MX2008000919A

MX2008000919A - Plexin d1 como objetivo para diagnostico y terapia de tumor

Info

Publication number: MX2008000919A
Application number: MXMX/A/2008/000919A
Authority: MX
Inventors: Petrus Johannes Leenders Wilhelmus; Roodink Ilse; Maria Hendrik Raats Josef
Original assignee: Petrus Johannes Leenders Wilhelmus; Raats Jozef Maria Hendrik; Roodink Ilse; Stichting Katholieke Universiteit
Priority date: 2005-07-21
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2008-10-03

Abstract

La presente invención se refiere a plexin D1 para utilizarse como una proteína dirigible en el tratamiento o diagnóstico de trastornos que implican la expresión de plexin D1. El diagnóstico se lleva a cabo en forma adecuada detectando la presencia de plexin D1 en el cuerpo o un tejido o fluido o corporal, en tanto que el tratamiento se lleva a cabo dirigiendo plexin D1 para el suministro de terapéuticos al sitio cuando se necesita tratamiento. La presente invención se refiere además al uso de moléculas que enlazan plexin D1, unácido nucleico que codifica plexin D1 o un ligando de plexin D1 para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento o diagnóstico de trastornos que implican la expresión de plexin D1. Los trastornos comprenden trastornos en los cuales plexin D1 se expresa en células de tumor, vasos sanguíneos de tumor o macrófagos activados.

Description

PLEXIN D1 COMO OBJETIVO PARA DIAGNÓSTICO Y TERAPIA DE TUMOR Campo de la Invención La presente invención se refiere a la identificación de una proteína dirigible novedosa que se puede utilizar en el tratamiento y diagnóstico de tumores, en particular tumores sólidos, y a trastornos que implican inflamación, en particular artritis reumatoide, ateroesclerosis y esclerosis múltiple. Antecedentes de la Invención Para crecer a un tamaño más allá de 2-3 mm3, los tumores tienen que reclutar una neovasculatura mediante angiogénesis. Los tumores logran esto mediante la expresión del Factor-A de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF-A), ya sea inducido por hipoxia en el centro del tumor o como resultado de un mal funcionamiento de los productos del gen supresor de tumores o proto-oncógenos activados. Un número de compuestos que dirigen la trayectoria de señalización VEGF-A, han sido desarrollados con el objeto de inhibir la angiogénesis, y en consecuencia, el crecimiento de tumor. Aunque dichas terapias anti-angiogénicas han sido efectivas en modelos de tumor animales, la traducción a nivel clínico ha sido probado como menos exitoso (Eichhorn, ME y asociados, Drug Resist Update 7: 125-138 (2004)). Por esto, existe un número de posibles explicaciones. En situaciones clínicamente relevantes, los tumores en haber crecido durante meses o incluso años al momento del diagnóstico, y una proporción significativa de la vasculatura puede estar más o menos madura y por lo tanto insensible a inhibición con angiogénesis. Esta situación es un contraste difícil con la de la mayoría de los modelos animales, en los cuales, como regla, se estudian tumores agresivos de crecimiento rápido. Además, los pacientes que son candidatos para terapia anti-angiogénica normalmente son pacientes con cáncer diseminado, no controlado y el crecimiento de metástasis no siempre puede ser estrictamente dependiente de la angiogénesis. Debido a que la mayor parte de las metástasis nacen en la sangre, crecen en órganos con densidades de vasos intrínsicamente altas tipo hígado, pulmón y cerebro en donde pueden crecer en un modo independiente de la angiogénesis mediante la opción conjunta de los vasos existentes previamente. De hecho, un inhibidor de angiogénesis que inhibe en forma muy efectiva el crecimiento de tumor en un número de modelos de tumor subcutáneos (Wedge, SR y asociados, Cáncer Res 62: 4645-4655 (2002)) no inhibe el crecimiento de tumores de infiltración en cerebro de ratón. Además, al momento de tratamiento de ratones que llevan tumores de cerebro altamente angiogénicos, la inhibición de angiogénesis no da como resultado un obstáculo para el progreso adicional del tumor, sino más bien en un progreso después de un cambio fenotípico hacia la opción conjunta e infiltración (Leenders, WP y asociados, Clin Cáncer Res 10: 6222-6230 (2004)). Estos resultados implican que la terapia anti-angiogénica debe ser suplementada mediante terapias de dirección vascular en las cuales la cama vascular del tumor existente es atacada, dando como resultado una muerte de cerebro de tumor secundaria debido a la interrupción del suministro sanguíneo del tumor. Para lograr una terapia de dirección vascular efectiva, se tienen que identificar marcadores que tengan especificidad para la vasculatura del tumor. Se ha puesto mucho esfuerzo en esto, pero con un éxito diverso. La dirección de tumor vascular efectiva ha sido lograda utilizando anticuerpos de cadena simple, dirigidos contra el dominio ED-B de fibronectina, el cual es expresado en forma electiva y depositado en la matriz extracelular de los vasos recientemente formados en tumores angiogénicos (Santimaria, y asociados, Clin Cáncer Res 9: 571-579 (2003)). La dirección de av 3-integrina (cuya expresión se restringe a vasos inmaduros) utilizando péptidos RGD o Vitaxin, produjo resultados decepcionantes, en tanto que la expresión-endoglina no fue específica para vasos sanguíneos de tumor (Posey, JA y asociados, Cáncer Biother Radiopharm 16: 125-132 (2001); Balza, E y asociados, Int J Cáncer 94: 579-585 (2001)). En enfermedades inflamatorias, tal como artritis reumatoide (RA) o ateroesclerosis, la angiogénesis y activación de la vasculatura con frecuencia también es parte de la patología. La vasculatura aquí pavimenta el camino para que las células inflamatorias se extravasen y ejerzan su acción destructiva. Por lo tanto dichas enfermedades se pueden beneficiar de la dirección a vasos sanguíneos. Breve Descripción de la invención Por consiguiente el objeto de la presente invención es proporcionar una nueva proteína dirigible que pueda ser utilizada en el tratamiento y diagnóstico de cáncer y enfermedades inflamatorias o enfermedades que impliquen inflamación. En la investigación que condujo a la presente invención, se descubrió que plexin D1 se expresa en la parte luminal de las células endoteliales en vasos sanguíneos de tumor, en las propias células de tumor y en macrófagos activados que se encuentran en tumores, en inflamación y en placas ateroescleróticas. La presente invención se refiere por lo tanto a plexin D1 para utilizarse como una proteína dirigida en el tratamiento de diagnóstico de trastornos que implican expresión de plexin D1.

La familia de receptores de plexin consiste en cuatro clases (PLXNA-D) y nueve miembros en mamíferos. Las plexinas comprenden una familia de proteínas de membrana de paso simple, grandes con homología para dispersar receptores de factor, codificados por la familia del gen MET. Los miembros de la familia de plexin comparten dominios Sema, secuencias relacionadas-Met (MRS), una región de transmembrana y motivos intracelulares que son predictivos de la señalización Rac/Rho-GTPase (figura 1). Ya que la señalización mediante GTPase da como resultado en reajustes citoesqueletales, eventos que están implicados de manera importante en la formación de filopodia y lamelipodia y migración celular, las plexinas pueden ser consideradas como reguladores de la migración. Las plexinas son receptores de las semaforinas, una familia de proteínas de transmembrana o ancladas-GPI, segregadas las cuales se subdividen en siete subclases. Cada plexina tiene sus propias (establecidas) parte de enlace de semaforina, y cada combinación de plexina-semaforina da como resultado una respuesta específica. Las semaforinas clase 3 son potentes repulsores de axones y por lo tanto están implicados en morfogénesis del sistema nervioso (para una revisión, consultar las publicaciones de (Pasterkamp, RJ y asociados, Curr Opin Neurobiol 13: 79-89 (2003); Fujisawa, H, J Neurobiol 59: 24-33 (2004)). Para la activación de plexinas mediante semaforinas, se pueden requerir partes de enlace de plexina adicionales. Estas partes de enlace, neuropilin-1 y -2 (NP-1 y NP-2) no tienen motivos de señalización en el dominio intracelular y se consideran como co-receptores pasivos, permitiendo la interacción entre semaforinas y plexinas. Algunas plexinas forman complejos de membrana aún más grandes con, y receptores de señalización activos de Off Track (Otk) y los receptores de factor de dispersión Met y Ron. Una interacción directa entre plexinAl y el receptor-2 de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular angiogénico (VEGFR2) también han sido demostrados (Toyofuku, T y asociados, E-plublication in Genes Dev 18: 435-447 (2004)). Debido a que NP-1 se enlaza a los miembros de la familia de plexina pero también a VEGFR2, es concebible que existan complejos de proteína de membrana de componentes múltiples que comprendan VEGFR2, NP-1 y plexinas, estableciendo un enlace entre plexinas y angiogénesis (ver también la publicación de Weinstein, BM, Cell, 120: 299-302 (2005)). Las neuropilinas también son co-receptores para el potente factor angiogénico Factor-A de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF-A165) y aumentan su afinidad con VEGFR2. De manera importante, el sitio de enlace VEGF-A165 en NP-1 traslapa con el de semaforina 3A (Miao, H Q y asociados, J Cell Biol 164: 233-242 (1999)). Se ha postulado que el enlace de VEGF-A a NP-1 promueve la migración de células endoteliales compitiendo en el enlace de semaforinas clase 3, lo cual generalmente está seguido de una despolimerización de actina-F y repulsión de extensiones celulares (Bachelder, RE, Cáncer Res 63: 5230-5233 (2003)). El comportamiento antagónico similar de VEGF-A y semaforinas clase 3 ha sido descrito en una línea de célula progenitora neuronal (Bagnard, D y asociados, J Neurosci 21: 3332-3341 (2001)) y células de tumor (Bachelder (2003), supra). Ya que se observaron efectos antagónicos en células de tumor que están desprovistas de receptores VEGF, es concebible que el mecanismo subyacente implica miembros de la familia de plexina, estableciendo un enlace adicional entre plexinas y señalización VEGF-A. Los inventores de la presente invención han encontrado previamente que el miembro de la familia de plexin D1 (plxnD1) no únicamente se expresa en células neuronales sino también en células endoteliales de la vasculatura durante etapas tempranas del desarrollo (van der Zwaag, B y asociados, Dev Dyn 225: 336-343 (2002)), y fue una observación que se confirmó mediante otros dos grupos (Gitler, AD y asociados, Dev Cell 7: 107-116 (2004); Torres-Vázquez, J y asociados, Dev Cell 7: 117-123 (2004)). En vasculatura de adultos, está ausente plxnD1. Los ratones de eliminación- plxndl y peces cebra que llevan mutaciones en el gen plxndl, están caracterizados por un mal desarrollo del sistema cardiovascular (Gitler, Ad, y asociados, (2004), supra: Torres-Vázquez, J y asociados,(2004), supra). Los ratones con eliminación doble de Neuropilin-1 (NP-1) y NP-1 /Neuropilin-2 (NP-2) también padecen de defectos letales en malformación de vascularización y arco aórtico durante el desarrollo embriónico (Kawasaki, T y asociados, Development 126: 4895-4902 (1999); Takashima, S y asociados, Proc Nati Acad Sci EUA 99: 3657-3662 (2002); Gu, C y asociados, Dev Cell 5: 45-57 (2003)). Además, la eliminación transmitida por morfolina de NP-1 en pez cebra conduce a un mal desarrollo de los vasos intersegmentales, y en este sistema modelo un enlace claro entre NP-1 y VEGF-A165 ha sido establecido (Lee, P y asociados, Proc Nati Acad Sci EUA 99: 10470-10475 (2002)). La resemblanza de fenotipos de ratones de eliminación plxndl, neuropilin-1 y semaforina 3C (Feiner, L y asociados, Development 128: 3061-3070 (2001)) es consistente con el descubrimiento de que Plexin D1 es un receptor dependiente de neuropilin-1 de semaforin 3C (Gitler, AD y asociados (2004), supra). Sin embargo, PIxnDI también es un receptor de semaforin 3E, y esta interacción no requiere neuropilinas de señalización transmitida por Semaforin 3E (Gu, C y asociados, Science 307: 265-268 (2005)). De acuerdo con la presente invención, se descubrió que plexin D1 también está implicada en angiogénesis durante crecimiento de tumor y se expresa en la parte luminal de células endoteliales en vasos sanguíneos de tumor. Además se descubrió que plexin D1 es expresada por macrófagos activados. Plexin D1 también se encontró como expresada en células de tumor en una amplia variedad de tipos de tumor. La presente invención se refiere por lo tanto a plexin D1 para utilizarse como una proteína dirigida en el tratamiento o diagnóstico de trastornos que implican expresión de plexin D1.

El diagnóstico se lleva a cabo detectando la presencia de plexin D1 o un ácido nucleico que codifica plexin D1 en el cuerpo o un tejido o fluido corporal. El tratamiento se lleva a cabo dirigiendo plexin D1 para el suministro terapéutico al sitio, cuando el tratamiento es necesario, interfiriendo en la interacción entre plexin D1 y sus ligandos, interfiriendo en expresión del gen plexin D1 o capturando los ligandos plexin D1 para inhibir la interacción con plexin D1. La presente invención se refiere en forma adicional por lo tanto, al uso de moléculas que enlazan plexin D1, un ácido nucleico que codifica plexin D1 o un ligando de plexin D1 para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento o diagnóstico de trastornos que implican la expresión de plexin D1. Todas estas moléculas serán identificadas en la presente invención como "moléculas de enlace" o "entidades de enlace". Los trastornos comprenden en particular trastornos en los cuales plexin D1 se expresan células de tumor, vasos sanguíneos de tumor o macrófagos activados. Las células de tumor en las cuales se expresa plexin D1 comprenden tumores cerebrales, en particular astrocitomas, oligodendrogliomas y hemangioblastomas, carcinomas de colon, en particular carcinomas ductales del colon, carcinomas de próstata, carcinomas de célula renal, en particular carcinomas de célula clara renal, carcinomas de mama, en particular carcinomas de seno ductal, carcinomas de ovario, carcinomas de célula escamosa, melanomas, carcinomas de pulmón, en particular carcinomas de pulmón de célula pequeña y carcinomas de pulmón de célula no pequeña, sarcomas de tejido suave, etc. Cuando los trastornos que se tratan de acuerdo con la presente invención son enfermedades inflamatorias, son en particular enfermedades autoinmune, más en particular artritis reumatoide, o son ateroesclerosis o esclerosis múltiple. Las moléculas que enlazan plexin D1 son por ejemplo, seleccionadas de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, proteínas, dominios de proteínas, péptidos, moléculas pequeñas. Estas moléculas se pueden utilizar para dirigir plexin. Las moléculas que enlazan al ácido nucleico que codifica plexin D1 son por ejemplo, oligonucleótidos, tales como aptameros de ARN o ADN, por ejemplo, seleccionados de siARN, ARN antisentido, fosfotio-oligonucleótidos antisentido. Estas moléculas se pueden utilizar para interferir con la expresión de plexin D1. Las moléculas que enlazan al ligando plexin D1 son por ejemplo, seleccionadas de anticuerpos contra ligandos, electodominío soluble de plexin D1 o moléculas pequeñas, tales como péptidos, que enlazan ligandos plexin D1. Estas moléculas se pueden utilizar para capturar el ligando plexin D1 en la circulación, evitar el enlace del ligando a plexin D1 en células de vasos de tumor, células de tumor o macrófagos activados e interferir con la función de plexin D1 en estas células. Para diagnóstico, la molécula de enlace se etiqueta en forma adecuada con un marcador detectable. Dicho marcador detectable es por ejemplo, seleccionado de una etiqueta de abertura, etiqueta paramagnética, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimiluminiscente. El diagnóstico se puede llevar a cabo en una muestra de un fluido o tejido corporal in vivo, in situ o ex vivo. Los ejemplos de técnicas de diagnóstico son hibridación in situ de por ejemplo, mARN de plexin D1 o inmunohistoquímica en biopsias o células de tumor. Para tratamiento, la molécula de enlace es por ejemplo, abastecida con una entidad que daña o extermina la célula de tumor y/o la célula endotelial de tumor, en particular una entidad citotóxica, tal como un radionuclido, una toxina, un boro de Terapia de Captura de Neutrones de Boro (BNCT), o un profármaco que está acoplado a la entidad de enlace a través de un enlazador disociable, el cual es activado en respuesta a disociación de dicho enlazador, o péptidos que inducen a apoptosis, un ejemplo de los cuales es la secuencia (KLAKLAK)2. Dichos péptidos se agregan a la entidad de enlace mediante técnicas de ingeniería genética molecular. Las entidades descritas anteriormente pueden ser conjugadas directamente a la entidad de enlace, o pueden presentarse en nanoaparatos, tales como liposomas o polimersomas, que se conjugan a la entidad de enlace. La Terapia de Captura de Neutrones de Boro (BNCT) comprende irradiación de un área en forma, tal como un tumor o una inflamación, en donde el boro se ha acumulado después de la inyección intravenosa del conjugado liposomal, con neutrones, después de lo cual los átomos de boro decaerán al litio bajo la emisión de partículas alfa destructivas. Como alternativa, la terapia se puede llevar a cabo induciendo trombosis local en los vasos del tumor para bloquear el suministro sanguíneo al tumor, e inducir la muerte, cerebral. Un ejemplo de dicha molécula es el Factor de Tejido (TF). En forma conveniente, plexin D1 puede ser dirigida con moléculas de enlace específicas en administración intravenosa, ya que plexin D1 se expresa en la parte luminal de las células endoteliales en vasos de sangre de tumor. Los compuestos terapéuticos para dañar o exterminar células de tumor que se acoplan a la molécula de enlace pueden alcanzar el tumor desde dentro y los compuestos que inducen la trombosis son fácilmente suministrados a su sitio de acción. La interferencia con la función plexin D1 representa una forma de inhibir la angiogénesis, para inhibir la migración de célula de tumor, e inhibir la migración de macrófagos. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para tratar o suprimir trastornos en los cuales está implicado plexin D1, utilizando la presencia específica de plexin D1 para suministrar (ocalmente terapéuticos a tejidos enfermos y/o mediante la interferencia en la función de plexin D1 o en interacción entre plexin D1 y sus ligandos. Descripción Detallada de la Invención La presente invención está basada por lo tanto en el hecho de que plexin D1 se puede utilizar como un marcador dirigible en vasos sanguíneos de tumor, como una proteína dirigible implicada en angiogénesis de tumor, como un marcador dirigible en células de tumor y una proteína dirigible implicada en migración celular. La presente invención se refiere también por lo tanto al uso de moléculas que enlazan a plexin D1, su gen o mARN o sus ligandos en diagnósticos y terapia. Todos los tipos de moléculas de enlace específico y derivados de los mismos se pueden utilizar en la presente invención, en particular compuestos proteínaceos, tales como, pero sin limitarse a, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos de dominio simple, otros dominios de enlace proteínaceos, tale como, pero sin limitarse a, lipocalinas y moléculas pequeñas que enlazan en forma específica plexin D1 o sus ligandos. Para enlazar al gen plexin D1 o mARN transcrito del gen plexin D1, se pueden utilizar moléculas de ácido nucleico, tales como aptameros ADN o ARN. En una primera modalidad de la presente invención, plexin D1 o moléculas de enlace de ligando plexin D1 son anticuerpos, en particular anticuerpos monoclonales, o más en particular anticuerpos humanos o humanizados particulares en los cuales las regiones constantes del anticuerpo original son substituidas con las regiones constantes de anticuerpos humanos, o fragmentos de los mismos los cuales aún enlazan a plexin D1 o su ligando. El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo lgG1 humano. Sin embargo, otros isotipos de anticuerpos humanos también están comprendidos en la presente invención, incluyendo lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgAsec, IgD e IgE. También todos los anticuerpos derivados de animales de varios isotipos se pueden utilizar en la presente invención. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de tamaño completo o fragmentos de enlace de antígenos de anticuerpos, incluyendo Fab, F(ab')2, fragmentos Fv de cadena simple o VHH de dominio simple, VH o dominios simples VL. Preferentemente, los anticuerpos contra plexin D1 son anticuerpos monoclonales humanos producidos por una célula de hibridoma la cual incluye una célula B obtenida de un animal transgénico inmunizado que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada humana y un transgen de cadena ligera humana, fusionadas a una célula inmortalizada, o un anticuerpo derivado de animal o un fragmento de anticuerpo producido por una célula de hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal inmunizado, fusionado a una célula inmortalizada, o anticuerpos humanos y animales, producidos por una célula eucariótica transfectada con el cADN o ADN genómico que codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una modalidad preferida de la presente invención, los anticuerpos Llama de dominio simple (VHH) con afinidad para plexin D1 son proporcionados, más específicamente, los anticuerpos A12 de dominio simple Llama (SEQ ID NO:1) y F8 (SEQ ID NO:2), desplegados o no en bacteriófagos M13, también conocidos para los expertos en la técnica, como anticuerpos VHH de despliegue de pausa. Un anticuerpo de cadena simple preferido se deriva del anticuerpo 11F5H6 y 17E9C12. La secuencia del anticuerpo de cadena simple se muestra en la SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4. Los anticuerpos para utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden ser anticuerpos de alta afinidad los cuales son evocados en animales de laboratorio no transgénicos, o en un animal transgénico en el cual el locus de globulina endógeno ha sido substituido por el locus de globulina humano, permitiendo de esta forma la producción de anticuerpos humanos en dichos animales (Jakobovits, A. Curr Opin Biotechnol 6: 561-566 (1995)). La presente invención se refiere en forma adicional a un método para producir los anticuerpos de la presente invención, en donde el método comprende inmunizar a un animal con un plexin D1, o una célula que expresa plexin D1, o un ácido nucleico que codifica plexin D1, o partes del dominio extracelular de plexin D1, de modo que los anticuerpos contra plexin D1, sean producidos por las células B del animal, aislando las células B del animal y fusionando las células B con una línea de célula de mieloma para obtener células inmortalizadas que secretan en anticuerpo. El animal es preferentemente un animal transgénico que tiene un genoma que comprende un transgeno de cadena pesada humana y un transgeno de cadena ligera humana, de modo que el anticuerpo resultante es humanizado. En una modalidad, el método incluye inmunizar un animal de laboratorio con un péptido sintético, elegido del dominio extracelular plexin D1, por ejemplo, el péptido 47-63 que corresponde al término amino de la secuencia de aminoácido de plexin D1 madura. Sin embargo, las inmunizaciones son preferentemente realizadas con dominios extracelulares recombinantes, preferentemente una región con una baja similitud con otro miembro de la familia de las plexinas, por ejemplo, una región que comprende los aminoácidos 47-546, que carece de las Secuencias Relacionadas-Met. Los dominios extracelulares plexin D1 recombinantes pueden ser producidos en células E. coli insertando los ácidos nucleicos de codificación en un vector de expresión procariótico adecuado, por ejemplo, bajo el control del promotor de ß-galactosidasa, la transformación de células E. coli con el vector, y el aislamiento de las proteínas recombinantes de los cuerpos de inclusión purificados. Sin embargo se prefiere que los anticuerpos sean evocados mediante inmunización con el dominio extracelular de plexin D1 recombinante el cual es producido por células ecucarióticas, conteniendo por consiguiente modificaciones post-traducción, las cuales son lo más similar a las que se encuentran en plexin D1 nativo, por ejemplo, mediante células de ovario de hámster chino (CHO) después de la transfección con un vector, que contiene los ácidos nucleicos de codificación de dichos dominios extracelulares bajo el control de un promotor de citomegalovirus. Los fragmentos plexin D1 extracelulares recombinantes pueden o no fusionarse a etiquetas facilitando la purificación, por ejemplo, una etiqueta VSV o una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina. El método para producir el anticuerpo también puede comprender la clonación de regiones que codifican el anticuerpo procedente de las células-B específicas de plexin D1 en el vector de expresión y expresar la secuencia de codificación. En una modalidad preferida, el vector de expresión es pHENIXHISVSV, permitiendo la expresión mediante células huésped E. coli del anticuerpo, flanqueadas en el extremo carboxiterminal a través de un Virus de Estomatitis Vesicular (etiqueta-VSV) y una etiqueta His*8. La etiqueta VSV significa que facilita la detección inmunohistoquímica, utilizada en anticuerpos específicos. La etiqueta His*8 significa que se facilita la purificación con base en cromatografía por afinidad de Níquel. Otros vectores de expresión pueden ser utilizados de igual manera. En forma más específica, la presente invención proporciona un anticuerpo de dominio simple A12 aislado, que tiene una constante de disociación menor a 2x10"8 M, el cual enlaza al término amino de plexin D1, y el cual detecta plexin D1 en manchados inmunohistoquímicos y aloja vasos sanguíneos de tumores que expresan plexin D1, y también con un anticuerpo de dominio simple aislado F8, que tiene una constante de disociación menor a 3x10"8 M, el cual enlaza al término amino de plexin D1 y el cual detecta plexin D1 en manchados inmunohistoquímicos y aloja vasos sanguíneos de tumor que expresa plexin D1. Ambos anticuerpos de dominio simple aislado pueden fusionarse a la región constante de una cadena pesada lgG1 humana o la región constante de una cadena pesada lgG1 de ratón. Preferentemente se utilizan anticuerpos completamente humanos dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad, se pueden utilizar anticuerpos derivados de animales de laboratorio o humanizados. La presente invención proporciona además anticuerpos bioespecíficos que tienen una especificidad de enlace para plexin D1, y una especificidad de enlace para una célula que presenta antígeno humano, o para un receptor Fe, en donde el receptor Fe es un Fe (gama)R1 o un receptor Fc(alfa) humano. La presente invención también proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos preferidos, o parte de enlace de antígenos. Los vectores de expresión recombinante que incluyen ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la presente invención, así como células huésped transfectadas con dichos vectores, también están comprendidas en la presente invención. Otras moléculas de enlace para utilizarse en la presente invención son moléculas pequeñas que enlazan específicamente a Plexin D1. El término "molécula pequeña" se refiere con frecuencia a moléculas con pesos moleculares de 500 o mayores. El término actualmente es utilizado comúnmente y por lo tanto queda claro para los expertos en la técnica. Además, las bibliotecas de molécula pequeña están fácilmente disponibles o son desarrolladas. Un ejemplo de dicha biblioteca son las Reposición de Moléculas Pequeñas de Bibliotecas Moleculares NIH (MLSMR). Dichas bibliotecas están sometidas a Clasificación de Alto Rendimiento (HTS) para identificar moléculas que enlazan a plexin D1. La presente invención también se refiere a las moléculas pequeñas que resultan de una clasificación de dichas bibliotecas. Otros compuestos que se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención, comprenden péptidos o aptameros (Ulrich, Med. Chem, 1 (2): 199-208 (2005)) que enlazan a dominios extracelulares de plexin D1 y por lo tanto interfieren con el enlace de ligandos plexin D1 a plexin D1. De manera inversa, dichos péptidos o aptameros también pueden enlazar a los sitios de enlace plexin D1 de los ligandos plexin D1, y por consiguiente interfieren con el enlace de ligando a plexin D1. Para interferir con la expresión del gen plexin D1, se utiliza otro tipo de molécula de enlace, en particular siARN, ARN de antisentido o fosfotio-nucleótidos antisentido. El ARN de interferencia pequeña (siARN) comprende todas las hebras de ARN que interfieran con la traducción del ARN mensajero. SiARN enlaza a la parte complementaria del ARN mensajero objetivo y lo etiqueta para degradación, inhibiendo de esta forma la expresión genética. Esto es comúnmente conocido como una "silenciación" genética. SiARN tiene normalmente de 21 a 32 nucleótidos de longitud. El ARN antisentido tiene una molécula de ARN transcrita por la codificación, en lugar de la plantilla, hebra de ADN, de modo que sea complementaria con el mARN de sentido. La formación de un dúplex entre las moléculas ARN de sentido y antisentido bloquea la traducción y también puede someter ambas moléculas a nucleasas específicas de hebra doble, inhibiendo de esta forma la expresión del gen. La inhibición de la expresión del gen se puede utilizar para bloquear la angiogénesis y migración de células de tumor y macrófagos. Preferentemente, las moléculas de enlace descritas anteriormente enlazan a plexin D1, su gen o su ligando en células eucarióticas. Dichas moléculas se acumulan en forma específica en tumores al momento de la inyección intravenosa, o se acumulan específicamente en vasos sanguíneos de tumor al momento de la inyección intravenosa. Los anticuerpos, fragmentos de los mismos, moléculas pequeñas y otros compuestos proteínaceos que enlazan plexin D1 pueden ser utilizados en varias formas. En una modalidad, la presente invención se refiere a compuestos que enlazan a la parte extracelular de plexin D1, y los cuales dan como resultado la interferencia de la función plexin D1. Como alternativa, la presente invención se refiere a compuestos que enlazan al dominio intracelular de plexin D1 y los cuales previenen la señalización mediante plexin D1. En una modalidad específica, dichas moléculas de enlace enlazan a plexin D1 para interferir con la formación del complejo de membrana de componentes múltiples inhibiendo el enlace de ligandos plexin D1, en particular neuropilin-1 , neuropilin-2, semaforin 3C, semaforin 3E, receptor 1-VEGF, receptor 2-VEGF o VEGF-A, a plexin D1. Dichas moléculas de enlace conducen a la inhibición de la señalización GTPase inducida por ligando mediante plexin D1 o a la inhibición de migración de células que expresan plexin D1, en particular células endoteliales asociadas con tumor, células de tumor o macrófagos. De acuerdo con otro aspecto de los mismos, la presente invención se refiere a un método para inducir a la lisis de una célula que expresa plexin D1, en donde el método comprende contactar la célula que expresa plexin D1 con las moléculas de enlace, en particular los anticuerpos, de la presente invención en la presencia de células efectuadas humanas, de modo que ocurra la lisis de las células que expresan plexin D1. En una modalidad aún adicional, la molécula de enlace se combina con, o se acopla con un compuesto efector que puede detectar la presencia de plexin D1 con propósitos de diagnóstico, o que puede llevar a cabo un efecto en la célula que expresa plexin D1. El compuesto efector de diagnóstico o terapéutico puede ser acoplado directamente a la molécula de enlace o puede estar presente en un vehículo de transporte, tal como un nanoaparato, en particular un liposoma o polimersoma, que se acopla a la molécula de enlace. Como alternativa, la molécula de enlace puede ser un anticuerpo biespecífico que enlaza tanto a plexin D1 como al compuesto efector, dirigiendo de esta forma al compuesto efector a un sitio o célula en donde se expresa plexin D1. La presente invención proporciona por lo tanto en una modalidad particular de la misma, el uso de dichas moléculas de enlace en un método de diagnóstico o enfermedad transmitida mediante la expresión de plexin D1, en donde el método comprende la administración intravenosa de las moléculas que enlazan plexin D1 proteínacea, aptamérica o de célula pequeña, conjugada con un compuesto efector que permite la detección in vivo de las moléculas de enlace. Los compuestos efectivos de diagnósticos son por ejemplo radioisótopos o agentes de contraste para Generación de Imágenes de Resonancia Magnética (MRI), tal como gadolinio-DTPA, o tintas fluorescentes. Los ejemplos de substancias radioactivas comprenden, pero no se limitan a, tecnetio99m (99mTc), yodo-123 (123l), yodo-131 (131l), renio-186 ó -188 (186 188Re), galio-67 (67Ga) las substancias de emisión de radiación-beta itrio-90 (90Y) o lutetio-177 (177Lu), los isótopos de emisión de positrones Fluoro-18 (18F) y Carbón-11 (11C). Los radioisótopos pueden utilizarse ya sea para detectar o dañar o exterminar células que expresan plexin D1. Normalmente se utilizan diferentes isótopos para diagnóstico y terapia. Los expertos en la técnica estarán atentos de que isótopo utilizar para cual tejido y para cual tipo de uso. En otra modalidad, las moléculas de enlace molecular proteínaceas, aptaméricas y pequeñas para utilizarse en la presente invención se pueden combinar con, o acoplarse con un agente tóxico, tal como un agente quimioterapéutico ya sea directamente o en un vehículo de transporte, en particular un nanoaparato, tal como un liposoma o polimersoma. En otra modalidad, la entidad de enlace plexin D1 de la presente invención se acopla a uno o más agentes quimioterapéuticos seleccionados del grupo que consiste en mostazas de nitrógeno (por ejemplo, ciclofosfamida e ifosfamida), aziridinas (por ejemplo, tiotepa), sulfonatos de alquilo (por ejemplo busulfan), nitrosoureas (por ejemplo, carmustina y estreptozocin), complejos de platino (por ejemplo carboplatin y cisplatin), agente de alquilación no clásicos (por ejemplo, dacarbazina y temozolamida), análogos de folato (por ejemplo, metotrexato), análogos de purina (por ejemplo, fludarabina y mercaptopurina), análogos de adenosina (por ejemplo, cladribina y pentostatin), análogos de pirimidina (por ejemplo, fluorouracil (solo o en combinación con leucovorin) y gemcitabina), ureas substituidas (por ejemplo hidroxiurea), antibióticos antitumor (por ejemplo, bleomicin y doxorubicin), epipodofilotoxinas (por ejemplo, etoposida y teniposida), agente de microtúbulo (por ejemplo, docetaxel y paclitaxel), análogos de camptotecina (por ejemplo, irinotecan y topotecan), enzimas (por ejemplo asparaginasa), citocinas (por ejemplo, interleucina-2 e interferón-falfa]), anticuerpos monoclonales (por ejemplo, trastuzumab y bevacizumab), toxinas e ¡nmunotoxlnas recombinantes (por ejemplo, toxina-B de cólera recombinante y TP-38), terapias de gen de cáncer, y vacunas de cáncer (por ejemplo, vacuna contra telomerasa). Los agentes quimioterapéuticos son seleccionados preferentemente del grupo que consiste en doxorubicina, cisplatin, sulfato de bleomicin, carmustina, clorambucil e hidroxiurea de ciclofosfamida. Otros compuestos son conocidos para los expertos en la técnica. Un tumor también puede tratarse bloqueando su suministro de sangre induciendo trombosis local en la vasculatura de tumor. Las moléculas de enlace de la presente invención pueden, en esta modalidad, utilizarse para dirigir moléculas que inducen trombosis, tal como el co-factor TF de coagulación sanguínea (Factor de Tejido), una entidad radioactiva o una toxina, tal como ricin al sitio del tumor. Los compuestos efectores se pueden acoplar a la molécula de enlace, en particular a moléculas que enlazan plexin D1, o pueden encontrarse en un nanoaparato, tal como un liposoma o polimersoma, que es acoplado moléculas que enlazan plexin D1. Un método alternativo para tratar cáncer o un trastorno inflamatorio de acuerdo con la presente invención, es con boro. Las moléculas de enlace de la presente invención se pueden conjugar a vehículos de transporte, en particular nanoaparatos, tal como Mposomas o polimersomas, que se rellenan con boro para obtener una composición terapéutica. Después del suministro y acumulación de esta composición en el área enferma, esta área es irradiada con neutrones, dando como resultado la emisión de partículas alfa radioactivas y citotóxicas que dañan o exterminan las células endoteliales de tumor, células de tumor y/o macrófagos activados. Es deseable que para anticuerpos que se dirigen a vasos sanguíneos de tumor tengan altas afinidades hacia plexin D1, por ejemplo, mayores a 10"8, preferentemente mayores a 10"9, más preferentemente mayores a 10"10 M. La alta afinidad y el alto peso molecular de los anticuerpos, restringirá sin embargo la penetración en el tejido de tumor. Por consiguiente, los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos monoclonales, obtenidos mediante clonación RT-PCR, se pueden utilizar para derivados de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos que carecen de la región constante y son monovalentes, o fragmentos de anticuerpos que se adaptan a afinidades óptimas para dirección de vasos sanguíneos o penetración de tumor mediante procedimientos mutagénicos. Estos derivados de anticuerpos tendrán afinidades inferiores y peso molecular inferior y tendrán propiedades mejoradas de dirección a células de tumor. Las moléculas de enlace diferentes a la presente invención, se pueden combinar en una mezcla. En una modalidad específica, los miembros de la mezcla tienen afinidad diversa. Un ejemplo de dicha combinación es una mezcla de anticuerpos monoclonales y/o fragmentos de anticuerpos o una mezcla de anticuerpos con moléculas pequeñas. Los anticuerpos monoclonales que tienen alta afinidad se pueden utilizar para dirigir vasos, mientras que los fragmentos más pequeños que tienen menor afinidad son mejores en su capacidad para penetrar y alcanzar las células de tumor. Como alternativa, se puede utilizar una mezcla de moléculas que enlazan plexin D1 se pueden utilizar junto con moléculas de enlace de ligando plexin D1 y/o con moléculas que enlazan ácidos nucleicos que codifican plexin D1. O las moléculas de enlace de ligando plexin D1 pueden combinarse con moléculas que enlazan ácidos nucleicos que codifican plexin D1. Las moléculas de enlace plexin D1 de la presente invención se pueden utilizar en un método para tratar una enfermedad transmitida por la expresión de plexin D1, que comprende el suministro intravenoso de las moléculas de enlace de la presente invención en una dosis, efectiva para tratar dicha enfermedad. Las moléculas de enlace se pueden utilizar en un método para diagnosticar una enfermedad transmitida por la expresión de plexin D1, que comprende la administración intravenosa de conjugados de moléculas de enlace de plexin D1 con un trazador paramagnético, fluorescente o radioactivo seguido de generación de imagen de resonancia magnética, generación de imagen óptica, SPECT ó PET. Las moléculas de enlace pueden utilizarse en forma adicional en un método para tratar o suprimir una enfermedad transmitida por la expresión de plexin D1, que comprende la administración intravenosa de las moléculas de enlace proteínaceas y molecular pequeñas de la presente invención o una composición de las moléculas de enlace molecular pequeñas proteínaceas. La enfermedad que será tratada o diagnosticada puede ser cáncer, una enfermedad inflamatoria, en particular una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide, o ateroesclerosis, o esclerosis múltiple. El diagnóstico se puede llevar a cabo in vivo e in vitro. Un método in vivo se describió anteriormente y puede llevarse a cabo con generación de imagen de resonancia magnética (MRI) o con cámaras SPECT o PET después de la acumulación de la molécula de enlace etiquetada en forma radioactiva en tejido enfermo. Otro método de diagnóstico comprende detectar la presencia de plexin D1 en una muestra in vitro o ex vivo. Dicho método comprende contactar la muestra con moléculas de enlace de plexin D1, o ácidos nucleicos que enlazan el gen plexin D1 o su mARN o una copia de ADN derivado de su mARN, todas enlazadas a un marcador detectable, bajo condiciones que forman un complejo entre el anticuerpo y plexin D1, y detectar la formación del complejo. El complejo puede ser detectado mediante visualización del marcador detectable. Las muestras pueden ser fluidos corporales, tal como sangre, suero, plasma, saliva, orina, semen, heces o tejidos, tales como biopsias de células de tumor. La presente invención se refiere además a un vector de expresión, que comprende la secuencia de codificación del anticuerpo Llama F8 o A12, o del anticuerpo de cadena simple derivado del anticuerpo 11F5H6 y secuencias reguladoras adecuadas. La presente invención también se refiere a una célula transfectada con el vector de expresión. La presente invención se refiere además a la proteína recombinante obtenible expresando el vector de expresión. Otro aspecto de la presente invención se refiere al vector de expresión, que comprende la secuencia de codificación del dominio extracelular de plexin D1, opcionalmente fusionado a una región constante de una cadena pesada humana y secuencias reguladoras adecuadas. La presente invención también se refiere a una célula transfectada con dicho vector de expresión. La presente invención se refiere además a la proteína recombinante obtenida mediante la expresión del vector de expresión. La proteína recombinante comprende el dominio extracelular de plexin D1, el cual enlaza a ligandos plexin D1 y por lo tanto previene el enlace de los ligandos al plexin D1 asociado con la célula. Preferentemente, la secuencia de codificación codifica una proteína recombínate que comprende los aminoácidos 47-506 del dominio extracelular de plexin D1, el cual enlaza a ligandos plexin D1, y por lo tanto previene el enlace de los ligandos a plexin D1 con la célula, o los aminoácidos 507-1274 del dominio extracelular de plexin D1, el cual enlaza a ligandos plexin D1, evitando de esta forma el enlace de los ligandos a plexin D1 asociado con la célula. La proteína recombinante puede llevar mutaciones que incrementa la integridad de ligandos plexin D1, y por consiguiente tienen potencia incrementada como receptores de señuelo. Dichas mutaciones normalmente son inducidas haciendo cambios en la secuencia de codificación utilizada para producir la proteína recombinante. La presente invención se refiere además a uso de moléculas de enlace de la presente invención en un método para tratar o suprimir una enfermedad trasmitida por plexin D1, que comprende el suministro intravenoso o intratumoral de dominios extracelulares plexin D1 de señuelo tal como se describió anteriormente, o en un método para tratar o suprimir una enfermedad transmitida por plexin D1, que comprende la administración intravenosa de adenovíruses o lentivíruses, que contienen los nucleótidos de codificación de los dominios extracelulares recombinantes de plexin D1 o parte de los mismos, tal como se describió anteriormente.

Estos receptores plexin D1 decoy antagónicos interfieren con la interacción entre plexin D1 y sus ligandos, en particular neuropilin-1 , semaforin 3C y semaforin 3E, y por consiguiente interfieren con la función plexin D1. Preferentemente, los receptores plexin D1 decoy tienen afinidad incrementada hacia ligandos plexin D1, tal como se compara con plexin D1. Dicha afinidad incrementada puede ser obtenida creando una biblioteca de dominios extracelulares plexin D1, llevando en las mutaciones introducidas aleatorias, y seleccionando receptores decoy con el comportamiento antagónico más potente en ensayos de migración celular. Con el objeto de producir las moléculas proteínaceas (incluyendo péptidos, polipéptidos y polipéptidos glucosilados o polipéptidos que tienen otras modificaciones post- o peri-traducción) es deseable insertar el ácido nucleico recombinante que codifica fragmento del dominio extracelular de plexin D1 que comprende los sitios de enlace para semaforin 3C, semaforin 3E y NP-1 en vectores de expresión. Los antagonistas de acuerdo con la presente invención, se producen preferentemente a partir de un ácido nucleico o un vector de expresión de acuerdo con la presente invención, preferentemente en una célula huésped. Las moléculas de la presente invención también se pueden utilizar en una combinación de métodos de tratamiento tal como se describió anteriormente y/o con terapias convencionales o terapia anti-angiogénica para evitar en forma adicional la formación de una neovasculatura de tumor, o radioterapia y/o quimioterapia adyuvante. La presente invención se refiere además a un método para identificar moléculas que tienen la capacidad de enlazar a plexin D1, en donde el método comprende contactar una recolección de moléculas con plexin D1 y seleccionar las moléculas de la recolección que muestra el enlace con plexin D1, tal como moléculas de enlace plexin D1. La recolección de moléculas puede estar presente, por ejemplo, en bibliotecas de molécula pequeña, en una formación de proteínas, etc. Las técnicas para clasificar recolecciones de moléculas son conocidas por sí mismas. La presente invención reside en la identificación del objetivo que será enlazado, el cual es plexin D1. En la presente solicitud, el término "molécula de enlace" se utiliza para todos los tipos de moléculas de enlace, es decir, los que enlazan plexin D1, los que enlazan un ácido nucleico que codifica el gen plexin D1 y los que enlazan los ligandos plexin D1. Todos estos tipos de moléculas pueden acoplarse a los compuestos efectores tal como se describió anteriormente. Breve Descripción de las Figuras La presente invención se ilustrará en forma adicional en los ejemplos que se encuentran más adelante, y los cuales no se proyectan en forma alguna para limitar la presente invención. En los ejemplos se hace referencia a las siguientes figuras: Figura 1: Dominios estructurales de miembros de la familia de plexin: cuatro subfamilias han sido identificadas, a saber plexin A-D. Los cuadros con rayas horizontales indican dominios Sema, los cuadros rayados en forma diagonal indican motivos de secuencias relacionadas-Met (MRS), y el cuadro despejado indica el motivo MRS atípico de PLXND1. Los miembros de la subfamilia de Plexin B tienen un sitio proteolítico tipo furina potencial, marcado mediante una cinta gris. La región de transmembrana se marca a través de un cuadro sombreado y está seguido de dos dominios intracelulares conservados, comprendiendo juntos el dominio-SP, marcado a través de dos óvalos. Figura 2: A) Análisis de hibridación in situ de lesiones Me 57-VEGF-A-I65 cerebrales utilizando sonda de ARN plxndl específica de ratón etiquetado con digoxigenin. Los vasos de tumor son fuertemente positivos (flecha), en tanto que las capilaridades de cerebro, distantes de las lesiones, son negativas (comparado el perfil ISH con el manchado CD34 en la figura 2B). Figura 3: Análisis ISH específico de PLXND1 humano de metástasis de cerebro multiforma de glioblastoma (A) de sarcoma (B), melanoma (C), y mamocarcinoma (D). Los insertos muestran manchados CD31 de secciones en serie. El ISH de control utilizando sondas de sentido fueron negativas (no mostradas). Se debe observar que en estos tumores, la expresión PLXND1 no se confina a los vasos sanguíneos: también en células de tumor con altos niveles de PLXND1, se encontraron transcripciones. T = tumor, V=vaso. Figura 4: Análisis ISH utilizando una sonda de ARN etiquetada con digoxigenin especifico humano (A) y manchado inmunohistoquímico con CD31 (B) de cerebro normal. Se debe observar que los vasos se encuentran abundantemente, pero estos no expresan la transcripción plexin D1. Figura 5: Especificidad de fagos (A) y anticuerpos de dominio simple correspondientes (sdabs) (B) A12 y F8 para H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC-CONH2 de péptido. En A, se dejaron fagos 1010 enlazar al PLXND1 -péptido, BSA, IgG humano o péptidos irrelevantes tal como se describe en el texto. Después de un lavado riguroso, se detectaron fagos enlazados utilizando un anticuerpo anti-M13. En B, se llevaron a cabo incubaciones similares pero ahora con sdabs solubles. Después del lavado, se detectaron sdabs enlazadas y semi-cuantificadas a través de la etiqueta VSV-G. Figura 6: Las constantes de disociaciones (kd's) del enlace entre los anticuerpos de dominio simple A12 y F8 se determinaron utilizando el biosensor Biacore 2000 (Uppsala, Suecia). El chip de sensor y los químicos de acoplamiento de proteína fueron comprados en Biacore AB. Se acopló el conjugado PLXND1-péptido-KLH (27 µg/ml en Na-Acetato, pH 4.0) o BSA (1 µg/ml en Na-Acetato, pH 5.0) a superficies CM5 activadas utilizando carbodiimida de N-e \-N'-(dimetilaminopropilo), /V-hidroxisuccinimida, bajo condiciones recomendadas por el fabricante. Se desactivaron grupos no reactivados a través de etanolamina 1M, pH 8.5. Se llevaron a cabo medidas cinéticas a una temperatura de 25°C con un rango de flujo de 10 ml/min en un regulador HBS-EP (10 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% tensioactivo P20). Se utilizaron seis concentraciones de sdabs purificados con afinidad-Ni (dentro del rango de 1 mM a 50 µ?) para determinar las constantes de disociación (Kds) de la interacción con el péptido-PLXNDI . Después de cada experimento, se llevó a cabo la regeneración de la superficie de sensor con 10 mM NaOH. El enlace específico, definido a través del enlace a una superficie-PLXNDI menos el enlace a una superficie-BSA de control, se analizó utilizando el software Bl Aevaluation 4.1 y un modelo de enlace 1:1 Langmuir. Las afinidades de los anticuerpos de dominio simple A12 y F8 fueron 2.1 x 10"8 M y 3.5 x 10"8 M. Figura 7: Evaluación de especificidad de plexin D1 de anticuerpos de dominio simple. La figura A muestra manchado inmunohistoquímico de la placa de crecimiento de hueso trabecular de un embrión de ratón (E16.5) con anticuerpo de dominio simple A12, utilizando la etiqueta VSV-G para detección del anticuerpo. El recuadro muestra una hibridación in situ de una estructura embriónica similar utilizando una sonda plexin D1 etiquetada con digoxigenin específica de ratón. Se debe observar el traslape de plexin D1 en la hibridación in situ e inmunomanchado. La figura 7B es un ejemplo representativo de una lesión Me157-VEGF-A165 en cerebro de un ratón desprotegido. La vasculatura que también fue positiva en plexin D1 ISH (ver también figura 2) es inmunopositiva con el anticuerpo de dominio simple F8. Figura 8: Inmunomanchados con anticuerpo de dominio simple A12 en una selección de tumores de cerebro humano. Los cerebros mostrados son A) multiforme de glioblastoma, metástasis de B) melanoma C) mamocarcinoma y D) carcinoma de célula renal. Los insertos en A y B consisten en manchados de control únicamente con anticuerpo anti-VSV, y muestran que el manchado de tumor es específico. Se debe observar que los vasos y células de tumor son altamente reactivos con el anticuerpo. Figura 9: Inmunomanchados con anticuerpo de dominio simple A12 en una serie de progreso de melanoma. Los inmunomanchados se llevaron a cabo en un nevus, nevus displástico y fases de melanoma de crecimiento horizontal y vertical. Se debe observar que únicamente las células neoplásticas expresan plexin D1.

Figura 10: Inmunomanchados con anticuerpo de dominio simple A12 en secciones de tumores de cerebro Me157-VEGF-A en ratones, tratados con ZD6474. En ratones no tratados o tratados con placebo, la tinción de vasos de tumor fue positiva con este anticuerpo. Sin embargo, en ratones tratados con ZD6474, existe una disminución dependiente de la dosis de la expresión plexin D1. ZD6474 se administró en forma oral, una vez al día, en la dosis tal como se indica. Figura 11: Inmunomanchados dobles con el marcador de macrófago CD68 (manchado azul) y anticuerpo A12 de dominio simple (manchado rojo) o mamocarcinoma. Una subpoblación de macrófagos expresa plexin D1 tal como se reveló a través de la proteína de manchado púrpura. Figura 12: alojamiento in vivo de fago A12, F8 o un fago irrelevante para lesiones de cerebro Me157-VEGFi65- Los ratones que contienen tumores fueron inyectados con fagos 1012 en la vena de la cola y después de 5 minutos los ratones fueron anestesiados y sometidos a perfusión cardíaca con 15 mi de solución salina regulada por fosfato. Los ratones fueron sacrificados, los cerebros fueron eliminados y las secciones congeladas fueron analizadas con respecto a contenido y distribución de fagos. A) manchado M13 de sección congelada de lesiones Me157-VEGF 6s de cerebro. Los fagos están asociados claramente con vasos, tal como se puede evidenciar a través del inmunomanchado anti-CD34 en una sección en serie, mostrada en B). Las flechas señalan a un envase positivo-CD34, distante de la lesión, lo cual no es señalado mediante el manchado anti-M13. El subcuadro en (A) muestra un experimento de control en donde se inyectó un fago irrelevante. C) distribución de sdab F8 después de la inyección intravenosa en ratones que contienen tumor. Se visualizaron sdabs mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-VSV. Se debe observar que sdab se detecta en vasos de tumor pero no en capilaridades de cerebro normal. El recuadro muestra el experimento de control en donde se inyectó un sdab irrelevante. Se observó una localización intersticial consistente con la naturaleza agujereada de los vasos en estos tumores. D) Cuantificación de alojamiento de fago. El tejido de tumor fue seccionado de secciones congeladas de 10 µ?p utilizando microscopía de disección de captura láser. El número de fagos que forman colonias (cfp) se contó después de la inyección de células TG1. Se eluyeron veinte veces más fagos F8 de tumores que de áreas comparables de tejidos de cerebro no afectados. Figura 13: Alojamientos de anticuerpos de dominio simple para vasos de tumor que no se han formado nuevamente por sí mismos. Se inocularon ratones desprotegidos con una suspensión celular de células 1, 5 x 105 del semi-injerto del glioma humano E98, el cual se obtuvo de tumor E98 subcutáneo. Después de 3 semanas, se inyectaron fagos que llevan un solo anticuerpo de dominio F8 en la vena de la cola, y después de 5 minutos los ratones se anestesiaron y sometieron a perfusión cardíaca utilizando 15 mi de solución salina regulada por fosfato. Los ratones se sacrificaron posteriormente, los cerebros se eliminaron y fijaron en formalina. Las secciones en serie se mancharon con anticuerpos contra proteína M13 p8 (A), el marcador endotelial CD34 (B) y glut-1 (C, un marcador para capilaridades de cerebro pre-existente). La comparación de A, B y C revela que no únicamente los vasos de tumor recientemente formados acumulan fago F8, sino también vasos cerebrales no dilatados que expresan glut-1 y que por lo tanto se consideran vasos cerebrales pre-existentes que habían sido incorporados en el tumor. Figura 14: Efectos de dominios extracelulares de plexin D1 en el desarrollo de vasculatura de tumor. Los transfectantes dobles de la línea de célula de melanoma humana Me157, que expresa VEGF-A16s y el dominio extracelular de plexin D1 que comprende los aminoácidos 1-850, se inyectaron en la arteria carótida interna derecha de ratones desprotegidos. Después de tres semanas, los ratones se sometieron a generación de imagen de resonancia magnética mejorada con Gadolinio-DTPA. La figura 14A muestra imágenes MR de dos ratones de control que llevan tumores de cerebro Me157 que expresan únicamente VEGF-A165. La figura 14B muestra imágenes MR de cerebro de dos ratones que llevan el transfectante doble. La filtración vascular, tal como se ensayó a través de extravasación Gd-DTPA, tiende a ser menor en transfectantes dobles, lo que sugiere que la filtración vascular inducida por VEGF-A se contrarresta a través del ectodominio plexin D1. De manera más importante, los vasos sanguíneos en los tumores transfectados dobles son activados, tal como se indica mediante activación de CD34, que aún expresan glut-1, lo que sugiere fuertemente que estos vasos son vasos pre-existentes que están incorporados en el tumor a través del fenómeno de co-opción. Se debe observar que los vasos sanguíneos en los tumores que expresan únicamente VEGF-A165, son negativos para glut-1 y por consiguiente se pueden considerar como recientemente formados. Figura 15: Los manchados Western se generaron con ectodominios plexin D1 recombinantes, expresados en E. coli y que comprenden los aminoácidos 47-506 (columna 1) o 225-358 (columna 2). El suero de ratón 25 fue probado antes (panel A) y después (panel B) de la inmunización con la región plexin D1 47-506. Tal como se muestra en la figura 15B, el suero inmune de ratón reconoció en forma específica la proteína recombinante E. coli 47-506 (52 kDa, columna 1) y la proteína que comprende los residuos 225-388 de plexin D1 (una proteína 18 kDa que descansa completamente dentro de la secuencia que fue utilizada para inmunización, columna 2). El suero pre-inmune no mostró reactividad (panel A). Cuando se probó en manchados inmunohistoquímicos en una metástasis de cerebro de un sarcoma de tejido suave alveolar, el suero inmune de ratón (panel B), pero no el suero pre-inmune (panel C), mostró positividad hacia vasos sanguíneos y células de tumor, un patrón de manchado que fue similar al del anticuerpo de dominio simple A12. Figura 16: Inmunohistoquímica con anticuerpos IgM monoclonales, obtenidos de B-linfocitos de ratón 25. Se seleccionaron anticuerpos 11F5H6 y 17E9C12 con base en reactividad contra proteína 47-506 en ELISA, y se analizaron con respecto a su potencial para detectar plexin D1 en secciones congeladas de tumores humanos. Estos anticuerpos mostraron fuerte positividad en metástasis de cerebro de sarcoma y melanoma, tal como se ilustra en la figura. Se debe observar, que los insertos en los paneles C-F representan manchados de control en los cuales se omitió el anticuerpo primario. Los paneles A y B muestran que estos anticuerpos no reconocen de manera notable las estructuras de vasos en tejido de cerebro normal. Figura 17: Alojamiento de tumor de anticuerpo 11F5H6.

Para evaluar en forma adicional si el anticuerpo monoclonal 11F5H6 tiene la capacidad de reconocer vasos sanguíneos de tumor, se crecieron tumores Me157-VEGF-A angiogénicos en cerebros de ratones desprotegidos, esencialmente como se describe en el ejemplo 10. Se inyectó el anticuerpo 11F5H6 (1 mg) en una vena de la cola lateral y se dejó circular durante 15 minutos. Después de este período, los ratones se anestesiaron con 1.3% de isoflurano y el pecho se abrió, tiempo en el cual se llevó a cabo una perfusión cardíaca con 20 mi de solución salina regulada por fosfato. Después de este procedimiento, los ratones fueron decapitados, y los cerebros se eliminaron y se congelaron a presión o se fijaron en formalina. Las secciones congeladas de 4 µp?, fueron manchadas con anticuerpo anti-lgM. En la figura 17A, se muestra que el anticuerpo 11F5H6 aloja y se acumula en vasos de tumor pero no en vasos normales (comparar el manchado anti-lgM de la figura 17A con el manchado CD31 anti-endotelial en la figura 17B). Dicho manchado no se aprecia cuando se lleva a cabo el manchado anti-lgM en ratones no inyectados. Por lo tanto, 11F5H6 es un anticuerpo prometedor que permite la dirección del tumor. Figura 18: Expresión de Plexin D1 en macrofagos en un modelo de ratón de artritis reumatoide. Los manchados se llevaron a cabo con anticuerpo de dominio simple A12. Figura 19: expresión de Plexin D1 en ateroesclerosis. Un subgrupo de macrofagos en placas ateroescleróticas humanas expresa plexin D1. Los manchados se llevaron a cabo con anticuerpo de dominio simple A12. Se llevó a cabo un manchado doble, que despliega plexin D1 en rojo y el marcador de macrófago CD68 en azul. Un color púrpura indica co-expresión . La tabla muestra lo siguiente: Tabla I: Análisis de diferentes patologías de expresión plexin D1. Tabla II: Expresión plexin D1 en lesiones melanocíticas incrementa de lesiones benignas a malignas. EJEMPLOS EJEMPLO 1 Expresión específica de plexin D1 en vasos sanguíneos asociados con tumor Plexin D1 expresa neuronas pero también en células endoteliales en vasos angiogénicos durante embriogénesis. La presente invención demuestra que plexin D1 se expresa en vasos sanguíneos asociados con tumor pero no en vasos sanguíneos normales. Esto ha sido mostrado a través de hibridación in situ de cerebro de ratón, que contiene lesiones de melanoma humana angiogénico (figura 2). El modelo de tumor animal se describe en (Kusters, B y asociados, Cáncer Res 63: 5408-5413 (2003)). En síntesis, las células de tumor son inyectadas a través de un procedimiento microquirúrgico en la arteria carótida derecha, dando como resultado el crecimiento de tumor en la parenquima del hemisferio derecho del cerebro. Después de tres semanas, en la generación de síntomas neurológicos, los ratones se sacrificaron y los cerebros se eliminaron y fijaron en formalina. Se sometieron a hibridación in situ secciones de 4 µ?t? con fragmentos de ARN de sentido y antisentido etiquetados con digoxigenin. Se generaron sondas ARN mediante transcripción utilizando polimerasa de ARN T3 y T7, respectivamente, de un producto PCR, que comprende 600 bases en la región no traducida-3', y la cual se flanqueó mediante promotores T7 y T3 (Van der Zwaag y asociados. (2002), supra). Las hibridaciones in situ utilizando sondas ARN antisentido y sondas ARN de sentido como controles negativos, se llevaron a cabo utilizando protocolos estándar. Las secciones fueron desparafinadas mediante fusión de parafina a una temperatura de 60°C y tratamientos subsecuentes con xileno y etanol. Después de la rehidratación en solución salina regulada con fosfato (PBS) se llevó a cabo una digestión de proteinaza K (10 µg/m\ PBS en 20 mM Tris-HCI pH 7.4/5 mM EDTA) durante 15 minutos a una temperatura de 37°C. Las secciones fueron post-fijadas en formaldehído amortiguado al 4% durante 10 minutos, y acetiladas en anhídrido de ácido acético 0.1 M. Las correderas se lavaron subsecuentemente en 2xSSC (Citrato de sodio/Cloruro de sodio) y milliQ. Después de secarse, las correderas se hibridaron con sondas de ARN etiquetadas con digoxigenin durante la noche a una temperatura de 65°C en formamida/2xSSC al 50%. Se observaron altos niveles de ARN de plexin D1 en vasos de tumores Me157 angiogénicos (figura 2) utilizando una sonda de ARN plexin D1 específica de ratón. Las células de tumor también fueron positivas para la transcripción. La homología no perfecta entre plexin D1 de ratón humano dio como resultado una señal más débil en las células de tumor humano utilizando la sonda de ratón. EJEMPLO 2 Expresión de plexin D1 en tumores Para investigar la expresión de ARN de plexin D1 en muestras de tumor humano, llevamos a cabo hibridaciones in situ con una sonda de ARN plexin D1 específica de humano. Altos niveles de expresión de ARN plexin D1 se encontraron en un número de tumores humanos, de los cuales (multiforme de glioblastoma, metástasis de sarcoma de cerebro, carcinoma de cerebro renal, adenocarcinoma de colon y de seno), tanto en vasculatura de tumor como en células de tumor. En la tabla 1 se proporciona un resumen de tipos de tumor que expresan plexin D1. La figura 3 muestra algunos ejemplos de hibridaciones in situ, por ejemplo, un glioblastoma, una metástasis de melanoma de cerebro y una metástasis en cerebro de carcinoma de colon. El ARN plexin D1 se encontró no únicamente en la vasculatura de tumor, sino también excesivamente en las propias células de tumor. En forma importante como en la figura 4A, no se observó expresión ARN de plexin D1 en vasculatura de cerebro normal. En la figura 4B, se muestra una tinción CD31, lo que demuestra que están presentes abundantes vasos en estas secciones.

EJEMPLO 3 Preparación de anticuerpos contra plexin D1 Para detectar la proteína plexin D1, se seleccionaron anticuerpos con afinidad hacia plexin D1. Para este fin, se construyó una biblioteca de fago M13 pHENIX que expresa anticuerpos V-H del dominio simple Llama, construido mediante RT-PCR de B-linfocitos Llama tal como se describe en (van Koningsbruggen, S y asociados, J Inmunol Methods 279: 149-161 (2003)). La población de cADNs resultante que codifica fragmentos e anticuerpo de dominio simple-V-H (sdab) se ligó en el vector de fagémido pHENIXHis8VSV (resultados no mostrados), dando como resultado un producto de fusión con una etiqueta-8*His y una etiqueta-VS V-G en el término-C. Después de la electroporación en células TG1 E. coli, se recolectaron y reunieron colonias resistentes a ampicilina. La biblioteca resultante tuvo complejidad de clones 8 x 108. Ochenta porciento de los plásmidos contenían el inserto sdab de longitud total determinado mediante análisis PCR y detección de manchado punto inmunologico de etiquetas VSV-G en sdab (ver más adelante). La biblioteca de fagos se propagó en fagémidos en bacteria TG1 E. coli. Las partículas de fago se rescataron mediante inyección con el fago M13K07 auxiliar sensible a tripsina (50). Los fagos se purificaron y concentraron a partir del sobrenadante del cultivo mediante precipitación con Polietilénglicol/2.5 M NaCI al 20% mediante metodología estándar. Para seleccionar los fagos, el despliegue de anticuerpos con afinidad hacia plexin D1, inmunotubos (Nunc, Roskilde, Denmark) se recubrieron durante la noche a una temperatura de 4°C con péptido conjugado-KLH 5 g/ml (H2N-ALEIQRRFPSPTPTNC-CONH2) que corresponde a los aminoácidos 1-16 de la proteína PLXND1 humana madura (acceso no. AY116661) en 50 mM NaHC03 (pH 9.6). Se debe observar, que el ácido glutámico en la posición 3 en este péptido es una lisina en la secuencia de ratón, los aminoácidos restantes son homólogos con plxndl de ratón. Después de un lavado riguroso con PBS/0.5% Tween 20 (PBST), se bloquearon sitios de enlace no específico con marvel al 5% en PBST (MPBST, 1 hora a temperatura ambiente (RT)) y partículas de fago 1013 de la existencia de bibliotecas se incubaron con el péptido inmovilizado durante 90 minutos a temperatura ambiente. Después de un lavado riguroso con PBST y PBS, se eluyeron fagos enlazados mediante tratamiento de tripsina (10 mg/ml, 30 minutos a temperatura ambiente). Después de la desactivación de tripsina con suero de becerro recién nacido al 1%, se utilizó el eluato para infectar las células TG1 de fase-log para amplificar los fagos de enlace-PLXND1 y calcular el número de enlazadores. Para enriquecer los fagos de enlace, se llevaron a cabo cuatro vueltas de selección. A partir de la segunda vuelta, las selecciones se llevaron a cabo contra péptidos no conjugados, inmovilizados en placas de enlace-ADN (Costar) para evitar la selección de enlazadores-KLH. Los fagos de enlace PLXND1 individuales con insertos sdab de longitud total confirmados con PCR, fueron probados para especificidad hacia plexin D1. los depósitos de las placas de enlace-ADN o inmunoplacas (Nunc) se recubrieron durante la noche a una temperatura de 4°C con PLXND1 -péptido o un péptido ¡rrelevante (1 µg/depósito en PBS/0.5 M NaCI pH 9.0), albúmina de suero de Bovino (1 µg/depósito en 50 mM NaHC03 pH 9.6) o inmunoglobulina humana G (1 µg/depósito en 50 mM NaHC03 pH 9.6). Después de bloqueo de sitios de enlace no específicos con MPBST, los depósitos se incubaron con fagos en MPBST durante 1 hora a temperatura ambiente y los fagos no enlazados se eliminaron mediante lavado riguroso. Se detectaron fagos enlazados utilizando anti-M13 conjugado-HRP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) y tetrametilbencidina (TMB; bioMérieux B.V., Holanda). La reacción se terminó con 2M H2S04 y la actividad enzimática se cuantificó midiendo la absorbancia en 450 nm utilizando un lector ELISA. Utilizando este procedimiento de selección, los fagos que despliegan los anticuerpos de dominio simple V-H A12 y F8 en sus superficies se identificaron como enlazadores específicos. La figura 5A muestra que los anticuerpos A12 y F8 asociados con fago M13, enlazan en forma específica al péptido plexin D1, pero no a albúmina de suero de bovino, inmunoglobulinas o un péptido irrelevante. La expresión de anticuerpos de dominios simples solubles se indujo en células TG1 E. coli de fase-log cultivando a una temperatura de 30°C en un medio 2xTYA/1 mM IPTG. Se recolectaron sdabs mediante lisis osmótica utilizando amortiguador TES enfriado con hielo (200 mM TrisHCI, 0.5 mM EDTA, 500 mM sacarosa) que contiene un cóctel de inhibidor de proteasa (Roche, Basel, Suiza). Las concentraciones sdab se estimaron mediante análisis de manchado de punto utilizando el P5D4 anti-VSV-G monoclonal de ratón, inmunoglobulina antiratón de conejo conjugada con fosfatasa alcalina (Dako, Dinamarca) y manchado NBT/BCIP. Se probaron sdabs en ELISA con respecto a especificidad de péptido-PLXNDI . Los anticuerpos del dominio simple A12 y F8 no enlazaron a péptidos irrelevantes, no a albúmina de suero de bovino, y no a inmunoglobulina humana G (figura 5B). Las constantes de disociación (kd's) del enlace entre los anticuerpos de dominio simple A12 y F8 se determinaron utilizando el biosensor Biacore 2000 (Uppsala, Suiza). El chip de sensor y los químicos de acoplamiento de proteína se compraron en Biacore AB. Se acopló el conjugado PLXND1 -péptido-KLH (27 µg/ml en Na-Acetato, pH 4.0) o BSA (1 µg/ml en Na-Acetato, pH 5.0) a superficies CM5 activadas utilizando carbodiimida de /V-etil-AT- (dimetilaminopropilo), N-hidroxisuccinimida, bajo condiciones recomendadas por el fabricante. Los grupos no reactivados fueron desactivados a través de etanolamina 1M, pH 8.5. Se llevaron a cabo medidas cinéticas a una temperatura de 25°C con un rango de flujo de 10 ml/min en amortiguador HBS-EP (10 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% tensioactivo P20). Se utilizaron seis concentraciones de sdabs purificados con afinidad-Ni (dentro del rango de 1 mM a 50 µ?) para determinar las constantes de disociación (Kds) de la interacción con el péptido-PLXNDI . Después de cada experimento, se llevó a cabo la regeneración de la superficie de sensor con 10 mM NaOH. El enlace específico, definido por el enlace a una superficie-PLXNDI menos el enlace a una superficie-BSA de control, se analizó utilizando el software Bl Aevaluation 4.1 y un modelo de enlace 1:1 Langmuir. Las afinidades de anticuerpos de dominio simple A12 y F8 fueron 2.1 x 10"8 y 3.5 x 1 O"8 M, respectivamente (figura 6). EJEMPLO 4 Manchados inmunohistoquímícos con anticuerpos de dominio simple A12 v F8 Los anticuerpos de dominio simple son etiquetados en el extremo carboxiterminal con una etiqueta-VSV-His, permitiendo manchados inmunohistoquímícos utilizando un anticuerpo anti-VSV. El protocolo que se encuentra a continuación estuvo seguido de manchados inmunohistoquímicos con anticuerpos de dominio simple A12 y F8. Después de la desparafinización , se bloqueó la actividad de peroxidasa endógena mediante incubación 0.03% H202. Se llevó a cabo recuperación de antígenos mediante tratamiento con pronasa de acuerdo con protocolos estándar. En forma subsecuente, se incubaron previamente las correderas con suero de caballo y cabra normal (para bloquear sitios de enlace no específico en secciones de tejido de humano y ratón, respectivamente), seguido de incubación con sdabs durante 1 hora. Se detectaron sdabs mediante incubación en secuencias de 1 hora con un antisuero anti-VSV-G de ratón o conejo (Sigma-Aldrich Chemie B.V., Zwijndrecht, de Holanda), anticuerpo anti-ratón o anti-conejo biotinilado según sea lo adecuado (Vector, Burlingame, CA), y complejo de peroxidasa de avidina-biotina (Vector, Burlingame, CA). Finalmente, se visualizó la peroxidasa mediante reacción de peroxidasa 3-amino-9-etilcarbazole (ScyTek, Utah, EUA) con hematoxilina como un contra-manchado. Se llevaron a cabo todos los pasos a temperatura ambiente. La especificidad del anticuerpo A12 y F8 para plexin D1 en manchados inmunohistoquímicos se revisó primero mediante tinción de embriones de ratón, en los cuales los patrones de expresión de plexin D1 en el nivel de ARN estuvieron bien caracterizados (Van der Zwaag y asociados (2002), supra). y comparando los perfiles con inmunomanchados con anticuerpo ant¡-CD31 anti-endotelial (DAKO, Glostrup, Dinamarca). En la placa de crecimiento de hueso trabecular de embriones de ratón en E16.5, se observó inmunomanchado en vasos sanguíneos positivos-CD31. Se correlacionó con hibridación in situ para la transcripción de plexin D1 (figura 7A). El origen del vaso sanguíneo de la expresión PLXND1 se confirmó en forma adicional llevando a cabo manchados en secciones en serie con sdabs y anticuerpo anti-CD31 anti-humano (CD-31 antihumano). EJEMPLO 5 Manchado de células de tumor con F8 Se mancharon secciones de cuatro µ?t? de xenoinjertos de ratón cerebral de la línea de célula de melanoma humano Me157-VEGF-A (Kusters y asociados, (2003), supra). con anticuerpo de dominio simple F8, de acuerdo con el protocolo ejemplificado en el ejemplo 4. El anticuerpo reconoció de manera clara plexin D1 en vasos sanguíneos de tumor (figura 7B). Para investigar en forma adicional la expresión de la proteína plexin D1 en tumores, se inmunomancharon tejido de tumor de diferentes orígenes o se incrustó en parafina (multiforme glioblastoma (figura 8A), metástasis de cerebro de melanoma (figura 8B) carcinoma de colon (figura 8C) y carcinoma de célula renal (figura 8D) con sdabs anti- PLXND1. La inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo A12 y la comparación con los manchados CD31 anti-humano en secciones en serie, mostró la expresión en todos los tumores revisados y se confirmó la expresión de plexin D1 en el nivel de proteína en células de tumor y en vasos sanguíneos de tumor. EJEMPLO 6 Cronometraje de expresión de plexina en células malignas Para investigar si la expresión de plexin D1 que ocurre en células pre-malignas, se manchó una serie de melanoma en progreso, consistiendo en nevi benigno, nevi displástico, melanoma de fase de crecimiento radial, melanoma invasivo y melanoma diseminado. Los melanocitos en nevi benigno y nevi displástico, no expresaron la proteína, en tanto que las células transformadas en forma maligna, tanto en tumores de fase de crecimiento radial como de fase de crecimiento vertical son positivos en cuanto a la proteína (figura 9 y Tabla II). EJEMPLO 7 Estado de activación de células que expresan plexin D1 La expresión de plexin D1 está relacionada con el estado de activación de las células endoteliales en vasos sanguíneos de tumor. El tratamiento con ZD6474, un inhibidor de VEGFR2 y EGFR, mostró previamente bloqueo a la angiogénesis en modelo de tumor de cerebro en ratón, dando como resultado un cambio del fenotípico de co-opción de vaso de angiogénico a no angiogénico (43). El tratamiento con ZD6474 dio como resultado una disminución de la expresión plexin D1 en vasos sanguíneos asociados con tumor en una forma dependiente de la dosis (figura 10). Por lo tanto, la expresión plexin D1 es una característica de células endoteliales activadas. EJEMPLO 8 Inmunohistoquímica con A12 en tejidos normales La expresión de plexin D1 en cerebro, corazón, piel, riñon, vaso, intestino, endometrio normal se revisó mediante inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo A12. Los vasos en plexin D1 expresado en miometrio proliferativo, muestran que plexin D1 está asociada no únicamente con la angiogénesis patológica, sino también con la angiogénesis fisiológica (no mostrada). En algunos casos, se llevaron a cabo co-inmunomanchados con marcador de macrófago CD68. Estos manchados revelaron que una subpoblación de macrófagos expresó la proteína (figura 11). También se descubrió que los fibroblastos en la piel y ciertas células epiteliales de proliferación intestinal expresan plexin D1 (no mostrado). EJEMPLO 9 Manchado de macrófagos en enfermedades inflamatorias Para revisar en forma adicional la implicación de plexin D1 en enfermedades con implicación de macrófagos prominente, se llevaron a cabo manchados inmunohistoquímicos en placas ateroescleróticas, de esclerosis múltiple y artritis reumatoide. Los macrófagos expresan plexin D1.

EJEMPLO 10 Acceso a plexin D1 en vasos de tumor mediante invección intravenosa La expresión de proteína plexin D1 en vasos sanguíneos de tumor, sugiere que plexin D1 es accesible a través de inyección intravenosa. Para probar esto, se inyectaron en forma microquirúrgica en la arteria carótida interna derecha de ratones desprotegidos BALB/C, células Me157 transfectadas en forma estable 2x105 que expresan la isoforma VEGF-A16s. Después de 18 días, cuando los animales mostraron síntomas neurológicos (Kusters y asociados, (2003) supra). se inyectaron fagos de enlace-1012 PLXND1 de los clones A12, F8 o fagos no relevantes en la vena de la cola de ratones desprotegidos, llevando metástasis de cerebro Me157- VEGF-A165 establecidas (n = 2 para A12, n=4 para F8, n = 3 para fago de control). En otros dos grupos de ratones, inyectamos en forma intravenosa 30 µg de sdab F8 o un sdab de control (n = 2 para cada grupo). Después de 5 minutos, los ratones fueron anestesiados utilizando isoflurano, los pechos fueron abiertos, y los fagos no enlazados se lavaron del sistema mediante propulsión cardíaca con 15 mi de solución salina regulada con fosfato (PBS). Posteriormente, los ratones se sacrificaron mediante dislocación cervical, y las partes de los cerebros, corazones, pulmones, hígados, vasos y ríñones fueron congeladas a presión en nitrógeno líquido.

Se fijaron otras partes en formalina para ser incrustadas en parafina. Después de un manchado de hematoxilina corto, los tumores se diseccionaron de secciones de cerebro de 10 µ? utilizando microscopía de disección de captura láser (microscopio de disección láser Leica). Las áreas equivalentes fueron diseccionadas de cerebro no afectado, contralateral al tumor. En forma subsecuente, los fagos fueron eluídos de las muestras de tejido diseccionado utilizando el tratamiento de tripsina y se utilizaron para infectar células TG1. Los números de fagos que forman colonias se contaron y utilizaron con una medida de alojamiento de tumor. Para evaluar en forma cuantitativa el alojamiento de tumor mediante fagos o sdabs, se mancharon secciones de 4 µ??, en serie con las secciones utilizadas para la disección láser, con anticuerpo anti-M13 p8 (Abcam Limited, Cambridge, UK) para detectar los fagos enlazados, o anticuerpos anti-VSV-G, (Sigma-Aldrich) para detectar anticuerpos de dominio simple. La inyección intravenosa de fagos M13 que muestra anticuerpo de dominio simple an\\-PLXND1 F8, pero no fagos que llevan anticuerpos de dominio simple irrelevante, en ratones que llevan lesiones de melanoma angiogénico dio como resultado la acumulación de fagos en vasos de tumor pero no la presencia detectable específica de fagos en vasos de cerebro normales, ni vasos sanguíneos en hígado, vaso, riñón (figura 12A, D y no mostrada). Esto indica que plexin D1 expresa en el lado luminal de la célula endotelial específicamente en vasos sanguíneos de tumor y por lo tanto se puede utilizar como un marcador dirigible. La inyección del anticuerpo de dominio simple purificado parcialmente, condujo de manera correspondiente a una localización de tumor preferencial (figura 12C). En la última situación, se debe considerar que el peso molecular pequeño de 20 kDa de los anticuerpos de dominio simple permite la extravasación de los vasos de tumor altamente permeables y la acumulación en el intersticio del tumor. Este último efecto es no específico y también se observa con anticuerpos de dominio simple no relevantes. Se considera que los anticuerpos de peso molecular pequeño y afinidades relativamente bajas tienen mayor capacidad de penetración a través de los tumores y son más adecuados para dirigirse al compartimento de la célula de tumor. EJEMPLO 11 Acumulación de F8 en vasos sanguíneos de tumor Los ratones se inyectaron en forma transcraneal con E98, una línea de xenoinjerto de glioma. Se mantuvieron tumores E98 como tumores subcutáneos. Un ratón atímíco Balbc/c nu/nu que lleva un tumor E98 subcutáneo, se exterminó y el tumor se eliminó. El tumor picado trocitos con un bisturí estéril y el homogenado se pasó a través de un filtro de nylon de malla estéril de 70 µ??. Se inyectaron en forma transcraneal en el cerebro del ratón desprotegido, veinte µ? de la suspensión celular resultante, que contiene 150,000 células. Después de 3 semanas, se inyectaron en forma intravenosa fagos M13 que despliega anticuerpo de dominio simple F8, y después de cinco minutos los ratones se sometieron a perfusión cardíaca con 15 mi de solución salina regulada por fosfato. Los ratones se exterminaron, los cerebros se eliminaron y se fijaron en formalina. Se sometieron secciones de cuatro µ?? a inmunohistoquímica con anticuerpo anti-M13, y las secciones en serie se mancharon en forma inmunohistoquímica con anticuerpos contra CD34 (marcador endotelial) y glut-1 (un marcador para las células endoteliales de cerebro preexistentes (Kusters, B y asociados, Cáncer Res 62: 341-345 (2002)). Los fagos que llevan anticuerpos de dominio simple anti-plexin D1 se acumularon en forma específica en vasos sanguíneos asociados con tumor, pero no en vasos normales (figura 13). De manera importante, los fagos también se acumularon en vasos sanguíneos de tumor que fueron positivos en glut-1, y los cuales por consiguiente se pueden considerar como vasos sanguíneos pre-existentes, en lugar de vasos sanguíneos formados recientemente. Esto indica que no únicamente los vasos sanguíneos angiogénicos están sometidos a dirección con anticuerpos anti-plexin D1, sino también no angiogénicos, vasos sanguíneos aún activados en tumores. EJEMPLO 12 Ectodominios plexin D1 recombinantes inhiben a angiogénesis Se transfectaron células Me157 de melanoma humano con la secuencia de codificación VEGF-A16s en pIREShyg de vector. Las células transfectadas en forma estable se seleccionaron cultivando en 200 µg/ml de higromicina en medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de becerro fetal 10% (FCS) y penicilina/estreptomicina. Debido a que la expresión del gen de resistencia a hidromicina está enlazada al de cADN VEGF-A a través del sitio de entrada ribosomal interno (IRES), todas las células resistentes a hidromicina producirán también la proteína VEGF-A. Las células Me157- VEGF transfectadas en forma estable fueron tansfectadas subsecuentemente con pIRESneo-PlexinDI ED. El vector que contiene el cADN que codifica el dominio extracelular de los nucleótidos 1-2745, se enlazó a través de IRES para la expresión del gen de resistencia a neomicina. Se inyectaron transfectantes dobles en la arteria carótida derecha de ratones desprotegidos, y los tumores se fijaron. En el surgimiento de los síntomas neurológicos (aproximadamente 18 días) los ratones se sometieron a negación de imágenes de resonancia magnética mejorada con Gadolinio-DTPA. En forma subsecuente, los ratones se sacrificaron, los cerebros se fijaron en formalina y se sometieron a manchados inmunohistoquímicos para examinar la vasculatura del tumor. Cuando se compararon con los controles, que consisten de tumores que expresan únicamente VEGF-A, la mejoría Gd-DTPA en generación de imagen de resonancia magnética ponderada-T-1 (MRI) o menor (comparar figura 14A, que representa dos ejemplos de tumores Me157- VEGF-A165, con 14B que representa dos ejemplos de tumores VEGF-A165/PLEXIND1 -ED. En los tumores que expresan VEGF-A165 y ectodominio Plexin D1, las vasculaturas mostraron activación del marcador endotelial CD34, (un sello inconfundible de la activación endotelial mediante VEGF-A165). La vasculatura en tumores que expresan únicamente VEGF-A165, es negativa para el marcador de célula endotelial de cerebro glut-1, lo cual es consistente con el hecho de que estos vasos son recientemente elaborados y por consiguiente carecen de marcadores específicos de célula endotelial-cerebro. Tal como se puede apreciar en la figura 12B, los vasos que están asociados con tumores que expresan también ectodominio plexin D1, expresan glut-1. Esta es una fuerte indicación de que estos vasos son realmente pre-existentes. Por lo tanto, el ectodominio plexin D1 no previene la activación de células endoteliales mediante VEGF-A165, sino que previene la formación de neovasculatura. EJEMPLO 13 Anticuerpos de alta afinidad contra plexin D1 Una secuencia de proteína, que corresponde a los aminoácidos 47-506 (los 459 aminoácidos de terminal amino de la mayoría de la proteína madura) se expresó en células E. coli M15 pREP4, utilizando el vector de expresión pQE16 (Qiagen). La proteína recombinante, la cual se produjo en la célula bacteriana como cuerpos de inclusión, se disolvió en regulador de desnaturalización, que contiene urea 4M y ditiotreitol 1 mM (DTT) y posteriormente se dializó gradualmente contra PBS. La proteína se utilizó para inmunizar ratones BALB c/c 25, de acuerdo con procedimientos estándar. La figura 15 muestra las características del suero de ratón. Tal como se muestra en la figura 15B, el suero inmune de ratón reconoció en forma específica la proteína recombinante E. coli 47-506 (52 kDa, columna 1), y una segunda secuencia plexin D1 recombinante de 18 kDa, que comprende aminoácidos 225-388 (por lo tanto descansando completamente dentro de la secuencia que fue utilizada para inmunización, columna 2). El suero pre-inmune no mostró reactividad (panel A). Cuando se probó en manchados inmunohistoquímicos en metástasis de cerebro de un sarcoma de tejido suave alveolar, el suero inmune de ratón (panel D), pero no el suero pre-inmune (panel C), mostró positividad hacia vasos sanguíneos y células de tumor, un patrón de machado que fue similar al del anticuerpo de dominio simple A12. Por lo tanto, los B-linfocitos de estos ratones fueron considerados adecuados para generar hibridomas de B-linfocitos de vaso con línea celular de mieloma SP2/0. A partir de estos hibridomas, se seleccionó un número de líneas celulares que producen anticuerpos con base en reactividad contra proteína 47-506 en ELISA, y se analizaron con respecto a su potencial para detectar plexin D1 en secciones congeladas de tumores humanos. De estos, 11F5H6 y 17E9C12, ambos anticuerpos del subtipo IgM, mostraron fuerte positividad en metástasis de cerebro de sarcoma y melanoma, tal como se muestra en la figura 16. Los insertos en el panel C-F representan manchados de control en los cuales se omitió el anticuerpo primario. Los paneles A y B muestran que estos anticuerpos no reconocen notablemente las estructuras de vasos en tejido de cerebro normal. EJEMPLO 14 Anticuerpo monoclonal 11F5H6 que tiene la capacidad de reconocer vasos sanguíneos de tumor Para evaluar en forma adicional si el anticuerpo monoclonal 11F5H6 tiene la capacidad de reconocer vasos sanguíneos de tumor, se crecieron tumores Me157-VEGF-A angiogénicos en cerebros de ratones desprotegidos, esencialmente como se describe en el Ejemplo 10. El anticuerpo 11F5H6 (1 mg) se inyectó en la vena de la cola lateral y se dejó circular durante 15 minutos. Después de este período, los ratones se anestesiaron con 1.3% de isoflurano y el pecho se abrió, momento en el cual se llevó a cabo una perfusión cardíaca con 20 mi de solución salina regulada con fosfato. Después de este procedimiento los ratones se decapitaron, y los cerebros se eliminaron y se congelaron a presión y se fijaron en formalina. Las secciones congeladas de 4 µG? se mancharon con anticuerpo anti-lgM. En la figura 17A se muestra que el anticuerpo 11F5H6 se aloja y acumula en vasos de tumor pero no en vasos normales (comparar manchado anti-lgM en la figura 17A con el manchado CD31 anti-endotelial en la figura 17B). Dicho manchado no se observa cuando se lleva a cabo el manchado anti-lgM en ratones no inyectados. Por lo tanto, 11F5H6 es un anticuerpo prometedor que permite la dirección de tumor. EJEMPLO 15 Expresión de plexin D1 en artritis reumatoide Se expresó plexin D1 en macrófagos en modelos de ratón de artritis reumatoide (figura 18). Un subgrupo de macrófagos en placas ateroescleróticas humanas también expresa plexin D1 (figura 19). Los manchados se llevaron a cabo con anticuerpo de dominio simple A12. En la figura 19, se llevó a cabo un manchado doble, desplegando plexin D1 en rojo y el marcador de macrófago CD68 en azul. El color púrpura indica la coexpresión.

S EC U E N C IAS A 12 (SEQ ID NO: 1) : ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGAAGCAGTATCAGTATCAATAACTGGGGCTGGTACCGC CAGGCTCCAGGAAAACAGCGCGAGCGGGTCGCAGCTATATCTGGTGGTGGTAAAACAGTC TATGCGGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTG TATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGATACGGCCGTCTATTACTGTAGAGCAGTC CGGAAAAGTACGGGTTGGCTTAGGGGGCTTGACGTCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACC GTCTCCGCAGAACCCAAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCACCATCAT CACCATCATTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA MAQVQLQESGGGLVQPGGSL RLSCAASGSSISINNWGWYR QAPGKQRERVAAISGGGKTV YADSVKGRFTISRDNAKNTV YLQMNSLKPEDTAVYYCRAV RKSTGWLRGLDVWGQGTQVT VSAEPKTPKPQPAAAHHHHH HHHYTDIEMNRLGKGAA@ F8 (SEQ ID NO:2) : ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCC ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGAGACTCTCTG AGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGACGCACCTTCAGTACTTTGATTATGGCCTGGTTCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGAGCGTGAATTTGTAGCGGCGATTAGCCGGGGTGGCGGTAGCACA AGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACGCG GTGTATCTACAAATGAACAGCCTGAAACCTGATGACACGGCCGTCTATTACTGTAATGCC CGGTACGGTAGCCGAATTTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCC AAGACACCAAAACCACAACCAGCGGCCGCACATCATCACCATCATCACCATCATTATACA GACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGGGGGCCGCATAG MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA MAQVQLQESGGGLVQAGDSL RLSCAASGRTFSTLIMAWFR QAPGKEREFVAAISRGGGST SYADSVKGRFTISRDNSKNA VYLQMNSLKPDDTAVYYCNA RYGSRIY GQGTQVTVSSEP KTPKPQPAAAHHHHHHHHYT DIEMNRLGKGAA6 Secuencia anticuerpo de cadena simple, derivado de anticuerpo 1 1 F5H6 (S E Q I D N O : 3) MKYLLPTAAAGLLLLAAQPA ADYKDIV TQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNT YLE YLQKPGQSPKLLIYKVFNRLSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGS HVPLTFGAGTKLELKRGGGGSGGGGSGGGGRAPGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCK ASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELL SLTSEDSAVYYCARAITTDGWFAYWGQGTLVTVSAAAAHHHHHHHHYTDIEMNRLGKGAA Secuencia anticuerpo de cadena simple, derivado de anticuerpo 1 7E9 C 12 (S EQ I D N O : 4) MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMADYKDIQMTQTPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSVLYSSNQK NYLA YQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCHQY LSSWTFGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVKPGASVKLSCTAS GFNIKDTYMHWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYDPKFQG ATITADTSS TAYLQLSSL TSEDTAVYYCAMDY GQGTSVTVSSAAAHHHHHHHHYTDIEMNRLGKGAA Tabla 1 Expresión PLXND1 en tejidos humanos Tabla 2 Expresión PLXND1 en series de progreso de melanoma

Claims

REIVINDICACIONES 1. Plexin D1 para utilizarse como una proteína dirigible en el tratamiento o diagnóstico de trastornos que implican la expresión de plexin D1.
2. Plexin D1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el diagnóstico se lleva a cabo detectando la presencia de plexin D1 en el cuerpo o un tejido o fluido corporal.
3. Plexin D1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento se lleva a cabo dirigiendo plexin D1 para el suministro de terapéuticos al sitio en donde se necesita el tratamiento.
4. Plexin D1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento se lleva a cabo interfiriendo en la interacción de plexin D1 y sus ligandos.
5. Plexin D1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento se lleva a cabo interfiriendo en la función de plexin D1.
6. Plexin D1 tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento se lleva a cabo interfiriendo en la expresión del gen que codifica plexin D1.
7. El uso de moléculas que enlazan plexin D1, un ácido nucleico que codifica plexin D1 o un ligando de plexin D1 para la preparación de una composición terapéutica para el tratamiento o diagnóstico de trastornos que implican la expresión de plexin D1.
8. El uso tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque los trastornos comprenden trastornos en los cuales plexin D1 se expresa en células de tumor, vasos sanguíneos de tumor o macrófagos activados.
9. El uso tal como se describe en la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque los trastornos son seleccionados de tumores de cerebro, en particular astrocitomas, oligodendrogliomas y hemagioblastomas, carcinomas de colon, en particular carcinomas ductales del colon, carcinomas de próstata, carcinomas de célula renal, en particular carcinomas de célula clara renal, carcinomas de mama, en particular carcinomas ductales del seno, carcinomas de ovario, carcinomas de célula escamosa, melanomas, carcinomas de pulmón, en particular carcinomas de pulmón de célula pequeña y carcinomas de pulmón de célula no pequeña, sarcomas de tejido suave.
10. El uso tal como se describe en la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque los trastornos son trastornos inflamatorios.
11. El uso tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque el trastorno inflamatorio es una enfermedad autoinmune.
12. El uso tal como se describe en la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.
13. El uso tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque la enfermedad inflamatoria es ateroesclerosis o esclerosis múltiple.
14. El uso tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque las moléculas que enlazan plexin D1 son seleccionadas de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, dominios de proteína, péptidos, moléculas pequeñas, ADN o aptameros ARN.
15. El uso tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque las moléculas que enlazan al ácido nucleico que codifica plexin D1, son seleccionadas de siARN, ARN antisentido, oligonucleótidos de fosfotio de antisentido.
16. El uso tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque las moléculas que enlazan un ligando plexin D1 son seleccionadas de anticuerpos contra el ligando, el ectodominio soluble de plexin D1, péptidos con afinidad para el sitio de enlace plexin D1.
17. El uso tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 16, caracterizado porque la molécula de enlace está etiquetada con un marcador detectable.
18. El uso tal como se describe en la reivindicación 12, caracterizado porque el marcador detectable es seleccionado de una etiqueta radioactiva, una etiqueta paramagnética, una etiqueta fluorescente, una etiqueta quimioluminiscente.
19. El uso tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 7 a la 18, caracterizado porque la molécula de enlace se abastece con un compuesto efector o un nanoaparato que comprende un compuesto efector.
20. El uso tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque el compuesto efector es una toxina, un compuesto que induce trombosis, un agente quimioterapéutico, una porción radioactiva, un péptido que induce apoptosis, en particular (KLAKLAK)2.
21. El uso tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque la toxina daña o extermina células endoteliales para inducir trombosis, y en particular es ricina.
22. El uso tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el compuesto que induce trombosis es factor de tejido truncado.
23. El uso tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque el agente quimioterapéutico es seleccionado de doxorubicin, cisplatin, sulfato de bleomicin, carmustina, clorambucil e hidroxiurea de ciclofosfamida.
24. El uso tal como se describe en la reivindicación 20, caracterizado porque la entidad radioactiva es seleccionada de: tecnetio 99m, yodo-123, yodo-131, renio-186 ó -188, galio-67, itrio-90, lutetio-177.
25. El uso tal como se describe en la reivindicación 19, caracterizado porque los nanoaparatos son liposomas, poli'mersomas, en particular polimersomas compuestos de copolímeros de bloque.
26. Moléculas que enlazan plexin D1.
27. Moléculas que enlazan plexin D1 tal como se describe en la reivindicación 26, caracterizadas porque comprenden la parte de enlace plexin D1 de A12 (SEQ ID NO:1), F8 (SEQ ID NO:2), 11F5H6 (SEQ ID NO:3) o 17E9C12 (SEQ ID NO:4). 29. Las moléculas de enlace de plexin tal como se describe en la reivindicación 26 ó 27, acopladas a un marcador detectable tal como se describe en la reivindicación 18. 30. Las moléculas de enlace de plexin tal como se describe en la reivindicación 26 ó 27, acopladas a una molécula efectora o un nanoaparato que comprende un compuesto efector, en donde el compuesto efector es tal como se define en cualesquiera de las reivindicaciones de la 20 a la 24. 31. Las moléculas de enlace de plexin tal como se describe en la reivindicación 26 ó 27, caracterizado porque el nanoaparato es tal como se define en la reivindicación 25. 32. Una composición de diagnóstico que comprende una molécula de enlace plexin tal como se describe en la reivindicación 29. 33. Una composición terapéutica que comprende una molécula de enlace plexin tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 30 a la 32. 34. El anticuerpo de cadena simple A12 (SEQ ID NO:1). 35. El anticuerpo de cadena simple F8 (SEQ ID NO:2). 36. El anticuerpo de cadena simple 11F5H6 (SEQ ID NO:3). 37. El anticuerpo de cadena simple 17E9C12 (SEQ ID NO:4). 38. Un método para identificar moléculas que tiene la capacidad de enlazar a plexin D1, en donde el método comprende contactar una recolección de moléculas con plexin D1 y seleccionar las moléculas de la recolección que muestran enlace a plexin D1, en la forma de moléculas de enlace plexin D1.