción del miocardio es muerte celular del miocardio. Todavía otra modalidad preferida es el uso de un ácido fólico de dosis alta o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico por lo cual tal disfunción del miocardio es infarto inducido por arritmias. Preferiblemente la dosis alta se administra como una dosis sencilla. Aún más preferiblemente, la dosis se administra durante la isquemia, antes de la reperfusión. En una modalidad preferida, la administración es administración oral. En otra modalidad preferida, la dosis se administra por inyección intravenosa. Alternativamente, la dosis se puede administrar transdérmicamente , o por inyección intramuscular. Otro aspecto de la invención es el uso de un ácido fólico de dosis alta de al menos 200mg, preferiblemente al menos 600mg, aún más preferiblemente al menos 1000 mg, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico como un tratamiento temprano durante isquemia activa antes de la reperfusión. El tratamiento temprano como se usa aquí significa que el tratamiento se inicia después del inicio de la isquemia activa, pero antes de la reperfusión. Preferiblemente la dosis alta se administra como una dosis sencilla. Aún más preferiblemente, la dosis se administra durante la isquemia, antes de la reperfusión. En una modalidad preferida, la administración es administración oral. En otra modalidad preferida, la dosis se administra por inyección intravenosa. Alternativamente, la dosis se puede administrar transdérmicamente, o por inyección intramuscular. Todavía otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica, que comprende una dosis sencilla de al menos 600mg de ácido fólico, preferiblemente una dosis sencilla de al menos 1 000 mg de ácido fólico, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico, probablemente en combinación con un vector f rmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica, como se usa aquí, puede ser una composición líquida adecuada para inyección, o una composición sólida para ingesta oral . Todavía otro aspecto de la invención es el uso de ácido fólico o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico como un cardioprotector o agente terapéutico para mejorar o restaurar la disminución de niveles de fosfato de alta energía en trastornos cardiovasculares con niveles ATP/ADP disminuidos. Preferiblemente tal uso de ácido fólico es el uso de una dosis alta. Aún más preferiblemente, la dosis alta es al menos 200mg, más preferiblemente al menos 600mg. Mejorar como se usa aquí significa que el nivel de fosfato de energía alta se incrementa por el tratamiento, ya sea no al nivel normal en una persona saludable. Restaurar, como se usa aquí, significa que el nivel de fosfato de energía alta después del tratamiento es comparable a la de una persona saludable, o mayor. Breve Descripción de las Figuras Figuras lA(a)-lB: Función cardiaca medida por análisis de ciclo presión/volumen. Fig. lA(a)-lA(b) El ejemplo de ciclos presión-volumen en línea basal (1) , final de isquemia (2) , y reperfusión de 90 min (3) para un animal pre-tratado con placebo (Fig. lA(a)) y FA (Fig. lA(b)). El pre-tratamiento con FA mejora la función tanto durante la isquemia como después de la reperfusión. La Fig. IB - Resumen de la hemodinámica para el protocolo IR completo muestra el curso del tiempo para los parámetros sistólicos y diastólicos, (los valores p son de medidas repetidas ANOVA, interacción tiempo x tratamiento / efecto tratamiento) . Figuras 2A-2B: Ecocardiograma de pecho abierto. La Figura 2A muestra los ejemplos de ecocardiograma de modo M en línea basal y después de 30 min de isquemia en el grupo tratado con placebo y FA. La figura 2B muestra: Resumen de las parcelas muestra resultados obtenidos de estos ecocardiogramas contra el tiempo. La fracción de eyección y engrosamiento de pared del septo anterior disminuyó en el grupo de placebo pero fueron sin cambios en el grupo FA (valores p son para efecto de tratamiento por RMANOVA) . Figura 3: Análisis HPLC de parámetros de metabolismo de fosfato de energía alta (HEP) y estado de óxido-reducción. Bajo las condiciones de línea basal, el pre-tratamiento FA no altera HEP (ATP, ADP, AMP) , pero incrementó el monofosfato de inositol (IMP) y sus catabolitos (oxipurinas: xantina, hipoxantina y ácido úrico) . Después de 30 minutos de isquemia, los niveles de HEP se mantuvieron mejor en los corazones tratados con FA comparados con animales con placebo. Mientras las oxipurinas se incrementan marcadamente después de la isquemia en animales tratados con placebo, esto no se observó en las ratas tratadas con FA. Los valores P son de una ANOVA de 2 vías, con el primer valor que indica el efecto de isquemia, y el segundo la interacción entre grupo de tratamiento e isquemia. Figuras 4A-4E: Efecto de ácido fólico en necrosis del miocardio Fig. 4A] El pre- tratamiento de FA oral (7 días) reduce el tamaño del infarto in vivo (*: p<0.001; Mann-Whitney) . Panel superior: El área en riesgo (AAR) se comparó entre todos los grupos. Panel medio: tamaño del infarto, expresado como % AAR se redujo significativamente en todos los grupos FA. Panel inferior: gráfica de trama de la correlación individual entre necrosis del miocardio y AAR. Fig. 4B: El pre- tratamiento FA in vivo reduce la necrosis de banda de contracción (*p=0.001). Fig. 4C El pre-tratamiento FA in vivo reduce la apoptosis (coloración TUNEL) (*p=0.005 y p=0.001) . Fig. 4D El pre-tratamiento FA reduce necrosis del miocardio por -80% en corazones estudiados in vitro. (*: p< 0.0001) . Fig. 4E La deshidrogenasa de lactato mejorada (LDH) después de reperfusión por isquemia alcanzó un máximo en 10 -20', mientras que los corazones que recibieron pre-tratamiento FA tuvieron liberación LDH mínima. (p<0.001). Figuras 5A-5F: Efectos de tratamiento FA en generación ROS. Fig. 5A La detección de superóxido mejorado de lucigenina muestra marcada reducción de isquemia y superóxido inducido por IR con pre- tratamiento FA. Fig. 5B La formación de 02~ en corazones IR tratados con vehículo control se suprimió marcadamente por adición aguda de BH4, mientras que este se estabilizo por casi la mitad en extractos de miocardio obtenidos de corazones pre-tratados con FA. Fig. 5C, 5D DHE y Fig. 5E generación de ROS mejorada revela miocardio teñido DCF en isquemia o miocardio IR que se redujo sustancialmente en corazón que recibe pre- tratamiento FA. Fig. 5F Los efectos de antioxidante directo de FA comparados con Tempol . El superóxido se generó por xantina/oxidasa de xantina in vi tro, y se midió por quimioluminiscencia mejorada por lucigenina en concentraciones agregadas que varían de ya sea FA o tempol . Figuras 6A-6E: Efecto de pre- tratamiento FA en trayectoria NO Fig. 6A El gel SDS-Page muestra monómero de eNOS incrementado en miocardio IR que se redujo hacia niveles de control por pre-tratamiento FA. Fig. 6B Resumen de datos de densitometría de análisis de gel como se muestra en el panel A. El pre- tratamiento FA reduce la relación monómero/dímero, pero no tuvo efecto en expresión de proteína eNOS total. D] Bradicinina administrada a corazones in vitro antes contra después el IR mostró un descenso marcado en respuesta de flujo dependiente de endotelio. Esto se restauró a una respuesta normal al pre-tratar con FA. E] tratamiento FA no influyó la respuesta de flujo a nitroprusiato de sodio, apoyando que la disparidad observada con bradicinina fue dependiente de endotelio. Descripción Detallada de la Invención EJEMPLOS Materiales y Métodos para los ejemplos Comité de ética Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Instituto Nacional US de Salud (Publicación NIH, N° 85-23) y aprobado por los Comités de ética de la Universidad de Amberes y por las instituciones Médicas de Johns Hopkins . Modelo de isquemia in vivo Las ratas Wistar adultas recibieron FA (10 mg/día a menos que se establezca de otra manera) o placebo por sonda oral durante 7 días antes de realizar el experimento de isquemia/reperfusión (IR) . Un total de 131 ratas se usaron, el tamaño de muestra refleja el requisito para múltiples ensayos que no se podrían realizar en cada animal, pero se obtuvieron más en diferentes subgrupos del grupo total. Los animales se anestesiaron (pentobarbital 60 mg/kg) , intubaron por medio de traqueotomía, y ventilaron (Harvard Apparatus, MA) . El ECG se monitoreó y la temperatura se mantuvo a 37.5°C. La arteria anterior izquierda se expuso a través de el espacio intercostal de 4-5to y una sutura colocada alrededor de esto, y ligadura de arteria coronaria transitoria realizada durante 30 min con (n=85) o sin (n=46) reperfusión 90 min. En un subgrupo de animales con reperfusión (n=9) , FA se proporcionó 10 minutos después del inicio de la oclusión LAD (esto es, 20 minutos antes del inicio de reperfusión) , proporcionada como un bolo IV. He odiná ica in vivo La función LV se evaluó in vivo por ciclos presión-volumen (n=14) durante tanto la isquemia como después de la reperfusión. Un catéter de volumen-presión 1.4F (SciSense, London-Ontario, Canadá) se adelantó a través del ápice, colocado a lo largo del eje longitudinal, y enlazado a un estimulador/analizador (IOX 1.8.9.19, Emka Tech., París). Los datos de volumen se calibraron usando el método de solución salina hipertónica, asumiendo una ganancia = 1. Dos animales tuvieron dislocación de catéter durante la isquemia, y sus datos de volumen no se usaron. El movimiento de pared anterior del miocardio a pecho abierto también se midió usando un Sequoia-Acusón C256 equipado con transductor lineal de 15 MHz (Sistema de Ecocardiograma Sequoia C256, Acusón Corporation, ountain View, CA) en la vista paraesternal de la cámara de ventrículo izquierdo como se describió. Evaluación de óxido-reducción y Metabolismo de Energía Las muestras congeladas partidas (n=24) de la pared anterior (pre-tratamiento ±FA; isquemia ±30 min, sin reperfusión) se desproteinizaron y sometieron a análisis HPLC de compuestos de bajo peso molecular solubles en agua que reflejan tejido oxido-reductor y estado de energía. Los fosfatos de alta energía, oxipurinas (hipoxantina, xantina, y ácido úrico) , nucleósidos (inosina y adenosina) , malondialdehído, y glutationa reducida y oxidada se midieron por HPLC de emparejamiento de ion como se describe (Takimoto et al . , 2005) . Mediciones de flujo de miocardio El flujo de sangre del miocardio regional se evaluó (n=12) por microesferas activadas nucleares (diámetro 15µ?, BioPal, Worcester, A) inyectadas en la aurícula izquierda (0.3ml de esferas 2.5*10s /mi) en línea basal y después de 5 y 30 min de isquemia (Reinhardt et al., 2001). Las cuentas totales por minuto (cpm) se normalizaron para pesar y los resultados de la zona isquémica normalizados a la región remota para proporcionar flujo de sangre relativa antes y durante la isquemia. Modelo IR in vi tro Las ratas Wistar adultas (n=28) se anestesiaron (pentobarbital 60 mg/kg) , y los corazones rápidamente se extirparon y montaron sobre un sistema de perfusión retrograda (Emka, París, Francia) usando solución Krebs-Henseleit amortiguada oxigenada, entibiada en presión de perfusión constante (75 mmHg) . Los corazones se colocaron en 300 bpm, y mantuvieron en un estado no cargado. El flujo coronario se midió por una sonda de flujo ultrasónico en línea (Transonic Systems, Ithaca, NY, USA) . Después de 30 min de equilibrio, los fármacos vasodilatadores (bradicinina y nitroprusiato de sodio) se infundieron por inyección de bolos (50 µ?, 1CT8-10"5'5 M i.c.) y la reserva de flujo coronario se evalúa en presión de perfusión constante. Después de la línea basal de re-establecimiento, los corazones recibieron FA (4.5 10"6M i.c.) o vehículo durante 30 min. Más tarde los corazones se sometieron a flujo coronario cero 40 min seguido por 40 min de reperfusión. El efluente coronario se colectó, concentró (Sartorius-Sipan, Lier, Belgium) y analizó por deshidrogenasa de lactato (Vitros 950AT, O.C.D., Beerse, Belgium) . Las respuestas de vasodilatador coronario a los mismo dos agentes se repitieron después de la reperfusión. Análisis de tamaño de infarto e Histología El tamaño del infarto se evaluó en 31 ratas, con área en riesgo (AAR) determinada por tinción negativa con azul Evans inyectado durante la oclusión coronaria, y tinción posterior con TTC para detectar necrosis del miocardio. LV (pared libre + septo completo) , AAR (Azul de Evan neg) y área de necrosis (TTC-blanco) se midieron por planimetría (Sistema de Soft Imaging GmbH, Análisis pro versión 3.00), e imágenes digitalizadas sometidas a sustracción de fondo equivalente, brillo, y aumento de contraste para mejorar la claridad y nitidez. Para estudios in vitro, la tinción TTC no se procedió por tinción de azul de Evans ya que la isquemia global se creó. La necrosis de banda de contracción se evaluó en corazones de rata in vivo (n=22) fijados en solución Carnoy y se mancha con tricrómica de Masson. Los campos adyacentes en serie se examinaron en todo el LV complete para calcular el porcentaje de miocardio con bandas de contracción presentes. El análisis similar se realizó para positividad TUNEL (Chemicon Intern, Temecula, CA) , también expresado como área LV en por ciento. Determinación ROS El superóxido se evaluó por quimioluminiscencia mejorada de lucigenina (5µ?) (Beckman LS6000IC, n=23)22 y microtopografía fluorescente (diacetato de diclorodihidro-fluoresceina, DCF, n=16) y dihidroetidio, DHE, n=24) (Gupte et al., 2005). Los efectos de anti-oxidantes directos de ácido fólico se analizaron usando un sistema de oxidasa de xantina/xantina in vitro (Antoniades et al., 2006) y compararon con Tempol . Formación de monómero/dímero de eNOS y actividad enzimática Dímeros y monómeros de eNOS resistentes de SDS se probaron en tejido de isquemia/reperfusión (n=16) usando SDS-PAGE de temperatura baja como se describió previamente (Takimoto et al., 2005) la actividad enzimática NOS se evaluó por arginina para evaluar la conversión de citrulina de los extractos obtenidos de miocardio congelado (n=15) (Takimoto .et al. , 2005) . Análisis de datos Los datos se presentan como media ± sem con valores p <0.05 considerados estadísticamente importantes. La reserva de flujo coronario y datos hemodinámicos in vivo se analizaron por ANOVA de medidas repetidas . Otras comparaciones usadas ya sea de ANOVA de 1 vía o pruebas de Kruskal-^Wallis para comparar entre múltiples grupos independientes, con una corrección Bonferroni para múltiples comparaciones. Análisis utilizado SPS6 versión 11.0 (Chicago, IL) . Ejemplo 1: Pre-tratamiento de ácido fólico mejora la función cardiaca con I/R Las figuras lA(a)-lA(b) muestran relaciones PV del ejemplo y resumen de datos para función ventricular sistólica y diastólica en corazones con o sin pre-tratamiento FA (10mg/d) . Los datos se midieron en línea basal inicial en ratas de pecho abierto, durante 30 minutos de oclusión coronaria, y después de 90 minutos de reperfusión. Los corazones de control mostraron marcadamente función cardiaca reducida con un cambio hacia abajo hacia la derecha de los ciclos PV después de 30 min de oclusión LAD que se mantiene después de reperfusión (Fig. lA(a)). Con el pre-tratamiento FA, función sistólica y diastólica se conservó mejor durante periodos isquémicos y de reperfusión (Fig. lA(b)). El resumen de datos (Fig IB) soporta estos ejemplos. La presión LV máxima (esto es, presión arterial sistólica) cambia poco a pesar de la oclusión LAD en ratas pre-tratadas con FA pero cae en casi 25% en los controles. Las disparidades similares se observaron en dP/dt„,ax. El gasto cardiaco y el trabajo sistólico también disminuyen menos en animales pretratados con FA, particularmente en isquemia tardía y reperfusión. Así, la función cardiaca se mejoró duramte el periodo isquémico y después de la reperfusión por pre- ratamiento con FA. La conservación relativa de función global durante la isquemia fue algo sorprendente, y sugiere disfunción regional a pesar de la oclusión coronaria en corazones pre-tratados con FA. Para probar esto, se realizó un ecocardiograma de pecho abierto para medir engrosamiento de la pared y curso de tiempo de disfunción durante los 30 minutos de oclusión de LAD (Figs 2A-2B) . El ejemplo de trazados de modo M (Fig. 2A) muestra marcada reducción de engrosamiento de la pared anterior durante la isquemia en controles pero conserva engrosamiento en animales tratados con FA. La fracción de eyección fue mucho mayor a pesar de isquemia (72.8±1.2% vs. placebo: 27.4±2.2%, p<0.001 en 30 min) , consistente con los resultados de ciclo PV, al igual que engrosamiento del septo anterior (37. ± 5.3% vs . placebo 5.1 ±0.6%, p=0.004) . Así, pre- tratamiento de FA mejora la disfunción regional en la zona isquémica a pesar de la oclusión coronaria, y esto persistió o se mejoró además después de la reperfusión. Ejemplo 2: Ácido fólico y flujo de miocardio Ya que el pre- tratamiento de FA mejoró tanto la función regional como global durante la oclusión de LAD, se probó si esto mejoró el flujo sanguíneo de miocardio para reducir el traumatismoisquémico per se. Sin embargo, después de 5 min de ligadura LAD, la relación de perfusión de zona isquémica/remota del miocardio obtenida por análisis de microesfera disminuyó similarmente en ambos grupos de placebo y pre-tratados con FA (-73.7±6.0% y -77.7±5.l%, respectivamente) . El flujo se mantiene bajo en ambos grupos en 30 minutos (-78.4+9.3% vs . placebo -71.2±13.8% comparado con la región remota) . Ejemplo 3: Ácido fólico conserva niveles de miocardio de fosfatos de energía alta Ya que la perfusión mejorada no pudo explicar el efecto de tratamiento con FA, se probó después si FA altera el metabolismo de fosfato de energía alta (HEP) en línea basal y en particular durante la isquemia. Como se muestra en la Figura 3, el pretratamiento con FA no altera HEP en línea basal, pero niveles elevados de monofosfato de inositol (IMP) y sus catabolitos (oxipurinas: xantina, hipoxantina, ácido úrico) . Durante la isquemia, ATP de miocardio y ADP disminuye más de 66% en controles, consistente con los cambios reportados1. Sin embargo, ambos se mantuvieron en los niveles superiores en corazones pre-tratados con FA, (p<0.001 para interacción de tratamiento de FA y respuesta isquémica) . Las oxipurinas se incrementan marcadamente durante la isquemia en controles, consistente con HEP reducido y catabolismo AMP mejorado; sin embargo, cambiaron poco o disminuyeron en corazones tratados con FA. Por último, se examine el estado de óxido-reducción como incluido en un índice por malondialdehído (un marcador de peroxidación de lípido) y relación relativa de glutationa reducida/oxidada. Ambas se cambiaron poco por pre-tratamiento de FA con o sin isquemia de miocardio. Ejemplo 4; El pre-tratamiento de ácido fólico reduce el tamaño del infarto de miocardio Una consecuencia potencial de mejorar tanto la función como el metabolismo HEP durante la isquemia es que el tamaño del infarto posterior se reduce. Como se muestra en la Fig 4A, el tamaño del infarto fue 60.3+4.1% el área de riesgo en animales tratados con placebo contra 3.8+1.2% con pre- tratamiento de FA (p<0.002) . En estudios separados, se encontró esta disminución en tamaño del infarto presentado con pre-tratamiento por 40% y aún 10% de la dosis de FA principal (esto es, 1 y 4 mg/d) . La necrosis de banda de contracción de reperfusión se observó a través de 26.7±2.6% del LV en corazones tratados con vehículo, pero 4.6% + 1.2% en corazones tratados con FA (p=0.001, Fig. 4B) . Similarmente, los miocitos positivos de TUNEL fueron comunes (63.0+5.8% de campos LV) con tratamiento con vehículo, pero poco comunes (4.3±1.3%) con tratamiento con FA (p=0.001, Fig 4C) . La isquemia provocó arritmia ventricular letal en 36.7% de ratas de control (vs 8.3% tratadas con FA) , mientras que la arritmia por reperfusión se presentó en 6.1% de los animales de controles y no tratados con FA (p<0.01 para ambos) . Ya que el tamaño del infarto posterior a la reperfusión in vivo se relaciona parcialmente para acoplamiento de la función con perfusión coronaria, se probó también el impacto de pretratamiento con FA en corazones aislados. El FA reduce el tamaño del infarto marcadamente (7.7+2.8% vs . 41.1 + 4.9%, respectivamente, p < 0.0001, Fig. 4D) , y había menos deshidrogenasa de lactato en el efluente coronario (Fig. 4E) , consistente con necrosis celular reducida. Ejemplo 5: Pre-tratamiento de folato vs. administración, aguda de folato En un conjunto separado de 9 animales, FA se administró después de 10 de oclusión coronaria (10 mg i.v.), el tiempo en el cual aparecieron respuestas funcionales para primero divergir (c.f. Figs lA(a)-lB, 2B) . Es interesante, los beneficios similares en reducir el tamaño del infarto relativo a AAR (n=5; 3.0±2.2%, p<0.001 vs . placebo) se observaron, mientras AAR fue similar por sí mismo a placebo (52.4+5.5%). La histología se realizó en 4 de los animales y mostró tinción de TUNEL reducida (4.3+1.3% LV, p<0.0001 vs . placebo) y necrosis de banda de contracción (5.1 +0.7% LV, p<0.001 vs . placebo). Así, el efecto de FA en reducción de infarto no parece ser un efecto clásico de pre-acondicionamiento clásico, ya que se podría generar por administración de Fa después de que había comenzado la isquemia . Ejemplo 6s Pre-tratamiento de folato reduce generación de ROS El superóxido de miocardio (quimioluminiscencia de lucigenina) disminuye casi 50% en animales pre-tratados con FA durante la isquemia y después de 90 minutos de reperfusión (Fig 5A) . Cuando los extractos se pre-encubaron con 100 µ? de BH4 , la generación de 02~ disminuyó por 90.9+0.7% en corazones tratados con vehículo, pero no tanto en corazones pre-tratados con FA (52.1 +11.3%, p<0.03, Fig 5B) . Esto sugirió que una trayectoria de anti -oxidante dirigida por BH4 (por ejemplo, acoplamiento NOS) fue cualquiera que carecía en corazones pre-tratados con FA o ya mejorado por terapia de FA. El efecto de FA en la isquemia y ROS inducido por IR se examinó además por microtopografía fluorescente oxidativa. Ambos cortes de miocardio teñidos con DHE y DCF muestran marcada generación ROS en el grupo de placebo que se redujo con pre-tratamiento de FA. Las Figs. 5C-5E muestra imágenes de ejemplo, los datos medios se obtuvieron en n=4 para cada grupo y es consistente con estos ejemplos. Para probar los potenciales efectos de anti-oxidante directos de FA, se realizó un ensayo in vitro usando un sistema de generación de 02" de oxidasa de xantina/xantina (Fig 5F) . El FA tuvo efectos antioxidantes sustanciales en este ensayo, similares a los del Tempo mimético de superóxido dismutasa. Ejemplo 7: El pre-tratamiento de folato implica actividad y dimerización de eNOS, y función endotelial Dado que el FA y su metabolito activo 5-MTHF se ligan mecánicamente a la mejora mediada por BH4 en función NOS, que incluye reducción en superóxido derivado de NOS, se examinó si el FA influencia el acoplamiento NOS en corazones I/R. La Figura 6A muestra inmunotransferencias de ejemplo para eNOS con bandas de monómero (140 kDa) y dímero (280 kDa) . El eNOS total (suma de ambos) fue similar entre las condiciones diferentes (Fig 6B) , sin embargo la relación de dímero/monómero disminuyó en corazones IR tratados con vehículo que reflejan desacoplamiento NOS (p< 0.001, Fig 6C) , aún fue casi normal en corazones pre-tratados con FA. La actividad NOS, medida por conversión de arginina-citrulina fue, sin embargo límite, sin mejorar significativamente en los corazones tratados vs . no tratados (p=0.08, no se muestra) . La función endotelial coronaria también mejora por pre-tratamiento con FA. La bradicinina induce un aumento máximo 108.3+9.2% en flujo coronario en corazones de control aislados, pero solamente 67.1+8.1% después de IR, (p<0.001 Fig 6D) . Esto se restauró a niveles de control en corazones pre-tratados con FA (122.0±11.3%) , sin ningún cambio en dilatación basal . No hubo cambios en el flujo coronario en línea basal (placebo: 10.2±0.7 ml/min, FA: 11.4+13.8 ml/min, p=0.5) o después de isquemia (placebo: 9.8+0.7 ml/min y FA: 8.9+1.4 ml/min, p=0.5) entre grupos. En contraste a la estimulación de bradicinina, el flujo coronario incrementó similarmente en condiciones de control y condiciones isquémicas con nitroprusiato de sodio (Fig 6E) , suportando dependencia de endotelio del efecto anterior. 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Claims (10)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. El uso de un ácido folico de dosis alta de al menos 200 mg, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico para estabilizar disfunción de miocardio durante la isquemia y para aliviar lesión por post-reperfusión.

2. El uso de un ácido fólico de dosis alta de al menos 200mg, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico de conformidad con la reivindicación 1, donde tal disfunción del miocardio es contracción del miocardio disminuida.

3. El uso de un ácido fólico de dosis alta de al menos 200mg, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico de conformidad con la reivindicación 1, donde tal disfunción del miocardio es muerte celular del miocardio.

4. El uso de un ácido fólico de dosis alta de al menos 200mg, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico de conformidad con la reivindicación 1, donde tal disfunción del miocardio es arritmia inducidas por infarto.

5. El uso de un ácido fólico de dosis alta de al menos 200mg, o una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico como un tratamiento temprano durante isquemia activa antes de la reperfusión.

6. El uso de conformidad con la reivindicación 1-5, donde la dosis alta es al menos 600mg.

7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1-6, donde la dosis alta se administra oralmente.

8. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde la administración de tal dosis es intramuscular, intravenosa o transdérmica .

9. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una dosis sencilla de al menos 600mg de ácido fólico, de una dosis equivalente de un derivado de ácido fólico, probablemente en combinación con un vector farmacéuticamente aceptable.

10. El uso de ácido fólico como un cardioprotector o agente terapéutico para mejorar o restaurar la disminución de niveles de fosfato de alta energía en trastornos cardiovasculares con disminución de niveles de ATP/ADP.